Brainbow
Brainbow-teknikkerne er afhængige af Cre-Lox-rekombination, hvor proteinet Cre-rekombinase driver inversion eller excision af DNA mellem loxP-steder. Den oprindelige Brainbow-metode omfatter både Brainbow-1 og Brainbow-2, som udnytter forskellige former for cre/lox-rekombination. Brainbow-3, en modificeret version af Brainbow-1, blev udviklet i 2013. For alle Brainbow-subtyper er ekspressionen af et givet XFP en stokastisk eller tilfældig begivenhed.
Brainbow-1 anvender DNA-konstruktioner med forskellige fluorescerende proteingener (XFP’er), der er adskilt af muterede og kanoniske former af loxP. Dette skaber et sæt af gensidigt eksklusive excisionsmuligheder, da cre-medieret rekombination kun finder sted mellem identiske loxP-steder. Efter at rekombinationen er sket, udtrykkes det fluorescerende protein, der er tilbage direkte efter promotoren, entydigt. Således kan et konstrukt med fire XFP’er adskilt af tre forskellige loxP-steder, tre excisionsbegivenheder og det oprindelige konstrukt producere fire forskellige fluorescerende proteiner.
Brainbow-2 anvender Cre excision og inversion for at muliggøre flere udtryksmuligheder i et givet konstrukt. I et DNA-segment med to modsat orienterede XFP’er vil Cre fremkalde en tilfældig inversionshændelse, der efterlader det ene fluorescerende protein i den rette orientering til ekspression. Hvis to af disse inverterbare sekvenser er på linje, er der mulighed for tre forskellige inversionshændelser. Når excisionsbegivenheder også tages i betragtning, vil et af fire fluorescerende proteiner blive udtrykt for en given kombination af Cre-excisioner og inversioner.
Brainbow-3 beholder Brainbow-1 loxP-formatet, men erstatter RFP-, YFP- og CFP-generne med mOrange2, EGFP og mKate2. mO2, EGFP og mK2 blev valgt både fordi deres fluorescerende excitations- og emissionsspektre overlapper hinanden minimalt, og fordi de deler minimal sekvenshomologi, hvilket gør det muligt at designe selektive antistoffer, der kan bruges til at påvise dem i immunhistokemiske protokoller. Brainbow-3 løser også problemet med ujævn fyldning af neuroner med XFP’er ved at anvende farnesylerede derivater af XFP’erne, som er mere jævnt traffikeret til neuronale membraner.
Brainbow gennemføres in vivo ved at krydse to transgene organismsstammer: en, der udtrykker Cre-proteinet, og en anden, der er blevet transficeret med flere versioner af et loxP/XFP-konstrukt. Ved at anvende flere kopier af transgenet kan XFP’erne kombineres på en måde, der kan give en af ca. 100 forskellige farver. Således er hvert neuron mærket med en anden nuance baseret på dets givne kombinatoriske og stokastiske udtryk af fluorescerende proteiner.
For at belyse differentielle XFP-ekspressionsmønstre i en synlig form, afbildes hjerneskiver med konfokal mikroskopi. Når de udsættes for en foton med deres særlige excitationsbølgelængde, udsender hver fluorofore et signal, som opsamles i en rød, grøn eller blå kanal, og den resulterende lyskombination analyseres med dataanalysesoftware. Overlejring af differentielt farvede neuroner giver mulighed for visuel opløsning af komplicerede neurale kredsløb.
Brainbow er hidtil overvejende blevet testet på mus; den grundlæggende teknik, der er beskrevet ovenfor, er dog også blevet modificeret til brug i nyere undersøgelser siden fremkomsten af den oprindelige metode, der blev introduceret i 2007.
MiceEdit
Musehjernen har 75.000.000 neuroner og ligner mere en menneskehjerne end drosophila og andre almindeligt anvendte organismer til at modellere denne teknik, såsom C. elegans. Mus var de første organismer, hvor Brainbow-metoden til neuroimaging blev anvendt med succes. Livet et al. (2007) udviklede to versioner af Brainbow-mus ved hjælp af Brainbow-1 og Brainbow-2, som er beskrevet ovenfor. Ved anvendelse af disse metoder til at skabe et fuldstændigt kort og spore axonerne i en musemuskel i musen er det nødvendigt at indsamle titusindvis af billeder og samle dem i stakke for at skabe et fuldstændigt skematisk billede. Det er derefter muligt at spore hvert motorisk axon og dets synaptiske kontakter for at konstruere et komplet connectom af musklen.
Mere eksempler på neuroner, der er undersøgt ved hjælp af Brainbow-teknikken i transgene mus, er placeret i den motoriske nerve, der innerverer øremuskler, axonbaner i hjernestammen og hippocampus’ dentate gyrus.
DrosophilaRediger
Drosophilahjernens kompleksitet, der består af omkring 100.000 neuroner, gør den til en fremragende kandidat til at implementere neurofysiologiske og neurovidenskabelige teknikker som Brainbow. Faktisk kombinerede Stefanie Hampel et al. (2011) Brainbow i forbindelse med genetiske målretningsværktøjer til at identificere individuelle neuroner i Drosophila-hjernen og forskellige neuronale lineager. Et af de genetiske målretningsværktøjer var et binært GAL4/UAS-ekspressionssystem, der kontrollerer ekspressionen af UAS-Brainbow og målretter ekspressionen mod små grupper af neuroner. Anvendelse af “Flip Out”-metoder øgede den cellulære opløsning af reporterkonstruktionen. Ekspressionen af fluorescerende proteiner var ligesom med den oprindelige Brainbow afhængig af Cre-rekombination svarende til matchende lox-steder. Hampel et al. (2011) udviklede også deres egen variant af Brainbow (dBrainbow), der er baseret på antistofmærkning af epitoper i stedet for endogen fluorescens. To kopier af deres konstrukt giver seks lyse, separerbare farver. Dette, sammen med forenklinger i farvetildelingen, gjorde det muligt for dem at observere de enkelte neuroners baner over lange afstande. Specifikt sporede de motoriske neuroner fra antennelappen til neuromuskulære kryds, hvilket gjorde det muligt for dem at identificere de enkelte neuroners specifikke muskelmål.
I sidste ende giver denne teknik mulighed for effektivt at kortlægge det neuronale kredsløb i Drosophila, så forskerne er i stand til at afdække flere oplysninger om hjernestrukturen hos dette hvirvelløse dyr, og hvordan den hænger sammen med den deraf følgende adfærd.