Cellulære systemer for epithelial invagination

Epithelial invagination som en multicellulær mekanisme

I dyrs udvikling fra de allertidligste blastocyster eller blastodermstadier og helt frem til de allersidste stadier af organogenese organiserer embryoner sig selv i epithellag. Epithelium er bredt defineret. Det kan være en plade af kuboide, søjleformede eller pladeformede (fladtrykte) celler eller indeholde en blanding af celleformer af varierende højde for at give udseende af flere lag (pseudostratificering), eller endda bestå af en af de ovennævnte i flere lag og være virkelig stratificeret. For alle stadier og alle epitheltyper afhænger anatomiens udformning imidlertid af epiteliernes evne til selv at bøje sig i folder, kamme, gruber og rør. Som en byggesten i morfogenese skaber epitelbøjning næsten alle organer, lige fra det primitive tarmrør, der danner den primære kropsakse under gastrulation, til de fineste porer, som er hårsækkene på huden. Epitelbøjning er naturligvis en multicellulær proces, hvor flere forbundne celler koordinerer deres adfærd for at ændre vævets form. Med andre ord er epitelbøjning en emergent egenskab ved et system af celler, hvis handlinger ikke kan beskrives på lavere niveauer: gennetværk og klassisk (hovedsagelig subcellulær) cellebiologi kan ikke fuldt ud indfange den epiteliale bøjningsproces. Det er bemærkelsesværdigt, at selv om det er en meget udbredt proces, er vores detaljerede beskrivelser og mekanistiske forståelse af epithelial bøjning begrænset til ret få tilfælde og typer.

Aspekter af epithelial bøjning, der fører til både invagination (foldning indad) og evagination (foldning udad) er tidligere blevet gennemgået . Denne gennemgang fokuserer på bøjning, der resulterer i invagination af epitelet, ud fra et synspunkt om cellulær adfærd. Vi starter vores oversigt fra den forholdsvis velbeskrevne apikale indsnævring, via apikal kabeldrevet buckling, celleforkortning ved andre mekanismer og basal kilning, til apikal/basal bunching og vertikal teleskopering til den relativt nye og lidet karakteriserede suprabasale interkalation. Denne rækkefølge afspejler hierarkiet af epitelkompleksitet fra et monolag til en pseudostratificeret og endelig stratificeret struktur. Den afspejler også et hierarki af kompleksitet i de involverede cellulære processer.

Apikal indsnævring

Apikal indsnævring er defineret som en mekanisme, hvor epitelceller gennemgår en apikal skrumpning, mens de bevarer et mere eller mindre konstant volumen . Der er for nylig blevet offentliggjort flere gode oversigter om apikal indsnævring, og læseren henvises til disse for en omfattende analyse. Her vil vi skitsere nogle fremtrædende træk.

Første todimensionelle fysiske modeller lavet med stålstænger og gummislanger viste, at differentiel spænding mellem epitelcellernes apikale og basale overflader ville føre til bøjede epitelier, forudsat at cellevolumen og højde blev opretholdt . Desuden viste tidlige observationer af epitelbøjning på tværs af en række organer og organismer, at cellerne i det bøjede væv, der er kileformet, har et overfladisk gelelag på den konkave side af krumningen . Det blev senere opdaget, at dette sammentrækkende gelelag består af aktinfilamenter , der i samarbejde med motorproteinet myosin II virker for at bøje epitelet (figur 1). Apikal actomyosinberigelse og kontraktilitet er blevet definerende kendetegn for apikal forsnævring . Reguleringen af actomyosin-cytoskelettet er kompleks, men blandt de mange regulatorer fremmes rekrutteringen af dette kontraktile maskineri især af Rock og Shroom . Yderligere undersøgelser har vist, at mens Shroom både er nødvendig og tilstrækkelig til den apikale fordeling af det aktomyosinkontraktile netværk, fungerer andre molekyler meget ofte ved at placere forskellige komponenter af maskineriet på det rette sted. F.eks. er Rho GTPase og p120 catenin nødvendige for at lokalisere myosin II apikalt i cellen. BMP, der virker opstrøms for Rock i kyllingens otic placode (neuroepithelial) invagination, synes at være påkrævet for apikal lokalisering af actin uafhængigt af en rolle i celletypespecifikation .

Live imaging af invaginerende væv har givet et stadig mere sofistikeret billede af, hvordan den apikale indsnævring finder sted. For eksempel blev det længe antaget, at cellerne gennemgår apikal indsnævring ved en snor-lignende sammentrækning af aktinfibre omkring omkredsen af den apikale overflade. Live-billeddannelse i Drosophila gastrulation afslørede, at i stedet for omkredsende fibre spiller et apikalt netværk af diametriske fibre faktisk den dominerende rolle i indsnævringen af det apikale område (selv om der i øjeblikket ikke foreligger tilsvarende beviser hos hvirveldyr). Sammentrækningsprocessen er også mindre simpel end tidligere antaget. I stedet for en jævn og synkron sammentrækning er det for nylig blevet påvist, at de enkelte celler gennemgår forbigående impulser af ratchet-lignende sammentrækning asynkront med deres naboer . Efter at sammentrækningerne er indledt, stabiliseres den sammentrukne tilstand mellem pulserne, således at nettoresultatet er et fald i arealet af cellens apikale ende . Spændingen fra disse individuelle sammentrækninger overføres sandsynligvis apikobasalt ved cytoplasmatisk forskydning, i det mindste som det ses i Drosophila mesoderm ; samtidig overføres spændingen i vævsplanet via actomyosinnetværket, som er samlet i de enkelte celler og forbundet intercellulært ved adherens-knudepunkter , for at bøje hele vævet.

Basal afslapning

Hvis cellevolumen skal bevares, skal apikal indsnævring ledsages af enten basal ekspansion eller højdeforøgelse (eller begge dele). Højdeforøgelse er blevet observeret i tracheal- og spytkirtelplacode før invagination i flueembryoner , og det, vi her kalder “basal afslapning”, hvor det basale actin- eller myosinnetværk aktivt nedbrydes (figur 2), er blevet rapporteret som værende involveret i invaginationen af kyllingens otiske placode og Drosophila ventral furredannelse i gastrulation . I kyllingens otiske vesikel går basal afslapning forud for den apikale indsnævring og afhænger af basalt præsenterede FGF-signaler , og synes således ikke nødvendigvis at være koblet til apikale begivenheder, herunder den efterfølgende indsnævring. I Drosophila gastrulation ledsages imidlertid reduktionen af basal myosinintensitet og dermed basal stivhed af apikal indsnævring og udvider den basale overflade, en fase, der meget sandsynligt indleder overgangen fra cellekolumnisering til celleforkortning og invagination . En nylig artikel af Lomakin et al. har foreslået, at actomyosinakkumulering i en del af en celle under migration forårsager udtømning i en anden del af en celle under migration. Dette kunne være en måde, hvorpå basal afslapning kunne udløse eller være nødvendig for den efterfølgende apikale indsnævring under invagination. Upubliceret computermodellering af epithelfoldning i vingeskiveepitel har antydet, at basal afslapning i den sammenhæng faktisk kan være mekanisk vigtigere end apikal indsnævring (Guillaume Salbreux 2016, personlig kommunikation).

Apisk kabel-drevet buckling

I en række sammenhænge koordineres flere cellers kontraktilitet via actomyosin ‘kabler’ . Aktomyosinkabler er supracellulære strukturer, der findes i de enkelte celler, og som er placeret mellem tilstødende celler og sandsynligvis er forbundet via specifikke krydsninger, selv om det stadig er ukendt, hvordan de er forbundet på molekylært niveau. Disse supracellulære strukturer er blevet observeret ikke kun under invagination , men også i andre processer , for at koordinere sammentrækning.

Et eksempel på actomyosinkabel-drevet invagination er høns neuralrørs lukning, hvor mediolateralt orienterede myosinkabler løber flere cellelængder og fremmer celleinterkalation mediolateralt for både at forlænge neuralrøret (konvergent forlængelse) og bøje neuroepithelet mediolateralt . Denne planar-polariserede sammentrækning af actomyosinkabler fremmes af PCP-signalering opstrøms og også polariseret fordeling af Celsr1 og ROCK .

Epitelet i Drosophila under udvikling bruger indsnævring kombineret med celleomlægning og celleafrunding til at opnå invagination af flere trachealhuller, som senere vil danne trachealnetværket, hvorigennem ilt diffunderer mod fluevævet . Inden invaginationen påbegyndes, går cellerne i placode ind i mitotisk hvile . Der dannes kortvarigt korte cirkumferentielt justerede buer af actomyosinkabler, idet grupper af få celler interkalerer (ligeledes cirkumferentielt) omkring den dannede grube . Dette efterfølges af en stærk apikal indsnævring af cellerne i placodeens centrum og mindre stramt indsnævrede apicer i de umiddelbart omkringliggende celler, hvorved der dannes en lav tracheal grube . De invaginerende celler i midten gennemgår mitotisk celleafrunding, som fremskynder processen ved at forårsage et hurtigt fald i cellehøjden, hvorved invagineringen afsluttes i en hurtig fase . Det blev vist, at det er afrundingen af de mitotiske celler, men ikke celledelingen, der driver den hurtige fase af invaginationen. Man kan spekulere i, at afrundede celler gør epithelet strukturelt svagere. De har et mindre stift kortikalt cytoskelet, en mindre søjleform (hvilket gør epitelet tyndere) og muligvis en svagere tilknytning til deres naboer. De kunne derfor fungere som bukkepunkter, hvor epitelet bøjer sig med mindre modstand mod den spænding, der opretholdes af de cirkumferentielle kabler i de omgivende ikke-delende celler (figur 3).

Celleforkortelse

Foldning af Drosophila-benepitelet for at lave samlinger mellem segmenter repræsenterer en anden variation af cellulær indsnævring, som i dette tilfælde er helcelleindsnævring kombineret med apoptose . Under morfogenesen af Drosophila-benepithelium er apoptose nødvendig, men ikke tilstrækkelig, for at apikal indsnævring kan finde sted , og en forholdsvis ny rapport beskriver et apikobasalt actomyosin-“kabel”, der løber lodret gennem midten af cellen ved foldningsplacode (figur 4), og som ser ud til at kunne udøve en nedadgående lodret trækkraft på nabocellernes apikale overflade . Disse vertikale “kabler” må ikke forveksles med de plane buer af actomyosinkabler, der er nævnt i § 4, og er helt nye enkeltcellestrukturer, hvis struktur og dynamik endnu ikke er blevet undersøgt. Som med mitotisk afrundede celler ville en apoptotisk celle formodentlig være strukturelt svagere end sine ikke-apoptotiske naboer og derfor kunne fungere som et knækpunkt; det apikobasale “kabel” antyder imidlertid en mere aktiv mekanisme, ligesom det faktum, at den apoptotiske celle ikke ekstruderes. Det forekommer sandsynligt, at actomyosinkablet har en aktiv rolle at spille i den apoptosedrevne buckling.

Celleforkortelse er også blevet observeret i andre tilfælde af epithelial invagination. I ascidiernes gastrulation viste Sherrard et al., at apikal indsnævring af de endodermale celler faktisk ikke driver invaginationsprocessen; snarere fører en basolateral ophobning af myosin til apikobasal afkortning af cellerne og initierer invaginationen. En anden mekanisme er, at dorsalfoldninger i det tidlige Drosophila-embryo ved gastrulationens begyndelse initieres af en basal forskydning af adherens-knudepunkterne i de invaginerende celler, hvilket fører til en uoverensstemmelse i knudepunktets placering i forhold til nabocellerne, som er med til at drive vævsbukningen. Selv om det er blevet påvist, at positionerne af de adherens junctions reguleres af polaritetsproteinerne Par1 og Bazooka, er den fysiske mekanisme endnu ikke undersøgt.

Basal kilning

Kantformede celler i et invaginerende væv er en uundgåelig konsekvens af vævsgeometrien og er ikke nødvendigvis tegn på apikal indsnævring. Under neuralrørsudviklingen kommer en proces, der kaldes basal wedging, i spil, hvor der opstår wedging, som er helt forskellig fra apikal indsnævring. Ved midterlinjen af en stor del af det dannende amniote neuralrør bøjer epitelet skarpt for at danne det, der er kendt som det mediane hængselspunkt (MHP) . Cellerne i disse led er næsten alle kileformede, mens deres naboer har en blanding af forskellige former, for det meste spindelformede, hvilket afspejler epitelets pseudostratificerede natur (figur 5). Det er vigtigt, at cellerne er meget tæt pakket i epithelets plan og er så smalle, at hver celle buler ud omkring sin kerne. Kileformen hos hængselpunktscellerne er i det mindste i det væsentlige et resultat af basalt placerede kerner. Dette synes at være relateret til interkinetisk kernevandring, som er kernenes apikobasale bevægelse, efterhånden som cellecyklusen skrider frem: cellerne deler sig apikalt, og når de er i S-fase, befinder kernen sig basalt, og i overensstemmelse hermed tilbringer cellerne ved hængslet længere tid i S-fase. Celledelingscyklussen er på samme måde blevet inddraget i den bøjelige morfogenese af den optiske kop . Det er dog stadig et åbent spørgsmål, om kontrol af cellecyklus er den nødvendige eller eneste drivkraft for den apikobasale kerneposition . Det er vigtigt, at basal kilning blev eksperimentelt adskilt fra apikal indsnævring ved at konstatere, at hæmning af aktinpolymerisation, samtidig med at det forårsager det meste af neuralrøret til at flop åbne og apikale overflader til at udvide over hele den neurale plade , undlod at afskaffe bøjning ved det mediane hængselspunkt . Dette viser også, at bøjning af det mediane hængsel er intrinsisk, da afslapningen af det flankerende epitel afkobler det mediane hængsel fra extrinsiske kræfter, og at basal kilning sker på en anden måde end apikal indsnævring.

Vertikal teleskopering og apikal/basal klynge

Intrigant nok er der i visse anteroposterior regioner af neuralrøret også dorsolaterale hængselspunkter, som hverken involverer basal kileformning eller (cytochalasin-følsom) apikal indsnævring . Selv om extrinsisk skubkraft fra den flankerende ektoderm er blevet foreslået som en bøjningsmekanisme , har nyere beviser argumenteret imod det og foreslået, at differentiel cellepakning genereret af celleproliferation og translokation i musens neuralrør fører til foldning af strukturen .

I relation hertil beskrev Jacobson, Oster et al. i 1986 i Xenopus-frøer en cellulær adfærd for neuralfoldsforhøjelse (den laterale begyndelse af neurulation), som de kaldte ‘tractoring’. Udtrykket ‘tractoring’ blev opfanget og brugt igen i forbindelse med epitelbøjning i søpindsvin gastrulation i yderligere to artikler . Det er værd at se nærmere på, hvad disse tre artikler omhandler (se næste afsnit). Desværre blev udtrykket “tractoring” også brugt i samme artikel fra 1986 til at beskrive ikke blot celleadfærd som sådan, men også en spekulativ subcellulær mekanisme, der kunne drive den. I denne spekulative brug af udtrykket “tractoring” flyder cellekortexen som et larvespor rundt om cellen for at flytte cellen i forhold til dens naboer . Det er svært at forestille sig cortical tractoring i epitelier med tætte forbindelser, som ville forhindre cortical bevægelse, og ideen er aldrig blevet fulgt op (selv om embryonale epitelier, især i pattedyrsembryoner, ofte mangler tætte forbindelser og måske har mere ustabile adhæsioner). En nyere artikel har genoplivet ideen om kortikal traktorering for isolerede celler, der vandrer i snævre rum . For at undgå forvirring vil vi helt opgive udtrykket “tractoring” (undtagen i anførselstegn, hvor disse forfattere har brugt det). I stedet tilbyder vi to nye udtryk – for der er faktisk to celleadfærd involveret – nemlig vertikal teleskopering og basal (eller apikal) bunching.

En effekt, der blev beskrevet af Jacobsen et al. som værende forekommende under bøjning af neurale plader, var, at cellerne glider lodret forbi hinanden, på samme måde som trinene på en stigende rulletrappe gør det, for at skabe en hældning eller bøjning. En anden nyttig måde at beskrive dette på er, at epitelet strækker sig nedad ved vertikal forskydning, effektivt forskydning, mellem dets celler organiseret omkring invaginationens centrum, på samme måde som et teleskop strækker sig ved at glide mellem dets sektioner (figur 6a). Vi foreslår “vertikal teleskopering” som en betegnelse for denne proces for at indfange ideen om ikke blot den vertikale “forskydning”, men også dens koncentriske placering. Det er usandsynligt, at der sker en egentlig forskydning mellem cellerne: den vertikale cellebevægelse ligner meget mere en klassisk cellevandring, hvor cellerne kravler eller ruller over faste adhæsionspunkter, og hvor bevægelsen sker ved at udvide basale eller apikale fremspring (figur 6b,c). Vi har nogle foreløbige beviser for, at vertikal teleskopering forekommer i morfogenese af tænder og spytkirtelinvagination (E. Panousopoulou, J.Li og J.B.A. Green 2016, upublicerede data). Observationerne i musens laterale neuralrør, der er nævnt ovenfor, er i overensstemmelse med denne type mekanisme, men vertikal shearlignende bevægelse mangler stadig at blive observeret direkte.

En anden mekanisme, der er blevet beskrevet med betegnelsen “tractoring”, findes i søpindsvinets gastrulation og består af apikale cellefremspring, der “slæber” sig selv centripetalt, hvilket tvinger cellerne ind i centripetale orienteringer og som følge heraf bøjer epithelet (figur 6d) . Denne proces er mest eksplicit modelleret som kontraktile apikale celleudvidelser i en anden artikel, der anvender udtrykket “tractoring” , og vi omdøber her denne proces til “apical bunching” (figur 6d), idet ordet “bunching” giver udtryk for idéen om samling (af celleapicer) ved at klemme sig sammen udefra (ved hjælp af nabocellernes apikale udposninger, der udvides lateralt). Apical bunching adskiller sig fra vertikal teleskopering ved, at bunching medfører formændring uden vertikal forskydning, mens vertikal teleskopering omvendt defineres som vertikal forskydning uden formændring. Disse definitioner er imidlertid teoretiske: i praksis kan lateral krybning af apikale fremspring på samme tid både deformere og nedtrykke naboceller (figur 6d). Apikal krumning adskiller sig også fra apikal indsnævring, fordi kraften ved krumning er extrinsisk for den deformerede celle, mens den ved indsnævring er intrinsisk.

Jacobson et al. havde også foreslået, at basale fremspring af celler i den neurale plade avancerede lateralt langs den basale lamina og nåede ind under deres naboer. En effekt af dette synes at være at komprimere disse celler lateralt ved deres baser, hvilket driver den neurale fold til at evaginere (hvilket skaber en konkav invaginationslignende bøjning i den tilstødende del af den neurale plade passivt). Dette kunne beskrives som “basal bunching” i modsætning til apikal bunching, men der er endnu ingen klare levende observationer af dette fænomen, der eksperimentelt kan bekræfte dets eksistens.

Suprabasal interkalation: bøjning af et flerlaget epitel

De fleste af ovenstående mekanismer vedrører enten monolag eller pseudostratificerede epitelier; derfor er et tilbageværende mysterium, hvordan et stratificeret epitel, som meget ofte forekommer i den tidlige organogenese, f.eks. i tandplacode, hårfollikel og brystkirtel, bøjer sig til en knop eller et rørformet organprimordium. En nylig undersøgelse viste, at i disse bøjede epitelier er aktin og fosforyleret myosin ikke beriget apikalt i de kileformede basallagsceller, og kerner er ikke overvejende basalt placeret . Derfor synes hverken apikal indsnævring eller basal kileformning at være involveret i denne proces.

Theoretisk er lokalt forhøjet proliferation, og mere specifikt stratificering, af celler over det basale lag blevet foreslået at være tilstrækkelig til at drive “nedadgående vækst” af et epitel (figur 7) ; faktisk viste undersøgelse af spindelorientering i kindtanden, en af de største epitheliale organplacoder, at celledeling i plakoden sker vinkelret på vævsplanet, hvilket skaber de suprabasale celler (figur 7b) . På forhånd ville man imidlertid forvente, at stratificering ville fortykker et epitel både opad og nedad, eller endda kun opad, hvis det underliggende (mesenkymale) væv var stift. Eksperimentelt blev det desuden i samme stykke arbejde opdaget, at stratificering alene ikke er nok til at drive invagination, og at hæmning af proliferation ikke hæmmer invagination . Med andre ord er “down growth” en utilstrækkelig beskrivelse af tidlig invagination af placode. I stedet blev det konstateret, at suprabasale celler genererer den vigtige bøjningsspænding, som det fremgår af observationer af forhøjet aktin og fosfomyosin, celleinterkalationsbevægelser og tilbageslag ved fysisk skæring . Den plane spænding, der skabes i suprabasale lag ved planar celleinterkalation, blev vist at blive overført til basallaminaen af basallagsceller, der er forankret basalt, men samtidig udvider centripetalt orienterede apikale fremspring, der deltager i interkalationen (figur 7c) . Det basale lag modstår lateral kompression og må derfor bøje sig som reaktion på den suprabasale sammentrækning. Topologisk set indtager suprabasale celler i de ektodermiske placoder den rolle, som apikale actomyosinkabler spiller, men i meget større skala.

Slutning

Som angivet i §1 har vi her forsøgt at give et kort, opdateret resumé af de vigtigste mekanismer, der menes at være involveret i epithelial invagination. Det er værd at nævne, at de forskellige mekanismer, der er diskuteret her, ikke nødvendigvis udelukker hinanden gensidigt. F.eks. er proliferation en nødvendig betingelse for suprabasal interkalation i stratificeret epitel, basal afslapning går normalt forud for apikal indsnævring, og apikal eller basal bunching kan virke sammen med apikal indsnævring eller basal wedging. Det hierarki af de diskuterede mekanismer repræsenterer også begrænsningerne i vores viden. Apikal indsnævring antages måske mest at være almindelig på grund af dens tydelighed i den tidlige udvikling af laboratoriemodelorganismer. De andre mekanismer er gradvist mindre anerkendt, men fortjener at blive betragtet på en mere ligeværdig måde, da de kan være mere almindelige og vigtige i senere udvikling og på tværs af forskellige arter, end man hidtil har forstået. Invagination er blot én type epithelbøjning. Af pladsmæssige årsager har vi undladt at diskutere den mest åbenlyst beslægtede morfogenetiske proces, nemlig evagination, f.eks. ved basal indsnævring, der fører til en udadvendt foldning af vævet . Vi har også begrænset denne gennemgang ved at fokusere på bøjning, der er drevet af iboende kræfter. Med “intrinsisk” mener vi kræfter, der genereres i selve epitelet (men ikke nødvendigvis kun i bøjningspunktet, som det er tilfældet med kabeldrevet bøjning). Ud over de intrinsiske kræfter kan bøjning af rør som f.eks. tarmen eller hjertet drives af kræfter uden for epitelet, f.eks. modstandskræfter, der genereres i fastsiddende eller omsluttende uelastisk væv, når epitelet selv vokser .

I stedet for f.eks. at fokusere på biomekaniske aspekter af epitelbøjning eller foretage en omfattende gennemgang af epitelmorfogenese som helhed , har vi givet en skitse af en række forskellige cellesystemer, der ved koordineret ensembleadfærd genererer den nødvendige anatomi. For nogle af disse systemer er der en vis forståelse af de molekylære mekanismer, men for de fleste af dem er forbindelsen mellem subcellulære molekylære processer og supracellulære resultater på vævsniveau stadig ufuldstændig. Det står imidlertid klart, at det er oplysende at betragte mekanismen på en supracellulær eller multicellulær skala. Ved at betragte epitheliale invaginationer på denne måde som systemer af celler kan den overvældende mangfoldighed af udviklingshændelser måske reduceres til et lille antal håndterbare motiver. Identifikation og karakterisering af disse motiver (selv med variationer) bliver således en gennemførlig dagsorden for både eksperimentelle og teoretiske fremskridt.

Autors bidrag

Alle forfattere bidrog til udformning, udarbejdelse, figurer og redigering af manuskriptet.

Konkurrerende interesser

Vi har ingen konkurrerende interesser.

Finansiering

Dette arbejde blev finansieret af BBSRC grant no. BB/L002965/1 til J.B.A.G.

Fodnoter

Et bidrag af 13 til et temanummer ‘Systems morphodynamics: understanding the development of tissue hardware’.