Cytotoksiske og genotoksiske virkninger af acephate på humant sæd

Abstract

Den omfattende brug af organofosfor-pesticider (OP’er) kan ændre sædkvaliteten og sædcellernes DNA på forskellige stadier af spermatogenesen. Acephate er et meget giftigt OP, der anvendes i vid udstrækning, og derfor havde vi til formål at evaluere acephates virkninger på menneskers sædkvalitet og sæd DNA-integritet. Sædceller indsamlet fra raske mænd blev udsat for 0, 50, 100 og 200 μg/mL acefat og inkuberet i 1 time, 2 timer og 3 timer. Derefter blev sædmotilitet, vitalitet, plasmamembranens funktionelle integritet, sædkapacitering og DNA-skader undersøgt. Resultatet viste et signifikant fald i motiliteten ved 100 μg/mL efter 3 h og med 200 μg/mL efter 1 h, 2 h og 3 h. Levedygtigheden var signifikant reduceret ved 200 μg/mL efter 2 h og 3 h. Den funktionelle integritet blev signifikant påvirket ved 100 μg/mL efter 3 h og i 200 μg/mL-dosis efter 2 h og 3 h. Tilsvarende var sædkapacitering signifikant påvirket ved 200 μg/mL efter 1 time, 2 timer og 3 timer og ved 100 μg/mL efter 3 timer. DNA-skader var kun signifikant forøget i 200 μg/mL-dosis efter 3 timer. Undersøgelsen tyder på, at eksponering for acephat kan resultere i ændringer af sædets struktur og funktion og dermed bidrage til forringelse af den menneskelige sædkvalitet, hvilket udløser infertilitet.

1. Indledning

I løbet af de seneste årtier har adskillige undersøgelser vist, at dyr og mennesker har haft en destruktiv reproduktionsfunktion på grund af menneskeskabte kemikalier og andre giftige stoffer. Desværre er der kun relativt få undersøgelser, der systematisk har behandlet virkningen af miljøeksponering på menneskers reproduktive sundhed. Ifølge nyere undersøgelser er der globalt set hvert år omkring 60-80 millioner par, der lider af infertilitet (der ikke kan blive gravide efter 12 måneders regelmæssig ubeskyttet samleje) . Otteoghalvfems procent af alle tilfælde af mandlig subfertilitet kan hovedsagelig tilskrives mangelfuld sædkvalitet . Subfertilitet kan imidlertid betragtes som idiopatisk og kan være et resultat af risikofaktorer såsom hormonforstyrrende stoffer i miljøet, herunder pesticider.

Organofosfatpesticider er estere af phosphorsyre og thiophosphorsyre, og deres toksicitet er blevet relateret til deres evne til at hæmme acetylcholinesterase, hvilket fører til ophobning af acetylcholin ved nerveknudepunkter . Mange epidemiologiske undersøgelser har vist, at der er en sammenhæng mellem eksponering for organofosfatpesticider (OP’er) og reproduktionsforstyrrelser såsom infertilitet, fødselsdefekter, negative graviditetsresultater og perinatale dødsfald . Organofosfatpesticider mistænkes for at ændre den reproduktive funktion ved at reducere hjernens acetylcholinesteraseaktivitet, hvilket påvirker hypofysens gonadotropin og forårsager infertilitet . Virkningerne på sædkvaliteten kan vurderes ved hjælp af parametre som f.eks. sædkoncentration, procent motile sædceller og procent sædceller med normal morfologi sammen med parametre for sædbevægelse. Flere undersøgelser har vist, at mænd, der er udsat for OP, har en høj risiko for at udvikle unormale sædparametre, herunder nedsat sædkoncentration, nedsat sædmotilitet, nedsat antal sædceller og højere kønskromosomaneuploiditet i sædceller . En undersøgelse foretaget i Kina med forskellige OP viste en klar sammenhæng mellem tilstedeværelsen af metabolitter af insektgifte i urinen og sædkoncentration og sædmotilitet hos nygifte mænd . In vitro-undersøgelser, der er udført med OP, har givet beviser for, at disse pesticider kan beskadige DNA i menneskelige sædceller og dermed forårsage genotoksiske virkninger.

Blandt de meget anvendte og giftige OP’er i Sri Lanka er acephat (O,S-dimethyl acetylphosphoramidothioat) et insekticid, der anvendes i landbruget og til husholdningsformål på grund af dets bredspektrede insekticidegenskab. Acephat er et systemisk insekticid med kontakt- og mavevirkning. Acephats toksiske mekanisme tilskrives ikke kun hæmning af acetylcholinesterase (AchE), men også at den virker som et forsinket neurotoksisk middel . Sing og Jiang rapporterede, at acephat er en potent neurotoksisk, mutagent, carcinogen og cytotoksisk forbindelse. På samme måde afslørede Farag et al., at 14 og 28 mg/kg/dag doser acefat nedsatte sædmotiliteten og antallet af sædceller hos voksne hanmus. To andre undersøgelser har bekræftet, at acephat signifikant nedsætter fertiliteten, sæddynamikken, kønsorganernes vægt og kønshormonerne hos albinohannerrotter . Derfor er der i lighed med andre OP’er en potentiel risiko ved denne forbindelse for menneskers reproduktive sundhed.

Acephat anvendes i vid udstrækning af landbrugere i Sri Lanka, som er i deres bedste reproduktive alder. I de sidste to til tre årtier er det blevet klart, at erhvervsmæssig eksponering for pesticider kan påvirke mænds fertilitet , hvilket indikerer en høj eksponeringsrisiko for disse unge dyrkere. Reguleringen af pesticider er hovedsagelig baseret på dyremodeller, og data om menneskers eksponering og sædkvalitet er fortsat sparsomme og begrænsede. Derfor blev den foreliggende undersøgelse udført for at undersøge virkningerne af acephat på mandlig menneskelig fertilitet og DNA-integritet af sædceller in vitro.

2. Materialer og metoder

2.1. Testmateriale

Uformuleret acephat (handelsnavn: Surrender; molekylformel: C4H10NO3PS; molekylvægt: 183,16 g/mol; renhed: 99,0 %; anbefalet feltdosis af producenten: 1 g acephat i 1 l vand) blev fremstillet hos Hayleys Agriculture Ltd., Colombo, Sri Lanka. Da acephat er let opløseligt i Biggers Whitten Whittingham (BWW), blev det anvendt som kontrol.

2.2. Sædprøver blev indsamlet fra sunde mandlige donorer (alder 20-30 år) fra University of Sri Jayewardenepura, Sri Lanka, i en steril prøveflaske. Forud for sædopsamlingen fik donorerne udleveret et informationsblad og en samtykkeerklæring, hvori de blev bedt om at give deres samtykke til at deltage i undersøgelsen. Alle deltagende personer blev bedt om at afholde sig fra enhver seksuel aktivitet i 3-5 dage før sædopsamlingen. Mænd (gennemsnitsalder på ) med normal sædkoncentration, motilitet, morfologi, viskositet, væskeopløsningstid og pH-værdi samt fravær af umodne former og leukocytter blev udvalgt til undersøgelsen. Sædparametre (motilitet, vitalitet, hypoosmotisk svulmetest og morfologi) blev vurderet i overensstemmelse med Verdenssundhedsorganisationens retningslinjer . Da virkningerne af acephate kan forstærkes med unormale sædceller, er det vigtigt at udvælge donorer med acceptabel sædkvalitet til undersøgelsen.

Etisk godkendelse (etisk godkendelse ref. nr.: 712/13) blev opnået af Ethics Review Committee, Faculty of Medical Sciences, University of Sri Jayewardenepura, Nugegoda, Sri Lanka.

2.3. Bestemmelse af dosisniveauer

For at bestemme dosisniveauerne blev LD50-værdien af acephat for sædmotilitet udført. Derfor blev der fremstillet en prøve med 1 mg acephat i 1 mL BWW, som svarer til den anbefalede feltdosering (1 g acephat i 1 L vand) af acephat. De fremstillede prøver blev efterfølgende fortyndet med BWW for at opnå forskellige koncentrationer af acephat. Særesuspensioner (fastsat til 50 × 106 spermatozoer/mL) blev anbragt i Eppendorf-rør, og den ønskede mængde af enten BWW eller testopløsning blev tilsat (det endelige volumen i røret er lig med 1 mL). Prøverne blev blandet grundigt og blev derefter inkuberet i 1 time i en befugtet inkubator (Sanyo Electric Co. Ltd., Tokyo, Japan) ved 37 °C i 5 % CO2. Efter inkubationen blev sædcellernes procentvise bevægelighed bestemt ved hver koncentration af to uafhængige observatører under Olympus-mikroskop med fase-kontrastoptik (X 400; Olympus Corporation, Japan). På grundlag af denne pilotundersøgelse til bestemmelse af indikationer af toksiske doser for sædprøver blev det afsløret, at LD50-værdien for acephat er 200 μg/mL. Derfor blev der i denne undersøgelse anvendt subletale koncentrationer under LD50, herunder LD50-værdien.

Nedenfor er angivet de valgte dosisniveauer for denne undersøgelse: Høj dosis: 200 μg/mL (svarende til LD50-værdien). Mellemdosis: 100 μg/mL. Lav dosis: 50 μg/mL.Yderligere besluttede vi at udvide tidspunkterne fra 1 time til 2 timer og 3 timer for at bestemme de langvarige virkninger af acefat-eksponering.

2.4. Pesticidinkubation

Friske sædprøver () blev fortyndet med BWW for at opnå en endelig sædkoncentration på 40 × 106 spermatozoer/mL. Efterfølgende blev prøverne inkuberet enten med pesticid i koncentrationer på 50, 100 og 200 μg/mL eller med BWW. Inkubationerne blev udført i 1 mL slutvolumen i 1, 2 og 3 timer ved 37 °C i et inkubationsapparat (Sanyo Electric Co. Ltd., Tokyo, Japan) i en atmosfære med 5 % CO2 og 95 % O2.

2.5. Bestemmelse af sædmotilitet

Den samlede mængde bevægelige sædceller blev vurderet (ca. 100 celler) af to uafhængige observatører under fase-kontrastoptik (X 400; Olympus Corporation, Japan). Procentvis fremadrettet motilitet blev beregnet.

2.6. Cytotoksicitetsundersøgelse

Sædcellernes levedygtighed blev vurderet ved hjælp af Eosin Y-færgeteknikken, og døde og levende sædceller blev beregnet. Procentvis levedygtighed = (samlet antal celler – antal farvede/samlet antal celler) × 100. Samlet antal celler = 100.

2,7. Bestemmelse af den funktionelle integritet af sædplasmamembranen

Den funktionelle integritet af sædplasmamembranen blev vurderet ved hjælp af testen Hypoosmotic Swelling (HOS) beskrevet af Jeyendran et al. . Der blev talt mindst 100 spermatozoer pr. præparat.

2.8. Bestemmelse af kapacitering

En alikvot på 150 μL BWW-medium blev anbragt i en forvarmet kulturskål (35 × 10 mm, Corning, New York, USA) og dækket med et forvarmet 22 × 22 mm dækglas. En alikvot på 20 μL sædprøve blev tilsat til et hjørne af dækglasset. Kulturskålen blev anbragt i et omvendt mikroskop (Diaphot, Nikon, London, UK) udstyret med et termostatisk styret luftvarmeskab (Nikon, London, UK), der er afbalanceret ved 37 °C. Sædkapacitationsstatus blev vurderet på grundlag af hyperaktivering ved hjælp af den objektive fotografiske metode med et Olympus IX71 fase-kontrastmikroskop. Da hyperaktivering er et flagellafænomen, er det muligt at vurdere hyperaktivering visuelt på grundlag af sædcellernes motilitet; flagellabevægelsesmønstre blev evalueret med henblik på optælling af ikkehyperaktiverede og hyperaktiverede sædceller . Eksperimenterne blev udført i to eksemplarer og gentaget uafhængigt af hinanden fire gange.

2.9. Bestemmelse af DNA-skader i spermatozoer

Spermaudstrygninger blev fremstillet på rengjorte mikroskopiske objektglas, og procentdelen af sædceller med normalt DNA blev bestemt ved at tælle 500 sædceller under fluorescensmikroskopi (BH-2, Olympus Ltd., Japan) med excitation ved 490 nm. Observationstiden for et enkelt felt varede mindre end 40-50 sek. Sædceller, der udviste gul til rød farve, blev noteret som denatureret DNA, og sædceller, der udviste grøn farve, blev noteret som normalt DNA .

2.10. Statistisk analyse

Spermtallet hos voksne hanner var normalt fordelt og blev sammenlignet mellem grupperne med tovejs variansanalyse (ANOVA) ved hjælp af Minitab-softwarepakken (Minitab Co., USA) for hovedvirkningen af pesticider. Hvor der blev fundet en signifikant behandlingseffekt, blev forskelle mellem de enkelte gruppers gennemsnit testet ved hjælp af “Tukey 95%”. Dataene er udtrykt som gennemsnit ± Standard Error Mean (SEM). værdi blev sat til .

3. Resultater

3.1. Sædmotilitet

Ved sammenligning med kontrol var den procentvise motilitet signifikant () faldet (tabel 1) ved midtdosis (100 μg/mL) med 16 % efter 3 timers inkubation. I modsætning hertil blev der registreret en meget signifikant () reduktion ved 200 μg/mL efter 1 h, 2 h og 3 h inkubation sammenlignet med kontrol. Endvidere er der en klar reduktion af motiliteten i hver dosis med stigende inkubationstid.

3.2. Cytotoksicitet

Den procentvise levedygtighed faldt (tabel 1) i alle behandlingsgrupper med tiden, men der blev registreret en betydelig reduktion (med 20 %; ) i 200 μg/mL (høj dosis) efter 2 timer efter inkubation sammenlignet med kontroller. Der blev registreret en høj signifikant () reduktion i høj dosis efter 3 timers inkubation, og den blev reduceret med 31 % i forhold til kontrollen.

3.3. Funktionel integritet af sædcellernes plasmamembran

Tabel 1 viser resultaterne af den funktionelle integritet af sædceller efter 1 h, 2 h og 3 h inkubation. Der blev registreret signifikante reduktioner () af den funktionelle integritet i mellemdosis ved 13.5% efter 3 timer og også i høj dosis med 26% efter 2 timers inkubation sammenlignet med deres kontroller. Der blev registreret en meget signifikant () reduktion i høj dosis (med 35 %) efter 3 timers inkubation.

3.4. Spermakapacitering

Der blev observeret en reduktion af de kapaciterede spermatozoer i alle behandlingsgrupper (tabel 1). Procentdelen af kapabiliserede spermatozoer blev signifikant reduceret () i 100 μg/mL-dosis med 18 % efter 3 timers inkubation og ved høj dosis med henholdsvis 32 %, 36 % og 38 % efter 1 times, 2 timers og 3 timers inkubation.

3.5. DNA-skader i spermatozoer

Andelen af DNA-skadede spermatozoer steg med stigende dosering og inkubationstid. Men der blev kun registreret en signifikant () stigning i DNA-skaderne ved høj dosering (med 33 %) efter 3 timers inkubation. Resultaterne er opsummeret i tabel 1.

4. Diskussion

OP-insekticider anvendes i stor udstrækning i Sri Lanka med ringe eller ingen beskyttelse af brugerne, og enkeltpersoner er således udsat for en høj eksponeringsrisiko. Desuden er disse landmænd i deres bedste reproduktive alder uundgåeligt eksponeret over en lang periode. Formålet med denne undersøgelse var at påvise sammenhængen mellem acephat, et OP, og sædkvalitet og DNA-skader i sædceller over forskellige inkubationstidspunkter. Resultaterne af denne undersøgelse viste, at acefat forringer sædmotiliteten, sædets levedygtighed, membranintegriteten og sædkapacitering og inducerede DNA-skader in vitro. Lignende resultater blev opnået med klorerede kulbrinter , organofosfater og benzenmetabolitter.

Den betydelige reduktion af sædmotiliteten, der blev observeret i både middel (100 μg/mL) og høje (200 μg/mL) doser af acephat, kunne resultere i en forringelse af sædets befrugtningsevne . Efter 3 timers eksponering for den højeste dosis var sædcellernes procentvise motilitet reduceret til under de værdier, der anbefales af WHO. Sædmotilitet anses for at være en af de mest følsomme detektorer for cytotoksiske virkninger på sædceller og nedsættelse af sædbefrugtningsevnen. Ændringer i mitokondriernes membranpotentiale som følge af forskellige pesticider kan føre til en reduktion af sædmotiliteten . Sædmotilitet afhænger også af den intense omdannelse og energiudgift, der produceres via mitokondriernes oxidative veje, og pesticider kan forstyrre de oxidative veje og medføre forsinket sædmotilitet, hvilket i sidste ende fører til celledød . Desuden kan pesticidmetabolitter forstyrre mitokondriernes oxidative reaktioner, hvilket fører til produktion af overskydende reaktive oxygenarter (ROS), der mindsker produktionen af ATP, hvilket resulterer i forringet bevægelighed . Oxidativt stress er blevet rapporteret som den primære mekanisme for organophosphat, herunder acephat-toksicitet. Tab af integritet kan føre til en stigning i membranens permeabilitet og tab af evne til at regulere de intracellulære koncentrationer af ioner, der er involveret i kontrollen af sædets bevægelse . Den samlede virkning af membranbeskadigelse kan være ansvarlig for den fortsatte nedgang i sædcellernes bevægelighed og levedygtighed efter ejakulationen.

Livsomheden er andelen af levende sædceller, der bestemmes ved vurdering af den cellulære og/eller membranintegritet . Eosinfarvningstest har givet oplysninger om sædmembranens strukturelle integritet, mens HOS-test har givet oplysninger om sædmembranens funktionelle integritet . Spermatozoernes levedygtighed er forbundet med intakte, funktionelle og semipermeable plasmamembraner . Pesticider kan fremkalde en stigning af calciumioner, der forårsager skader på sædcellernes membraner og dermed påvirker sædcellernes levedygtighed, længe før de når frem til oocytten . De ændringer i plasmamembranen, der blev observeret i den foreliggende undersøgelse, kan resultere i en reduktion af sædcellernes motilitet, levedygtighed og membranintegritet .

Hyperaktivering er en indikation af, at sædcellerne har afsluttet kapacitationen, og er afgørende for at trænge igennem cumulusmassen og zona pellucida . I den foreliggende undersøgelse blev det vist, at hyperaktiverede sædceller faldt i høj koncentration og faldt med øget inkubationstid, hvilket indikerer nedsat sædkapacitering. Sædmembranen og mitokondrier er afgørende for at drive hyperaktivering, og enhver skade på sædmembranen og sædmitokondrier kan føre til en reduktion i antallet af kapacitetsopbyggede sædceller . OP er kendt for at forringe kapacitering gennem hæmning af AchE, når det inkuberes med sædceller in vitro . Ikke desto mindre blev virkningen vendt ved tilsætning af tilstrækkelige mængder AchE eller AchE-imiterende enzymer til mediet , hvilket indikerer vigtigheden af AchE-aktiviteten i sædmembranen for at indlede kapacitation.

Denne undersøgelse afslører en betydelig skade på dobbeltstrenget DNA ved højeste dosis (200 μg/mL) efter 3 timers inkubation. Integritet af sædcellernes DNA er afgørende for at overføre genetisk information under reproduktion, og enhver skade på DNA kan resultere i infertilitet . DNA-baser og phosphodiesterryggekæder er særligt modtagelige for skader forårsaget af oxidativ stress, fordi deres plasmamembraner indeholder store mængder af flerumættede fedtsyrer, og deres cytoplasma indeholder lave koncentrationer af rensende enzymer . Derfor kan høje niveauer af ROS resultere i dobbeltstrengede DNA-brud, som ofte observeres i spermatozoer hos infertile mænd . Det er blevet registreret, at acephat øger de cellulære reaktive oxygenarter (ROS) betydeligt, hvilket resulterer i modifikationer af DNA ved at danne baseparfejl og brud på strenge . DNA-fragmenterede sædceller er mindre bevægelige og mindre modtagelige for hypoosmotisk hævelse, hvilket indikerer en lavere funktionel integritet af sædmembranen, hvilket fører til en reduktion af sædcellernes funktion med stigende DNA-skader . Pesticider, der forårsager DNA-skader i leukocytter, kan også føre til DNA-skader i spermatozoer .

5. Konklusioner

Denne undersøgelse tyder på en mulig forringelse af sædcellernes funktion ved eksponering for acephat. Høj koncentration af acephat (200 μg/mL, hvilket svarer til LD50), der blev testet i denne undersøgelse, ændrede humane sædcellers motilitet, levedygtighed, plasmamembranens funktionelle integritet og sædkapacitering og fremkaldte DNA-skader in vitro. Efter at have taget resultaterne og de naturlige biologiske reaktioner hos mennesker, såsom nedbrydning og clearance af kemikalier, i betragtning, kan det anbefales, at testede højere doser (200 μg/mL) og derover kan udgøre en risiko for menneskers sundhed.

Abkortninger

BWW:	Biggers Whitten Whittingham
HOS:	Hypoosmotisk opløsning
NaCl:	Natriumchlorid
OP:	Organofosfat-pesticid
ROS:
Reaktive oxygenarter.

Etisk godkendelse

Den etiske godkendelse blev indhentet fra den etiske bedømmelseskomité, Faculty of Medical Sciences, University of Sri Jayewardenepura, Nugegoda, Sri Lanka. Det etiske godkendelsesnummer er 712/13.

Interessekonflikter

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter i forbindelse med offentliggørelsen af denne artikel.

Anerkendelser

Værdifuld hjælp fra professor Neelika Malavige, Department of Microbiology, Faculty of Medicine, University of Sri Jayewardenepura, for at stille kuldioxidinkubator til rådighed, og Department of Zoology, Faculty of Science, University of Colombo, for at stille kemikalier til rådighed for projektet, er meget værdsat.