Effekter af statiner på angiogenese og vaskulogenese | Revista Española de Cardiología

INDLEDNING

Statiner hæmmer aktiviteten af 3-hydroxy-3-methylglutarylcoenzym A (HMG-CoA)-reduktase, et enzym, der katalyserer mevalonatsyntesen, det begrænsende trin i kolesterolbiosyntesen.1 Den deraf følgende reduktion i intracellulært kolesterol fører til en kompenserende stigning i kolesteroloptagelsen af low density lipoproteinreceptorer (LDL-receptorer) og et fald i plasmakolesterol. Opdagelsen af statinerne og deres anvendelse hos personer med høje kolesterolkoncentrationer har gjort det muligt at forbedre den primære og sekundære forebyggelse af koronararteriesygdom betydeligt.2,3 På det seneste er statinernes effektivitet i den primære og sekundære forebyggelse af koronararteriesygdom også blevet observeret hos personer med lavere kolesterolniveauer.4-6 Ud over at reducere LDL-kolesterol (C-LDL) har statinerne en række plejotropiske virkninger på flere komponenter af aterosklerose, herunder endotelfunktion, cellevandring, inflammation og plakkens trombotiske tendens7-12 . Hos normokolesterolemiske dyr er det blevet påvist, at statiner har en beskyttende virkning mod iskæmi-reperfusionslæsioner i hjertemusklen, sandsynligvis gennem mekanismer, der er relateret til endothelets produktion af nitrogenoxid (NO).13

Den serin/threoninproteinkinase Akt eller proteinkinase B (PKB) er en multifunktionel intracellulær regulator af cellulær overlevelse, vækst og metabolisme 14 (figur 1). I forbindelse med dens kardiovaskulære funktioner virker Akt/PKB på den intracellulære vej, der stimuleres af vaskulær endothelial vækstfaktor (VEGF)14,15 og angiopoietin16-18 , hvilket fremmer celleoverlevelse og sikrer en passende vaskulær udvikling.19 Konstitutiv aktivering af Akt-signalering beskytter kardiomyocytter mod apoptose i iskæmi-reperfusionslæsionslæsioner20 . Ud over sin cytoprotektive virkning fungerer Akt som en aktivator af NO-produktion af endothelet som reaktion på VEGF og shear stress gennem sin evne til at fosforylerer den endotheliale nitrogenoxidsyntase (eNOS) i serin 1179 eller 1177,21,22 og kontrollerer således vasomotorisk tone.23 På den anden side er Akt afgørende for endothelcellernes migration til det VEGF-producerende fokus.24 Akts evne til at formidle celleoverlevelse, NO-produktion og VEGF-induceret migration tyder derfor på, at proteinkinase Akt kan formidle endothelrespons på angiogene stimuli.

Fig. 1. Statiner, Akt-signalering og angiogenese/vaskulogenese. Angiopoietin 1 (Ang-1), VEGF og fibroblastvækstfaktor (FGF) inducerer, når de er bundet til deres membranreceptorer, konverteringen af fosfatidylinositol 4,5-biphosphat (PIP2) til fosfatidylinositol 3,4,5-triphosphat (PIP3) ved hjælp af fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K). PIP3-dannelsen er nødvendig for phosphorylering af Akt-proteinkinase af PDK-1-kinase. Statinbehandling øger phosphoryleringen af Akt, mens wortmanin (en PI3K-hæmmer) forhindrer den. Mevalonat, der er et produkt af HMG-CoA-reduktase, hæmmer også PI3K og den efterfølgende fosforylering af Akt. Derfor øger statinerne ved at hæmme HMG-CoA-reduktase og produktionen af mevalonat Akt-fosforyleringen og samtidig fosforyleringen og aktiveringen af endothelial nitrogenoxidsyntase (eNOS), nitrogenoxidsyntese (NO) og en række fysiologiske virkninger induceret i angiogenese og vasculogenese. Akt forhindrer også apoptose af endothelceller.

Det er for nylig blevet påvist, at statinerne også stimulerer den intracellulære signalvej for proteinkinase Akt/PKB25-27 i endothelceller25 og de endotheliale progenitorceller (EPC) i knoglemarven,26,27 hvorved både angiogenese25 og vaskulogenese induceres.26 Statinernes virkninger på kinetikken af EPC er også blevet påvist hos mennesker af Vasa et al.28 Denne artikel gennemgår statinernes virkning på induktion af angiogenese25 og vaskulogenese26 gennem mekanismer relateret til Akt-aktivering.25-27

ANGIOGENESIS OG VASKULOGENESIS

Angiogenese og vaskulogenese er ansvarlige for udviklingen af det vaskulære system i embryoet.29-32 Vaskulogenese er processen med blodkardannelse fra endotheliale progenitorceller (angioblaster), der migrerer og fusionerer med andre endotheliale progenitorceller og differentierer sig til endothelceller, mens de danner nye blodkar. I modsætning hertil er angiogenese processen med udvidelse af de blodkar, der er dannet ved at knoppe nye kapillærer gennem migration og proliferation af tidligere differentierede endothelceller (figur 2).

Fig. 2. Skematisk fremstilling af angiogenese og vaskulogenese. (A) Vaskulogenese er aggregering af angioblaster eller endoteliale progenitorceller til dannelse af blodkar. Angioblaster samler sig in situ eller migrerer for at danne blodkar på fjerntliggende steder. (B) Angiogenese er dannelsen af nye blodkar ud fra allerede eksisterende kar ved proliferation og migration af differentierede endothelceller. (C) Angiogenese og vasculogenese kan også forekomme samtidig. (Taget fra Cleaver et al.29)

Det blev oprindeligt antaget, at den vaskulogene proces var begrænset til den embryonale udvikling, mens angiogenese (som også forekommer i embryonet) var den eneste proces, der var involveret i neovaskularisering hos voksne. Paradigmet for postnatal neovaskularisering blev imidlertid for nylig revideret, og det blev opdaget, at endotheliale progenitorceller, der cirkulerer i perifert blod,33 inkorporeres af neovaskulariseringsfoci i voksne dyr,34 de øges i antal som reaktion på vævsiskæmi,35 og de fremmer udviklingen af kollaterale blodkar efter deres ekspansion in vitro og senere transplantation.36 Disse undersøgelser har fastslået, at både angiogenese og vaskulogenese er ansvarlige for neovaskularisering hos voksne.

En tredje mekanisme, der sandsynligvis bidrager til udviklingen af kollaterale blodkar, er forøgelsen af størrelsen og kaliberen af allerede eksisterende arteriolære kollaterale forbindelser, en proces kaldet arteriogenese.37 Tilstedeværelsen og antallet af disse oprindelige kollaterale blodkar varierer meget mellem individer og arter. Når et kar bliver okkluderet, sker der en stigning i blodgennemstrømningshastigheden gennem allerede eksisterende kollaterale kar og en stigning i luminal shear stress, faktorer, der bidrager til modning af de kollaterale kar, især dem af mellemstørrelse.

Metoder til undersøgelse in vitro

Udviklingen af teknikker til dyrkning af endotelceller har gjort det muligt at forstå de processer, der er involveret i angiogenese.38 Endothelceller i kultur bevarer evnen til at reagere på faktorer, der stimulerer eller hæmmer angiogenese, samt evnen til at danne endothelrør in vitro. Assays af celleproliferation gør det muligt at analysere virkningen af et bestemt stof på endothelcelleproliferation. Endothelcellers migration mod en opløsning, der indeholder et bestemt stof, adskilt af en permeabel membran, kan undersøges i et Boyden-kammer. Mekanismerne for tubulær endoteldannelse og virkningen af et bestemt stof på tubuli kan undersøges ved hjælp af to- eller tredimensionelle assays. Med disse teknikker analyseres processerne for dannelse af det endoteliale lumen og den ekstracellulære matrix’ indflydelse på udviklingen af kapillærer.38 Endelig giver kulturer af endotelceller mulighed for at studere de molekylære veje, der er involveret i angiogeneseprocesser.

For nylig er teknikker, der er udviklet til at studere differentierede endotelceller, ved hjælp af celleudvælgelsesteknikker og særlige kulturmedier blevet anvendt til at studere endotheliale progenitorceller.33-36

Metoder til undersøgelse in vivo

Selv om teknikker in vitro gør det muligt at foretage en foreløbig analyse af angiogenese og vaskulogenese, er der mange faktorer, der kan påvirke eller modulere disse processer in vivo.38 For at studere mekanismerne for blodkardannelse in vivo er der udviklet forskellige biologiske systemer til at kvantificere eller påvise virkningen af et bestemt stof: hornhindemodeller af mus, kyllingeembryo chorioalantoid membran eller svampeimplantater.38 Disse systemer kræver, at dyret ofres, så de fanger kun effekten på et bestemt tidspunkt. For at studere den tidsmæssige udvikling af begivenheder i et enkelt væv er der udviklet intravital mikroskopiteknikker til huden på ryggen eller kraniet af musen39 . Endelig har udviklingen af genteknikker gjort det muligt at undersøge virkningen af undertrykkelse (knock-out) eller tilføjelse (knock-in) af et gen i forbindelse med vaskulogenese- og angiogeneseprocesser.

Undersøgelsen af postnatal vaskulogenese og virkningen af visse stoffer på vaskulogeneseprocesser er blevet mulig takket være brugen af flow-cytometri-teknikker, fluorescensaktiveret cellesortering (FACS), særlige teknikker til dyrkning af endotheliale progenitorceller (EPC) fra perifert blod og murine knoglemarvstransplantationsmodeller.33-36 FACS anvendes til at påvise og kvantificere EPC i perifert blod ved hjælp af antistoffer mod disse cellers overfladeantigener. Indflydelsen af lægemidler eller vækstfaktorer på antallet af disse celler i perifert blod kan analyseres på denne måde. De særlige teknikker til udvælgelse og dyrkning af celler, som vores gruppe har udviklet, har også gjort det muligt at påvise og kvantificere EPC. I murinmodellen for knoglemarvstransplantation transplanteres knoglemarvsceller fra en musedonor til en musereceptor med et gen, der koder for udarbejdelsen af et stof, som gør det muligt senere at påvise det (figur 3). I vores tilfælde kodede genet for endothelcellernes produktion af beta-galactosidase. Der opnås selektiv ekspression, fordi dette gen reguleres af en specifik endothelcellepromotor, Tie-2, i musedonoren. Derfor er det kun endothelceller fra knoglemarven fra dyrets donor, der vil udtrykke den beta-galactosidase, som kan påvises i dyrets receptor. Hvis de ovenfor beskrevne biologiske forsøg udføres efter knoglemarvstransplantation i dyrereceptoren, kan vi analysere et bestemt stofs indflydelse på vaskulogenese ved at kvantificere antallet af endotheliale progenitorceller, der stammer fra knoglemarven.

Fig. 3. Murinmodel for knoglemarvstransplantation til undersøgelse af vaskulogenese. De anvendte knoglemarvsdonorer er transgene mus, der konstitutivt udtrykker genet LacZ (som koder for beta-galactosidase) reguleret af en specifik endothelpromotor, Tie-2. Knoglemarven udvindes og transplanteres til en musereceptor, hvis knoglemarv er blevet bestrålet subletalt. Efter en periode på 4 uger for at opnå rekonstitution af den transplanterede knoglemarv foretages et eller flere indgreb i musereceptoren (det viste tilfælde er en hornhinde-model) for at stimulere neovaskularisering. Efter disse indgreb aflives dyrene, og der foretages en histologisk undersøgelse for at påvise beta-galactosidase-ekspression. Med X-GAL-farve får celler, der udtrykker beta-galactosidase, en blålig farve. Brugen af en specifik promotor for endothelceller gør det muligt at identificere de blå celler, der er blevet inkorporeret i neovaskulariseringsfoci, som celler af endothelial afstamning.

EFFEKTE AF STATINER PÅ INDUKTION AF ANGIOGENESIS OG VASKULOGENESIS

Undersøgelser foretaget i vores laboratorium og andre steder har vist, at statinerne stimulerer den intracellulære signalvej for proteinkinasen Akt/PKB,25-27 som fremmer både angiogenese25 og vaskulogenese.26 Desuden har Vasa et al. også været i stand til hos mennesker at påvise statiners virkninger på kinetikken af EPC.28

Virkninger in vitro af statiner

Statinerne aktiverer hurtigt proteinkinase Akt/PKB i endotelceller25 og EPC,26,27 og øger dermed fosforyleringen af eNOS og den efterfølgende produktion af NO. Akt-aktivering ved statiner fremmer proliferation, migration og cellulær overlevelse af endothelceller og EPC samt dannelsen af den vaskulære struktur. Desuden medfører hæmning af Akt ved brug af adenovirus, der koder for dominerende negative former af Akt, en hæmning af de virkninger, der induceres af statiner. Statiners potentiale i vævsregenerationsprocesser er tidligere blevet påvist i osteoblaster. I disse celler øgede statinerne proliferationen og aktivitetsniveauet og øgede dermed knogledannelsen.40

Og selv om mekanismerne for Akt-aktivering ved statiner ikke er præcist kendt, er det sandsynligt, at phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)-signalering er involveret, fordi denne proces blokeres af wortmanin og LY294002, to enzymhæmmere (figur 1). Desuden er hæmning af HMG-CoA-reduktase nødvendig, da aktiveringen af Akt ved simvastatin blev hæmmet ved tilsætning af mevalonat til inkubationen (figur 1). Mevalonat er nødvendigt, ikke kun for biosyntesen af kolesterol, men også for produktionen af ubiquinon, dolicholer og isoprenoider, som er afgørende for flere celleprocesser. Selv om statinerne stabiliserer messenger RNA (mRNA) af eNOS ved at ændre isoprenoid-syntesen41 , observerede vi ikke ændringer i proteinsyntase eNOS-værdierne. I denne henseende er det vigtigt at understrege, at stigningen i mRNA-koncentrationen var senere (24 timer) end aktiveringen af eNOS-fosforylering ved Akt (15 minutter). Denne kortere aktiveringstid er i overensstemmelse med de ændringer, der induceres af statiner i produktionen af NO og i den vasodilatation, der er observeret i aortaannuli ex vivo.42

Virkninger in vivo af statiner

Statinerne og aktivering af intracellulær Akt-signalering fremmer angiogenese i modeller af perifer iskæmi udviklet hos normokolesterolemiske kaniner.25 Hos dyr, der fik statiner, blev der observeret højere perfusionstryk, et større antal kollaterale kar og en større kapillær tæthed (Figur 4). På den anden side øger statinerne antallet af endotheliale progenitorceller i perifert blod hos både mus26,27 og mennesker.28 Desuden øger statinerne den corneale neovaskularisering hos normokolesterolemiske mus, til dels på grund af vaskulogenese fra EPC fra knoglemarv (figur 3 og 5).26 Ved hjælp af murinmodellen med knoglemarvstransplantation var det muligt at påvise et større antal EPC fra knoglemarv i corneaerne hos mus, der blev behandlet med statiner. Statiner har derfor en vigtig effekt på EPC-kinetikken, som det tidligere er blevet påvist med VEGF eller granulocyt- og monocytkoloni-stimuleringsfaktor (GM-CSF),35 og statin-induceret mobilisering af disse celler kan øge postnatal neovaskularisering.

Figur 4. Statin-induceret stigning i neovaskularisering i benet hos en kanin som reaktion på unilateral resektion af femoralarterien. a) Femoralarterien og dens grene er dissekeret. Den genetiske overførsel til endothelium foretages ved infusion af adenovirus, der koder for beta-galactosidase (Ad-βgal) eller Akt (Ad-myrAkt) i den distale femoralarterie og inkubation i 15 min, mens femoralvenen midlertidigt klemmes af. b) På tredjedagen udtages gastrocnemius-musklen, og der foretages X-GAL-farvning for at bestemme den transgene fordeling i histologiske præparater farvet med hæmatoxylin-eosin. c) Der foretages angiografi gennem den indre iliacus for at analysere dannelsen af kollaterale kar i forskellige behandlingsgrupper. I angiografier foretaget efter 40 dage ses en stigning i dannelsen af kollaterale kar hos de dyr, der fik 0,1 mg/kg simvastatin ved intraperitoneal injektion, sammenlignet med de dyr, der blev interveneret, men kun fik indsprøjtet saltvandsopløsning. Der blev foretaget en kvantitativ analyse af de kollaterale kar i kontrolgruppen, den simvastatinbehandlede gruppe og den gruppe af dyr, der fik en intramuskulær injektion af Ad-VEGF. Den angiografiske score blev analyseret i forsøgsgrupperne, der fik en infusion af saltvandsopløsning, Ad-βgal og Ad-myrAkt 31 dage efter operationen. d) Farvning for alkalisk fosfatase i adduktormusklen i det iskæmiske ben viste en større kapillær tæthed i gruppen af dyr behandlet med simvastatin i forhold til kontrolgruppen 40 dage efter operationen. Dataene fra hvert forsøg er præsenteret som gennemsnit ± SD (n=6 kaniner i hver af behandlingsgrupperne, *P25)

Fig. 5. Stigning i corneal neovaskularisering ved statin-induceret vaskulogenese. a) Repræsentative fotografier, der viser corneal neovaskularisering (venstre, vehikel; højre, simvastatin). b) X-gal farvning af hele corneaer. De blålige punkter er celler, der udtrykker beta-galactosidase (venstre, vehikel; højre, simvastatin). c) Repræsentative mikrofotografier af den histokemiske undersøgelse af fluorescens i paraffinindlejrede corneaer fra Tie2/LacZ/BMT-mus (venstre, vehikel; højre, simvastatin). Tilstedeværelsen af dobbelt positive celler er tegn på, at endotheliale progenitorceller (EPC) fra knoglemarv er blevet inkorporeret af neovaskulariseringsfocerne (vaskulogenese). Den røde farve angiver i dette tilfælde beta-galactosidase, og den grønne farve viser den specifikke endotelmarkør isolectin B4. De dobbelt positive celler (gul farve) er EPC opnået fra knoglemarv, som er blevet inkorporeret af de nye kar. d) Repræsentative mikrofotografier af den histokemiske undersøgelse af fluorescens i hele hornhinder fra Tie2/LacZ/BMT-mus (venstre, vehikel; højre, simvastatin). Den røde farve viser beta-galactosidase og den grønne farve viser den specifikke endotelmarkør lectin BS-1. e) Kvantificering af de EPC, der stammer fra transplantation, og som er inkorporeret i neovaskulaturen. Udtrykt som forholdet mellem antallet af EPC og det samlede antal endothelceller, der danner de nye kar. *P26)

KONKLUSIONER

Statiner fremmer proliferation, migration og cellulær overlevelse af endothelceller og EPC fremstillet fra knoglemarv gennem mekanismer, der er relateret til aktivering af serin/threoninproteinkinase Akt eller PKB. På samme måde som VEGF fremmer statiner angiogenese og vasculogenese. Akt-aktivering kan derfor være ansvarlig for nogle af de gavnlige virkninger af statiner, herunder postnatal neovaskularisering.