Emerging evidences for the opposite role of apolipoprotein C3 and apolipoprotein A5 in lipid metabolism and coronary artery disease rolle for apolipoprotein C3 og apolipoprotein A5 i lipidmetabolisme og koronararteriesygdom

Apolipoprotein C3 (apoC3) og apolipoprotein A5 (apoA5) er kodet af APOA1/C3/A4/A5-genklynger. Beviser fra genetiske, epidemiologiske undersøgelser og grundlæggende eksperimenter har konsekvent vist, at apoC3 og apoA5 er kritiske modulatorer af plasma-triglycerid (TG)-metabolismen . Mangel på apoC3 eller apoA5 førte til en betydelig nedsættelse eller forøgelse af plasma-TG-niveauet hos mennesker og mus . Grundige mekanistiske undersøgelser afslørede, at apoC3 hæmmer plasma TG-hydrolyse, optagelsen af restlipoprotein og fremmer hepatisk TG-sekretion, mens apoA5 regulerer plasma TG-metabolismen på en fuldstændig modsatrettet måde . Nyere undersøgelser afslørede endvidere yderligere den rolle, som apoC3 og apoA5 spiller i metabolismen af restkolesterol (RC), high density lipoprotein (HDL) og hepatisk TG-metabolisme . Desuden viste store befolkningsgenetiske undersøgelser i stor skala, at tab af funktionsmutationer i APOC3- og APOA5-genet gav henholdsvis nedsat og øget risiko for koronararteriesygdom (CAD) . Således fremstår apoC3 og apoA5 som potentielle nye mål til at reducere den kardiovaskulære risiko. Dette manuskript gennemgik hovedsagelig de eksisterende beviser, der tyder på den modsatte rolle af apoC3 og apoA5 i lipidmetabolisme og CAD-risiko, og diskuterede potentiel korrelation mellem disse to apolipoproteiner.

Genstruktur og ekspressionsregulering

Humane APOA1/C3/A4/A5-genklynger er placeret på kromosom 11q23, hvor APOC3-genet er ca. 35 kbp opstrøms fra APOA5-genlokus . Deres sekvenser er evolutionært bevaret . De regulatoriske regioner i det menneskelige APOC3-gen indeholder et sæt proximale promotorer med fire elementer (- 283/+ 24) og distale forstærkere med seks elementer (- 890/- 500) . Tidligere dyre- og cellekulturundersøgelser har vist, at APOC3-forstærkeren fungerede som en fælles reguleringssekvens, der styrer ekspressionen af APOA1-, APOC3- og APOA4-generne i lever og tarm . Der blev imidlertid opnået tilstrækkelig leverspecifik APOA5-genekspression in vivo med et 26 kb DNA XhoI-fragment, der kun indeholder APOA5-genet og således ikke har APOC3-forstærker . Gao et al. bekræftede endvidere, at APOC3-forstærkeren ikke påvirkede APOA5-ekspressionen i transgene mus . Faktisk er to elementer i APOA5-promotorregionen blevet fundet kritiske for at styre dets ekspression i humane hepatiske cellelinjer .

Initiering af genekspression udføres ved specifik binding af transkriptionsfaktorer til genregulerende elementer, og molekyler, der påvirker denne proces, kan regulere tilsvarende genekspression. Den konkrete struktur og reguleringsmekanismer for APOC3- og APOA5-genekspression er blevet gennemgået andetsteds , og vi vil her fokusere på regulatorer, der er fælles for APOC3 og APOA5. Faktisk er flere molekyler blevet impliceret i den samme retningsregulering af APOC3- og APOA5-ekspression, herunder opregulering med hepatocytkernfaktor 4-α (HNF4-α) og glukose , og nedregulering med AMP-aktiveret proteinkinase , insulin og tumornekrosefaktor-α (TNF-α) . Det er bemærkelsesværdigt, at disse stoffer, bortset fra TNF-α, alle er vigtige komponenter, der er direkte involveret i glukosemetabolismen, hvilket tyder på, at APOC3- og APOA5-dysregulering kan bidrage til diabetisk dyslipidæmi. Modsat retningsregulering blev også fundet, idet peroxisome proliferator-aktiveret receptor-α (PPAR-α) og farnesoid X-aktiveret receptor (FXR) fremmede APOA5, mens APOC3-ekspression blev hæmmet . I modsætning til APOA5 indeholder den humane APOC3-genpromotor ikke PPAR-α- og FXR-positive responselementer. Faktisk virkede disse to nukleare receptorer indirekte ved at forstyrre bindingen af andre transkriptionelle faktorer, såsom HNF4-α, til specifikke elementer i APOC3, hvorved APOC3-genets transkription blev yderligere hæmmet . Den plasma-TG-sænkende effekt af fibrater, en type PPAR-α-agonister, kan således delvist formidles ved at øge den cirkulerende koncentration af apoA5 og/eller sænke apoC3-niveauerne. Faktisk viste nyere undersøgelser, at både fenofibrater og omega-3 flerumættede fedtsyrer terapi signifikant nedsatte plasma apoC3-niveauerne hos mennesker .

Plasma lipidmetabolisme

Lipoproteinfordeling

Cirkulerende apoC3 og apoA5 var hovedsageligt forbundet med triglyceridrigt protein (TRL) og HDL . Undersøgelser viste, at enten apoC3 og apoA5 kunne udskiftes mellem TRL og HDL . I normolipidemisk tilstand hos mennesker var størstedelen af plasma apoC3 bundet til HDL . Hos personer med hypertriglyceridæmi (HTG) blev apoC3 derimod for det meste fundet på lipoprotein med meget lav densitet (VLDL) . I takt med at koncentrationen af TG i kunstige TG-emulsioner steg, flyttede en større del af apoC3 væk fra native plasmalipoproteiner til kunstige emulsioner . Glangeaud et al. fandt under den lipoproteinlipase (LPL) medierede hydrolyse af VLDL, apoC3 omfordelt fra VLDL til HDL i vitro-undersøgelse, med den mængde, der var proportional med størrelsen af TG-hydrolyse i VLDL, og apoC3 blev efterfølgende overført tilbage til nysyntetiserede TG-berigede VLDL-partikler . Tilsvarende viste Nelbach et al., at apoA5 overvejende var associeret med HDL i APOA5-transgene mus, som havde TG-rige VLDL, men blev hurtigt og effektivt omfordelt til TG-rige VLDL isoleret fra APOA5 knockout-mus efter inkubation. Shu et al. rapporterede også, at intravenøs injektion af apoA5-holdigt rekonstitueret HDL i APOA5 knockout-mus viste det identiske udvekslingsmønster af apoA5 mellem rekonstitueret HDL og VLDL, og apoA5 forblev stadig associeret med det TG-rige VLDL på grund af forstyrrelsen af VLDL-hydrolyse.

Disse resultater antydede, at lipoproteinfordelingerne af apoC3 og apoA5 var tæt forbundet med TG-indholdet i TRL. Størstedelen af apoC3 og apoA5 var i HDL, når der var lave TG-niveauer i TRL. En stor del af apoC3 og apoA5 blev omfordelt fra HDL til TRL-partikler, når TG-indholdet steg i TRL, og de blev gradvist flyttet tilbage til HDL i forbindelse med behandlingen af TRL-hydrolyse. Den biologiske funktion og reguleringsmekanismen for udvekslingsprocessen er imidlertid ikke blevet godt belyst.

Plasma TG

ApoC3 og apoA5 er kritiske determinanter for plasma TG-koncentrationen, som det fremgår af genetiske observationer hos mennesker. Funktionstabsmutationer i det humane APOC3-gen gav en lav plasma TG-profil , mens patienter med APOA5-mangelmutationer havde ekstremt høje plasma TG-niveauer . Abnormiteter i apoC3 og apoA5 var forbundet med forskellige former for HTG, såsom familiær hyperchylomikronæmi , familiær kombineret hyperlipidæmi og familiær dysbetalipoproteniemia . Interessant nok viste nylige undersøgelser, at der findes et enkelt glykosyleringssted ved Threonin 74 i apoC3-proteinet, hvilket giver anledning til fire hovedproteoformer i plasma. Wildtypeformen, som ikke indeholder en glykan-kæde, kaldes almindeligvis apoC30a. De øvrige tre har alle en kerne glykan-kæde bestående af et O-linked disaccharid galactose knyttet til N-acetylgalactosamin. ApoC30b er den proteoform, der kun indeholder glykan-kernen, mens apoC31 og apoC32 indeholder yderligere henholdsvis en og to sialinsyrerester . Desuden var der en differentieret korrelation mellem fire store proteoformer af apoC3 og TG-niveauerne ved faste. Ved hjælp af massespektrometrisk immunoassay-måling blev det konstateret, at plasma apoC30a, apoC30b og apoC31 havde en positiv, mens apoC32 havde en negativ sammenhæng med fastende plasma-TG , hvilket tyder på, at analyse af de enkelte apoC3-isoformer kan give mere omfattende oplysninger end den samlede plasmakoncentration af apoC3.

Konsistent havde APOC3 knockout-mus nedsat TG-koncentrationen (- 30%) sammenlignet med vilde kuldemødre, mens APOC3-transgene mus viste øget serum TG-niveau (+ 200% til 2000%) . På den anden side havde APOA5 knockouts en stigning (+ 400%) i TG-niveauet, mens APOA5-transgene mus viste signifikant reduceret (- 70%) i denne lipidparameter .

Dybtgående mekanistiske undersøgelser afslørede, at apoC3 og apoA5 regulerede plasma TG-niveauet gennem flere veje. ApoC3 hæmmede LPL-medieret TRL-hydrolyse, cirkulerende TRL-rest clearance og fremmede hepatisk TG-sekretion. Det er interessant, at apoA5 regulerede plasma TG-metabolismen på en helt modsat måde. ApoA5 accelererede nemlig TRL-hydrolyse, TRL-resternes optagelse i leveren, mens den hæmmede hepatisk TG-sekretion (fig. 1).

Plasma RC

RC er defineret som det samlede kolesterolindhold i TRL, herunder VLDL og lipoproteiner af intermediær tæthed (IDL) i fastende tilstand, og VLDL, IDL og chylomikronrester i ikke-fastende tilstand. Der er stadig flere beviser for, at RC er en uafhængig kausal risikofaktor for iskæmisk hjertesygdom . Desuden var forhøjede RC-niveauer forbundet med øget dødelighed af alle årsager hos patienter med iskæmisk hjertesygdom .

Da apoC3 og apoA5 regulerede TRL-metabolismen, er det ikke uventet at finde, at APOC3- og APOA5-genvarianter var forbundet med RC-niveauer. I en meta-analyse af 137,895 individer var RC 43% lavere i APOC3 loss-of-function heterozygoter i forhold til ikke-bærere . Modsat var genotypekombinationer af almindelige varianter af APOA5 (c.-1131 T > C, S19 W og c.*31C > T) forbundet med stigninger i RC på op til 56 % . Således synes målretning af apoC3 eller apoA5 at være en potentiel tilgang til at reducere plasma RC-niveauerne, hvilket kunne bevidnes i fremtidige forsøg.

HDL

HDL udøver forskellige athero-beskyttende egenskaber, herunder mediering af kolesteroludstrømning, beskyttelse af vaskulært endotel, antiinflammatoriske og anti-apoptotiske virkninger . HDL med mangler i disse egenskaber betegnes som dysfunktionelt HDL, hvilket igen bidrager til udviklingen af CAD. Observationsundersøgelser på mennesker viste, at disse egenskaber var defekte under patologiske lidelser. F.eks. blev der fundet nedsat kolesteroludstrømningskapacitet hos HDL fra uræmiske patienter . Riwanto et al. fandt, at HDL fra CAD-patienter ikke aktiverede endotheliale anti-apoptotiske veje, men snarere stimulerede potentielle endotheliale pro-apoptotiske veje. Ved hjælp af spektrometri og biokemiske analyser viste undersøgelser endvidere, at nedsat HDL-funktion korrelerede tæt med ændringen i dens proteomsammensætning , blandt hvilke ændringer af apoC3 og apoA5 fik megen opmærksomhed.

Riwanto et al. fandt, at der var signifikant højere apoC3 i HDL-partikler fra CAD-patienter sammenlignet med sunde kontroller. Desuden forbedrede brugen af antistof, der neutraliserede apoC3 i disse HDL, HDL-medieret anti-endothelial apoptosefunktion . Cho KH viste, at et stigende indhold af apoC3 i kunstigt rekonstitueret HDL reducerede dets lecithinkolesterolacyltransferase (LCAT)-aktiveringsevne . Interessant nok viste Luo M et al., at ApoC3-indholdet i HDL var negativt forbundet med HDL-medieret kolesteroludstrømningskapacitet , men den underliggende mekanisme er ukendt. I modsætning hertil førte adenovirus-medieret overekspression af APOA5 i mus til øget apoA5 i HDL, der var forbundet med øget kolesteroludstrømningskapacitet . Rekonstitueret HDL syntetiseret med mere apoA5 havde større partikelstørrelse, mere lipidindhold og bedre antioxidantkapacitet over for LDL in vitro .

Den definitive rolle af apoC3 og apoA5 i HDL-funktionen skal undersøges yderligere. Det er blevet rapporteret, at apoC3 i HDL kan binde til scavengerreceptor B1 (SR-B1) , med ukarakteriseret strukturdomæne. SR-B1 er kendt som et vigtigt element i kolesterolomvendt transport dels for at lette den selektive optagelse af kolesterolestere fra HDL i leveren . Hvorvidt denne interaktion mellem apoC3 og SR-B1 vil påvirke den omvendte kolesteroltransport er ubestemt.

Hepatisk VLDL-sekretion

En af leverens vigtigste funktioner er at syntetisere og sekretere VLDL. VLDL er sammensat af en kerne af neutrale lipider, hovedsagelig TG, og flere apolipoproteiner . Heraf er apolipoprotein B100 (apoB100) det vigtigste og giver strukturel stabilitet til VLDL-partiklen. Der er to trin i biogenesen af VLDL. I første omgang starter dannelsen af VLDL med syntesen af apoB100 i det endoplasmatiske retikulum (ER). Det spirende apoB100 bliver derefter delvist lapideret for at danne en lipidfattig primordial VLDL-partikel, hvilket fremmes af det mikrosomale triglyceridtransferprotein (MTP). I det andet trin af VLDL-dannelsen fusionerer den primordiale VLDL-partikel med triglyceridrige partikler for at danne modne modne TG-rige VLDL . Stigende beviser har indikeret, at apoC3 og apoA5 regulerede VLDL-lipidering og påvirkede det hepatiske TG-indhold (Fig. 1).

Data fra cellekultur, dyreforsøg og undersøgelser på mennesker bekræftede, at apoA5 hæmmer VLDL-TG-sekretion og fremmer lagring af TG i cytosoliske lipiddråber. McA-RH7777-celler stabilt transficeret med humant APOA5 udskiller VLDL’er, der var mindre end dem fra kontrolceller, men havde større celle TG-niveau og større lipiddråber . I modsætning hertil rapporterede Ress et al., at knockdown af APOA5 i HepG2-celler førte til et fald i det cellulære TG-indhold. Levere fra APOA5-transgene mus havde et øget hepatisk TG-niveau sammenlignet med vilde kuldemødre . Qin et al. fandt, at patienter med ikke-alkoholisk fedtleverlidelse (NAFLD) har forhøjet APOA5-ekspression sammenlignet med raske kontroller. Der er dog stadig nogle gåder, der er nødvendige for at blive yderligere belyst. Primært, hvorved undslipper en del af apoA5 sekretionsvejen til blodet og bliver associeret med cytosoliske lipiddråber? Desuden, hvordan fremmer apoA5 hepatisk TG-oplagring i lipiddråber (LD) i stedet for sekretion i form af VLDL.

Og omvendt har in vivo og in vitro-undersøgelser vist, at apoC3 har en stimulerende virkning på VLDL-lipidering. Fodring af APOC3 knockout-mus med en fedtholdig diæt i to uger stimulerede ikke VLDL-TG-produktionen, mens genoprettelse af APOC3-ekspression ved hjælp af adenovirus, der koder for humant apoC3, resulterede i en robust produktion af VLDL-TG . Den stimulerende virkning af humant apoC3 på lipidering af VLDL blev rekapituleret i McA-RH7777 celler under lipidrige forhold . Desuden ophævede stedbestemt mutation af rester i lipidbindingsdomænet (K58E) af apoC3 denne stimulerende virkning . Disse resultater blev understøttet i mennesker af de observationer, at to SNP’er af APOC3 (C-482 T, T-455C), der fører til nedsat APOC3-ekspression, var korreleret med øget hepatisk TG-niveau og højere prævalens af NAFLD i asiatisk-indisk befolkning .

Den subcellulære placering af apoA5 og apoC3, der regulerer VLDL-lipidering, foreslås at være ER-kompartmentet. Gao et al. antog, at apoA5 kan lette de ER-luminale LD’er, der knopper udad for at danne cytosolisk LD og dermed reducere den TG, der samles i VLDL-partikler . Qin et al. fandt, at apoC3 fremmede fusionen af ER-luminale LD med VLDL-partikler under VLDL-lipidering . Der er behov for dybtgående undersøgelser med fokus på det molekylære grundlag, der ligger til grund for virkningen af apoA5 og apoC3 på VLDL-lipidering og LD-metabolisme, hvilket vil give en ny forståelse af hepatisk TG-homeostase.

Associering med CAD

CAD er blevet en af de vigtigste dødsårsager på verdensplan. Low-density lipoproteinkolesterol (LDL-C) er velkendt for at spille en afgørende rolle i patogenesen af CAD, og en sænkning af plasma-LDL-C resulterer i en betydelig reduktion af morbiditet og mortalitet i forbindelse med CAD . Det er imidlertid blevet rapporteret, at mange personer stadig lider af CAD på trods af, at de terapeutiske mål for LDL-C-niveauet er nået . Der gøres derfor en indsats for at identificere andre modificerbare risikofaktorer for yderligere at reducere risikoen for CAD. Populationsgenetiske data er fri for forveksling og omvendt årsagssammenhæng og anerkendes derfor som en vigtig måde at identificere nye potentielle risikofaktorer for CAD.

Interessant nok er det blevet påvist, at genetisk reducerede plasma apoC3-niveauer var forbundet med nedsat risiko for CAD hos mennesker . En nonsense-mutation i APOC3-genet, R19X, var forbundet med en 50% reduktion af cirkulerende apoC3-niveauer . Endnu vigtigere er det, at bærere af den sjældne variant R19X havde en lavere forekomst af forkalkning af kranspulsårerne og en lavere Framingham 10 års risiko for CAD . Den kardiobeskyttende effekt af R19X og tre andre sjældne varianter, to splejsningsstedsmutationer (IVS2 + 1G → A; IVS3 + 1G → T) og en missense-mutation (A43T) i APOC3-genet, blev for nylig bekræftet i to store undersøgelser . I en undersøgelse som en del af Exome Sequencing Project of the National Heart, Lung, and Blood Institute , var ca. 1 ud af 150 deltagere heterozygot bærer af mindst en af disse fire mutationer, og de cirkulerende niveauer af APOC3 hos bærere var 46 % lavere end niveauerne hos ikke-bærere. Risikoen for CAD blandt 498 bærere af en af de sjældne APOC3-mutationer var 40 % lavere end risikoen blandt 110 472 ikke-bærere. I en kohorte på 75 725 deltagere blev den kumulative forekomst af iskæmisk vaskulær sygdom og iskæmisk hjertesygdom reduceret hos heterozygoter for tab af funktionelle mutationer i APOC3 (R19X eller A43T eller IVS2 + 1G → A) sammenlignet med ikke-bærere, med tilsvarende risikoreduktioner på 41 % og 36 % . Bemærkelsesværdigt er det blevet rapporteret, at der også var en tendens til færre alvorlige negative kardiovaskulære sygdomsbegivenheder hos patienter med højere apoC32-proteoform, mens disse foreninger ikke blev påvist for de andre apoC3-proteoformer, hvilket tyder på, at apoC32 er mere som en proteoform med tab af funktion .

Kontrært nok var APOA5-varianter, der fører til nedsatte apoA5-niveauer, forbundet med øget CAD-risiko . Foreningen mellem -1131 T > C promotorpolymorfi af APOA5-genet og risiko for CAD er blevet vist i en stor metaanalyse. Odds ratio for CAD var 1,18 pr. C vs. T allel . Desuden har flere uafhængige undersøgelser konsekvent vist, at APOA5-varianter var signifikant forbundet med risikoen for myokardieinfarkt (MI). Raffaele De Caterina et al. fandt en stærk sammenhæng mellem APOA5 -1131 T > C genvarianten og tidlig akut hjertestop . Jorgensen AB et al. viste endvidere genetisk variation i APOA5-genet (c.-113131 T. C, S19 W og c.*31C. T) i forbindelse med en 87 % stigning i risikoen for hjertestop . Do R et al. sekventerede exonerne af APOA5 i 6721 personer med MI og 6711 kontroller. Der blev identificeret 46 unikke ikke-synonyme eller splejsningssted enkeltnukleotidvarianter eller indel frameshifts med allelfrekvens < 1 %. Desuden havde bærere af disse sjældne mutationer i APOA5-genet (1,4 % af tilfældene mod 0,6 % af kontrollerne) en 2,2 gange øget risiko for MI sammenlignet med kontrollerne .

Det er endvidere blevet foreslået, at virkningerne af apoC3 og apoA5 på CAD-risikoen delvist formidles af ændringer i plasma-RC-niveauerne. Wulff AB et al. fandt, at RC medierede 37% af den observerede 41% lavere risiko for iskæmisk vaskulær sygdom og 54% af den observerede 36% lavere risiko for iskæmisk hjertesygdom hos APOC3 loss-of-function heterozygoter i forhold til ikke-bærere . APOA5-genvarianter (c.-1131 T. C, S19 W og c.*31C. T), der fører til genetisk øget RC, er imidlertid forbundet med en øget risiko for MI . På den anden side er APOA5-genvarianter (c.-1131 T. C, S19 W og c.*31C. T) forbundet med stigninger i RC på op til 56 % og med et tilsvarende odds ratio for MI på 1,87 .

Potentiel korrelation mellem apoC3 og apoA5

Da apoC3 og apoA5 regulerer lipidmetabolismen og er forbundet med CAD-risiko på modsat vis, er det rimeligt at spørge sig selv, om de fungerer uafhængigt af hinanden eller samarbejder. Nogle fund fra genetiske mus tyder på et tæt forhold mellem disse to proteiner, selv om der ikke er nogen aktuelle beviser, der viser den direkte interaktion mellem dem. Pennacchio et al. viste, at APOA5-transgene og knockout-mus har et tydeligt nedsat og øget hepatisk apoC3-proteinniveau, mens der ikke er fundet nogen signifikante ændringer i apoC3 mRNA-indholdet. Faktisk var apoC3-proteinmængden i leveren forøget med 90 % hos APOA5 knockout-mus og faldet med 40 % hos APOA5-transgene mus sammenlignet med vildtype-kuldemødre. På samme måde blev der observeret et fald i apoC3-niveauet i serum efter adenovirus-medieret overekspression af human APOA5 hos mus . Disse fund antydede, at apoC3 kan påvirke apoA5 på transkriptionelt niveau og omvendt. De underliggende mekanismer er imidlertid ukendte.