En kompleks struktur af arrestin-2 bundet til en G-protein-koblet receptor
Funktionel karakterisering og strukturbestemmelse af Arr2-NTSR1 kompleks
Interaktioner af arrestiner til ikke-synlige GPCR er relativt svage og meget dynamiske, men opnåelse af et stabilt kompleks er et vigtigt skridt for strukturelle studier. Derfor karakteriserede vi forud for vores strukturelle undersøgelser interaktionen mellem NTSR1 og arrestiner ved hjælp af det kommercielle NanoBiT-system, som er en effektiv metode til at detektere protein-protein-interaktioner.17 NTSR1 viste sig at interagere med både Arr2 og Arr3, hvilket forstærkes af de øgede koncentrationer af peptidagonist, neurotensin (NTS). Arrestin mutanter med tre C-terminale hydrofobiske rester muteret til alanin (3 A mutanter; I386A, V387A og F388A i Arr2, og I387A, V388A og F389A i Arr3),18,19 som er kendt som præ-aktiveret form af arrestiner, viste øget bindingsaktivitet til NTSR1 (Fig. 1b).
Vi testede yderligere arrestin-NTSR1-interaktion ved hjælp af Tango assay, et cellebaseret assay, der bestemmer bindingsaktiviteter af membranproteiner til opløselige bindingspartnere.7,20 Vores Tango-assays viste, at bindingsaktiviteten af NTSR1 til Arr2 blev øget med henholdsvis omkring to til tre gange, når peptidagonisten NTS eller den lille molekylære agonist ML314, en kendt positiv-allosterisk modulator (PAM),21,22 blev tilsat. Arr2’s bindingsaktivitet til NTSR1 blev forøget med ca. fire gange, når både NTS og ML314 blev anvendt. Bindingen af NTSR1 til Arr2 blev yderligere forstærket ved at indføre 3A-mutationer (Fig. 1c).
Baseret på ovenstående resultater udførte vi strukturelle undersøgelser ved hjælp af 3A-mutanten af Arr2 i kompleks med NTSR1 i tilstedeværelse af NTS og ML314, men komplekset dissocierede i cryo-EM-gitre på grund af de negative virkninger, der er forbundet med vitrificering af prøver. For at overvinde dette dissociationsproblem fusionerede vi den humane wild type NTSR1 med den humane 3A-mutant Arr2 ved dens C-terminus med en tre aminosyre linker (GSA). Cytokrom b562 RIL-domænet (BRIL) blev også fusioneret til receptorens N-terminus for at øge kompleksets ekspression. Arr2 blev yderligere stabiliseret ved at fusionere Fab30 light chain, et antistoffragment, der anvendes til at stabilisere den aktive form af Arr2,23 ved sin C-terminus med en 12 aminosyre linker (GSAGSAGSAGSAGSA). Konstruktionskonstruktionen af fusionskomplekset blev co-eksprimeret med His8-mærkede Fab30 tung kæde og en GPCR-kinase, GRK5, som fosforylerede receptoren for bedre arrestinbinding. Kompleksproteinet blev oprenset ved hjælp af en nikkelaffinitetskolonne i tilstedeværelse af 2 µM NTS og 10 µM ML314, derefter koncentreret og yderligere oprenset ved gelfiltreringskromatografi til strukturelle undersøgelser (Fig. 1d, e, se afsnittet “Materialer og metoder” for detaljer).
Det oprensede BRIL-NTSR1-Arr2-Fab30-kompleksprotein udviste en relativt høj smeltetemperatur (Tm) ved 58 °C bestemt ved termostabilitetsforskydningsassay24 (Fig. 1f). Det udviste en ensartet fordeling, når det blev inspiceret ved negativ farvning EM (Fig. 1g). Enkeltpartikel-kryo-EM-data blev indsamlet med et FEI Titan Krios-mikroskop. Der blev optaget i alt 17 206 mikrobilleder, og over 5 millioner komplekse partikler blev udvalgt og sorteret med henblik på yderligere databehandling. 2D-klassificering identificerede flere konformationer af komplekse partikler. Efter intensiv 3D-klassifikation blev 220 464 partikler (~4,5 % af de samlede oprindelige partikler) udvalgt til strukturrekonstruktion (Supplerende oplysninger, fig. S1). Tæthedskortet viste en gennemsnitlig opløsning på 4,8 Å bestemt ved kriteriet for Fourier shell correlation (FSC) på 0,143, med kernestrukturen bestående af Arr2 og Fab variable region (Fv), der viste et opløsningsområde på op til 4,5 Å (Fig. 2a og Supplerende oplysninger, Fig. S1, S2). Den konformationelle heterogenitet mellem NTSR1 og Arr2 er imidlertid stadig til stede som illustreret i analysen af flere legemer (Supplerende oplysninger, Fig. S3), selv om en meget lav brøkdel af det fulde datasæt blev anvendt i den endelige rekonstruktion.
Strukturel model af Arr2-NTSR1-komplekset. a Elektronetæthedskort over NTSR1-Arr2-Fab30-kompleksets struktur. Mens et rimeligt konturniveau for hele kompleksstrukturen er ca. 0,016, er konturniveauet i dette kort sat til 0,013 for at vise hele micellen. NTSR1 er mærket med brunt, Arr2 med grønt, Fab30 med gråt og micellen omkring NTSR1’s transmembrandomæne-domæne med sølv. b Den overordnede strukturmodel af NTSR1-Arr2-Fab30-komplekset. Centrale strukturelle elementer er markeret med fremhævede bokse for kernegrænsefladen (herunder to grænseflader) og halegrænsefladen mellem receptoren og Arr2. Den samme farvekode som i panel (a) anvendes til komponenterne i komplekset. c Overlejring af NTSR1 med rhodopsin resulterer i forskelligt orienterede kernestrukturer af Arr2 og visuel arrestin, der skærer hinanden i en ret vinkel. Fire visninger af de overlejrede Arr2-NTSR1- og visual arrestin-rhodopsinkomplekser med Arr2 farvet i grønt, NTSR1 i brunt, visual arrestin i magenta og rhodopsin i lilla. PDB-koden for strukturmodellen af rhodopsin-visuel arrestin-komplekset er 5W0P.
Trods moderat opløsning tillod EM-kortet en klar bestemmelse af positionen og orienteringen af NTSR1, Arr2 og Fab30 i kompleksets samling (Fig. 2). Kompleksmodellen blev opbygget ved at docke krystalstrukturen af NTSR1-NTS-komplekset (PDB: 4GRV),14 og strukturen af Arr2 bundet med fosforyleret vasopressin C-terminalt peptid (V2Rpp) og Fab30 (PDB: 4JQI)23 ind i tæthedskortet, efterfulgt af manuel modeljustering, real space refinement og iterative cyklusser af Rosetta refinement og genopbygning af modellen mod EM-kortet25 . Den endelige kompleksmodel indeholder NTSR1-rester fra R49 til T416, hvoraf ICL3 (A270 til P292) og linkerregionen mellem helix 8 og den C-terminale hale (P384 til S404) mangler. Modellen af Arr2 omfatter resterne T6 til M352, og modellen af Fab30 indeholder i alt 409 rester, som omfatter både den lette kæde og den tunge kæde af Fab. Den N-terminalt fusionerede BRIL og det lille molekyle ML314 er ikke synlige i tæthedskortet og er derfor ikke medtaget i kompleksmodellen. Strukturmodellens statistik og geometri er opsummeret i Supplerende oplysninger, tabel S1.
Den overordnede struktur af Arr2-NTSR1-komplekset
Arr2-NTSR1-komplekset dannes ved asymmetrisk samling af de to komponenter, hvor Arr2’s horisontale akse skærer den indre overflade af cellemembranen i ca. 20°, hvilket resulterer i interaktion mellem de hydrofobiske C-kantsløjfer (L191 og M192 og L334 til L338) af arrestin med cellemembranen (fig. 2a, b). Dette er i overensstemmelse med krystalstrukturen af det visuelle arrestin-rhodopsin-kompleks, som for første gang viste den asymmetriske arrestin-GPCR-sammensætning og bekræftede funktionen af arrestinets hydrofobiske C-kantsløjfer som et membrananker, der stabiliserer bindingen af arrestin til den membranindlejrede receptor, hvilket senere blev bekræftet eksperimentelt.7,26,27 Interaktionen mellem Arr2’s hydrofobiske C-kantsløjfer med cellemembranlaget tyder på, at lipidbindingsevnen er en generel egenskab hos medlemmerne af arrestinfamilien.
Trods ligheden i den asymmetriske samling af Arr2-NTSR1-komplekset med Arr1-rhodopsinkomplekset er den relative orientering af arrestin til receptoren dramatisk forskellig mellem disse to arrestin-receptorkomplekser. Overlejring af receptor-TDM’erne i disse to komplekser afslører, at Arr2’s orientering er drejet 90° omkring transmembranaksen i forhold til den visuelle arrestin’s orientering (Fig. 2c). I denne nye orientering er ICL3’s positioner og både TM5 og TM6 af receptoren rettet mod det N-terminale domæne af Arr2, hvilket gør det muligt for ICL3 at ligne den C-terminale hale for at interagere med Arr2’s N-domæne (Fig. 2b).
For at vurdere den konformationelle stabilitet af kompleksets samling udførte vi seks uafhængige, to mikrosekunder lange all-atom molekylær dynamiske simuleringer af Arr2-NTSR1-komplekset uden den stabiliserende Fab30. I hele simuleringsforløbet forblev C-kantsløjfen L334 til L338 i association med membranlipiderne, og NTSR1’s C-terminale hale forblev i interaktion med Arr2’s N-terminale domæne (Supplerende oplysninger, fig. S4 og S5). Arrestin-kernestrukturen kan imidlertid rotere omkring cryo-EM-strukturen i begrænset omfang, og den forlængede fingersløjfe kan løsrive sig fra NTSR1 TMD-kernen (Supplerende oplysninger, fig. S5). Disse simuleringsdata tyder på, at fingersløjfen såvel som kernegrænsefladen mellem Arr2 og receptoren er meget dynamisk, og at Arr2-NTSR1-kompleksets samling, der er indfanget af cryo-EM-strukturen, sandsynligvis repræsenterer en af mange konformationstilstande, hvilket er i overensstemmelse med det faktum, at den konformationsmæssige heterogenitet i Arr2-NTSR1-kompleksets samling stadig eksisterer i partiklerne i den 3D-klasse, der blev anvendt i den endelige cryo-EM-rekonstruktion (Supplerende oplysninger, Fig. S3).
Arr2-NTSR1-kernegrænsefladen
Arr2-NTSR1-komplekset samles gennem intermolekylære interaktioner, der består af to adskilte hovedgrænseflader: en kernegrænseflade bestående af to adskilte pletter mellem arrestinets centrale kammesløjfer og den intracellulære side af receptorens TMD, og en halegrænseflade mellem Arr2’s N-terminale domæne og receptorens C-terminale hale (Fig. 2b). Et stykke af den centrale grænseflade mellem Arr2 og NTSR1 er arrestinens fingersløjfe (fra E66 til L71), som er indsat i det intracellulære hulrum af receptorens TMD og omgivet af ICL1, ICL2, TM5 og 6, af receptoren (fig. 3a). I denne konfiguration danner fingersløjfens øverste overflade en direkte grænseflade med vendingen mellem TM7 og helix 8 i receptoren (Fig. 3a).
Kernegrænsefladefeltet mellem Arr2-fingersløjfen og NTSR1 TMD. a Grænsefladefeltet mellem Arr2-fingersløjfen og det intracellulære hulrum i receptorens TMD. Placeringen af de vigtigste grænsefladerester på arrestin-fingersløjfen og vendingen mellem TM7 og H8 af receptoren er angivet med kugler. NTSR1 er farvet med brun farve og Arr2 med grøn farve. b Disulfidkrydsforbindelsessignaler mellem arrestin-fingersløjferesterne D67 og L68 og receptorresterne V367, S368, A369 og N370 ved vendingen mellem TM7 og helix 8 var stærke. Til sammenligning blev der ikke observeret nogen eller meget svage tværbindingssignaler mellem Arr2-rest L71, som befinder sig i den C-terminale ende af fingersløjfen. c Konserverede negativt ladede rester i fingersløjfen hos Arr2 og Arr3 og visuelle arrestiner. d Overlejring af NTSR1 med rhodopsin resulterer i forskelligt orienterede kernestrukturer (udeladt), men veljusterede fingersløjfer hos Arr2 og visuel arrestin. Rhodopsin er udeladt af hensyn til klarheden. Visuel arrestin er farvet i magenta og Arr2 i grønt.
For at validere grænsefladen i den komplekse struktur udførte vi cellebaserede disulfidkrydsningseksperimenter. I dette sæt eksperimenter blev stedspecifikke cysteinrester introduceret ved grænsefladen af Arr2 og NTSR1. Begge proteiner med cysteinmutationer blev co-ekspresset i celler som separate proteiner. Krydsforbindelsesprodukterne blev dannet ved at behandle cellerne med oxiderende reagens og blev overvåget ved SDS-PAGE efterfulgt af western blotting for at påvise flagmærket, der var fused til Arr2’s C-terminus. Den samme metode er blevet anvendt til at validere den visuelle arrestin-rhodopsin-kompleksgrænseflade.7,9 Der blev udført krydsforbindelsesreaktioner af i alt 177 restpar, blandt hvilke vi observerede stærke krydsforbindelsessignaler mellem Arr2-rester D67 og L68 i det centrale område af fingersløjfen med NTSR1-rester V367 til N370 placeret ved svinget mellem TM7 og helix 8 (Fig. 3b, og positionerne af disse grænsefladerester er præsenteret som kugler i Fig. 3a). Til sammenligning viste rest L71 i den C-terminale ende af fingersløjfen intet eller et meget svagt krydskoblingssignal med disse NTSR1-rester (fig. 3a, b). Flere fingersløjferester viste sig også at krydsbinde med rester ved ICL1 (Q98) og TM6 (R294 og A297), som er komponenter af det intracellulære hulrum i receptorens TMD (Supplerende oplysninger, Fig. S6). Disse krydsforbindelsesdata validerede grænsefladeklappen mellem Arr2-fingersløjfen og receptoren og viste, at arrestin-fingersløjfen tjener som en nøglekomponent i kernegrænsefladen i dette Arr2-GPCR-kompleks.
Aminosyresekvenserne i Arr2-fingersløjfen er beriget med sure rester, svarende til den af visuel arrestin (Fig. 3c), som er kendt for at binde til den positivt ladede TMD-hulrum.7 Når NTSR1 og rhodopsin overlejres, optager Arr2-fingersløjfen af Arr2 det samme rum som det tilsvarende område af visuel arrestin, men den indsættes ikke så dybt i TMD-hulrummet som visuel arrestin (Fig. 3d), hvilket indikerer, at Arr2-fingersløjfens tilknytning til det intracellulære hulrum af NTSR1 TMD kan være mere dynamisk end den mellem visuel arrestin og rhodopsin.
Den anden lap af kernegrænsefladen mellem Arr2 og NTSR1 er interaktionen mellem Arr2’s kamregioner med ICL1 og ICL2 af receptoren, som er forskellig fra den i det visuelle arrestin-rhodopsin-kompleks. I modsætning til de to arrestiners ensartede orienteringer af fingersløjferne efterlod superposition af de to receptorer arrestinernes kernestrukturer i to orienteringer, der adskiller sig med en vinkel på ca. 90°, som vist i fig. 2c. De forskellige orienteringer af Arr2- og visuelle arrestin-kernestrukturer i deres GPCR-komplekser resulterer i forskellige bindingsmåder for arrestinernes kamregioner med receptorernes intracellulære loops, især ICL1 og ICL2, i disse to arrestin-GPCR-komplekser (fig. 2c og 4).
Kernegrænsefladefeltet mellem Arr2 og NTSR1. a Grænsefladefeltet mellem Arr2 og NTSR1, hvor ICL1 af NTSR1 interagerer med både lariat loop og bottom loop af Arr2. Placeringen af grænsefladeresterne er angivet med kugler og valideret ved disulfidkrydsning vist i panel b. b Disulfidkrydsning mellem bundsløjferest G286 i receptoren og ICL1-rester L94, Q95 og S96 i receptoren. c Disulfidkrydsning mellem ICL3-rester af receptoren og rester fra den øverste overflade af Arr2 N-domænens N-domæne. d Disulfidkrydsning af Arr2 N-domæneresterne P14 og K160 med ICL3-resterne Q273, G274, Q275, C277, T278, V279 og G280. e Kernegrænsefladen mellem Arr2 og NTSR1 med en potentiel grænseflade mellem NTSR1 ICL3 (angivet med stiplet linje) og Arr2’s N-domæneoverflade, som antydes af disulfidkrydsningsdata vist i panelerne (c) og (d). Placeringen af de potentielle grænsefladerester på Arr2’s N-domæne er angivet med kugler. Samme farvekode er anvendt som i panel (a).
Strukturel sammenligning af NTSR1 og rhodopsin afslører, at de deler en konserveret TMD-konformation, hvor deres ICL1 antager en forlænget løkke og ICL2 danner en kort helix i deres respektive arrestin-bundne komplekser. ICL2-helixen i rhodopsin er indsat i den kløft, der er dannet af den midterste løkke, den nederste løkke og lariat-løkken i visuel arrestin (kaldet MBL-kløften).7 Den samme MBL-kløft i Arr2 er imidlertid besat af ICL1 i NTSR1 (Fig. 4a) på grund af den forskellige orientering af arrestin. Tilsvarende er ICL2 i NTSR1 roteret væk fra MBL-spalten for at repositionere sig til toppen af lariat-loop’en (Fig. 4a). Disulfidkorsbindingseksperimenter viste korsbindingssignaler mellem receptorresterne L94 til S96 på ICL1 af NTSR1 og rest G286 på den nederste løkke af Arr2, hvilket er i overensstemmelse med grænsefladen mellem ICL1 af NTSR1 og denne kamregion af Arr2 (Fig. 4b).
ICL3 af receptoren, på trods af at den er usynlig i tæthedskortet, danner sandsynligvis en grænseflade med N-domænet af β-arrestin baseret på Arr2-NTSR1-kompleksets konformation (Fig. 2b). Disulfidkorsbindingsdata viste, at ICL3-resterne Q275, C277, T278 og V279 af NTSR1 krydsbindes med resterne T56, T58, V81 og N83 på den øverste overflade af Arr2 N-domænet (Fig. 4c og Supplerende oplysninger, Fig. S6). Disse ICL3-rester viste også stærke krydsforbindelsessignaler med Arr2-rest K160 (fig. 4d). Der blev observeret yderligere disulfidkorsbindingssignaler mellem de fleste rester fra Q273 til G280 i NTSR1 ICL3 og rest P14 fra Arr2 (Fig. 4d). Disse krydsbindingsdata indikerer, at ICL3 af receptoren er placeret tæt på N-domænet og kan interagere med rester på N-domænets overflade af Arr2 (Fig. 4e).
Den Arr2-NTSR1 halegrænseflade
Mens Arr2-NTSR1 kernegrænsefladen er meget dynamisk, synes halegrænsefladen mellem NTSR1 C-terminale hale og Arr2 N-domænet at ligne den i det visuelle arrestin-rhodopsinkompleks9 (Fig. 5). Vi observerede elektrontæthed på et konturniveau på 0,016 (hvor tætheden af den samlede kompleksstruktur kan vises korrekt) af omkring ti C-terminale hale-rester af NTSR1, der binder ved den første β-streng af Arr2 (Fig. 5a). Det er imidlertid vanskeligt at identificere detaljerede oplysninger om denne region af den C-terminale hale, herunder dens specifikke rester, på grund af den begrænsede opløsning af tæthedskortet. Analyser af NTSR1-Arr2-Fab30-fusionsprotein ved massespektrometri (Fig. 5b og Supplerende oplysninger, Fig. S7) afslørede, at syv serin- eller threoninrester fra S401 til T416 på NTSR1 C-terminale hale var fosforylerede, hvilket tyder på en mulig involvering af dette område i bindingen til den positivt ladede overflade af arrestin N-domænens N-domæne. Disulfidkorsbindingseksperimenter viste, at Arr2-resten P14 på den C-terminale tur af den første β-streng krydsbindes stærkt med receptorrester H406 til S410 (Fig. 5d og Supplerende oplysninger, Fig. S6), hvilket indikerede, at receptorrester C-terminalt til H406 sandsynligvis er den region, der binder til arrestin N-domænet (Fig. 5c).
Grænsefladen mellem en C-terminal hale af NTSR1 og den positivt ladede N-domæne af Arr2. a Et samlet EM-kort af den C-terminale hale af NTSR1, der binder ved den første β-streng af Arr2. Tæthedskortet på et konturniveau på 0,016 dækker ca. ti C-terminale hale-rester af receptoren. Receptorens C-terminale hale er farvet med brun farve, Arr2 med grøn farve og EM-kortet med grå farve. b Massespektrometrianalyse af NTSR1-Arr2-Fab30-fusionsprotein viste, at C-terminale rester S401, S403, S404, S409, S410, T413, T416 og Y418 er fosforylerede i proteinprøven. c Halegrænsefladen mellem NTSR1 C-terminale hale og den første β-streng af Arr2. Disulfidkrydsning (vist i panel d) tyder på, at det område af NTSR1’s C-terminale hale, der binder til Arr2’s N-domæne, sandsynligvis befinder sig mellem resterne H406 og L417. De rester, der viser krydsforbindelsessignaler, er mærket på grundlag af krydsforbindelsesdata i panel (d). d Disulfidkrydsforbindelsesdata for P14, ved den øverste overflade af Arr2 N-domænet, med receptorens C-terminale rester H406 til S410; og rest R103 af β-arrestin krydsforbundet med receptorens C-halerest L417.
En model for Arr3-GPCR-interaktion
Det menneskelige genom indeholder to undertyper af β-arrestin: Arr2 og Arr3, som deler over 53 % sekvensidentitet, men som både har nogle overlappende og nogle divergerende funktioner. Da Arr3 viste NTSR1-bindingsaffinitet svarende til Arr2’s (Fig. 1b), ønskede vi at teste, om Arr3’s bindingsmåde til NTSR1 er bevaret med Arr2’s. Vores disulfidkorsbindingseksperimenter viste, at Arr3-fingersløjferesterne E67 til L72 (svarende til E66 til L71 af Arr2) krydsbindes med det tilsvarende sæt rester (A369 og N370) ved svinget mellem TM7 og helix 8 af NTSR1 (Supplerende oplysninger, Fig. S8), hvilket indikerer en bevaret fingersløjfegrænseflade med TM7 og H8 af receptoren mellem disse to β-arrestiner.
Dertil kommer, at disulfidkrydsningsdata viste, at Arr3-rest P15 (svarende til P14 i Arr2) krydsforbindes med resterne N405 til T407 af receptorens C-terminale hale, hvilket tyder på en lignende halegrænseflade mellem Arr3 og NTSR1 (Supplerende oplysninger, Fig. S8). Lignende krydsforbindelsesmønster mellem NTSR1 ICL3-rester og Arr3 N-domænerester, herunder P15 ved C-terminus af den første β-stand og K161 (svarende til K160 af Arr2) på løkken mellem de øverste β-strenge blev også observeret (Supplerende oplysninger, Fig. S8). Tilsammen tyder disse tværbindingsdata på, at den samlede samling af Arr3 med NTSR1 ligner Arr2’s samling af Arr2 med NTSR1 i denne kerneforbundne konfiguration.
En model for β-arrestin-rekruttering af 5-HTR1A og 5-HTR1B
Mange GPCR’er, herunder serotoninreceptorerne 5-HTR1A og 5-HTR1B samt flere dopaminreceptorer, mangler enten eller indeholder en meget kort C-terminal hale, og det foreslås, at de bruger deres ICL3 som en alternativ grænseflade til at rekruttere β-arrestiner.28 5-HTR1A og 1B har lange ICL3’er med flere fosforyleringssteder med henblik på potentiel interaktion med positivt ladede N-domæner af β-arrestiner. Vores biokemiske bindingsassays viste, at begge receptorer bandt til Arr2 og 3 med lignende aktivitet som NTSR1 med Arr2 (Supplerende oplysninger, Fig. S9). Når den visuelle arrestin-rhodopsin-kompleksstruktur blev brugt som skabelon, var det imidlertid vanskeligt at modellere bindingsmåden for den fosforylerede ICL3 af 5-HTR1A eller 1B til den positivt ladede kløft på N-domænet af β-arrestiner. Det skyldes, at TM5 og 6 samt ICL3 af rhodopsin er placeret på det modsatte sted til den positivt ladede overflade af arrestinens N-domæne i den visuelle arrestin-rhodopsin-kompleksstruktur.
Strukturen af Arr2-NTSR1-komplekset viser imidlertid en særskilt kompleks samling med Arr2 roteret 90° fra den visuelle arrestinens position i arrestin-rhodopsin-komplekset (fig. 2c). TM5 og TM6 af NTSR1 er derfor placeret over den forreste overflade af N-domænet af Arr2, hvilket gør det muligt for ICL3 af receptoren (ikke synlig i strukturen) at nå det positivt ladede N-domæne af Arr2 (Fig. 4e). Vores disulfidkrydsningsdata giver bevis for, at NTSR1 ICL3 kan interagere med den positivt ladede kløft i N-domænet af Arr2 og 3 (Fig. 4c-e, Supplerende oplysninger, Fig. S6 og S8). Derfor kan strukturen af Arr2-NTSR1-komplekset tjene som en passende skabelon til at modellere grænsefladen mellem β-arrestiner og 5-HTR1A og 5-HTR1B.
Ved anvendelse af Arr2-NTSR1-strukturen som skabelon og krystalstrukturen af ergotaminbundet 5-HTR1B som en indledende model for 5-HTR1B (PDB: 4IAR),29 genererede vi en Arr2-5-HTR1B-komplekshomologimodel, hvor kernegrænsefladen mellem Arr2 og 5-HTR1B ligner den i Arr2-NTSR1-komplekset (Fig. 6a, b). Vi udførte derefter disulfidkrydsningseksperimenter for at teste den komplekse samling af Arr2-5-HTR1B, der er vist i homologimodellen (Fig. 6c og Supplerende oplysninger, Fig. S10).
Bindingsmåde af Arr2 med 5-HTR1B. a Arr2-5-HTR1B homologimodel baseret på Arr2-NTSR1-komplekset som skabelon. Fremhævet i bokse er kernegrænsefladefelter mellem Arr2 og 5-HTR1B. b Kernegrænsefladefelter mellem Arr2 og 5-HTR1B med grænsefladerester (vist som kugler) valideret ved disulfidkrydsning vist i panel (c). c Disulfidkrydsning mellem restpar på Arr3-5-HTR1B kernegrænsefladefelter. d En tegneseriepræsentation af 5-HTR1B ICL3 udvidet fra TM5 og TM6 med fosforyleringskoderester fremhævet med rødt. e Disulfidkrydsforbindelse mellem restpar ved grænsefladen mellem Arr2 N-domænet og 5-HTR1B ICL3. f En tegneseriemodel til illustration af interaktionen mellem 5-HTR1B ICL3 af 5-HTR1B med Arr2’s positivt ladede N-domæne. Modellen viser interaktionen mellem arrestin og receptorens TMD-kerne og ICL3 samt lipidforankringen af arrestin C-kantsløjferne i arrestin (angivet med en stjerne). Dobbeltpilen angiver arrestin’s konformationssvingning omkring receptorkernen.
Vi observerede krydsforbindelsessignaler mellem fingersløjferesterne D67 L68, V70 og L71 af Arr2 og resterne N373, E374 og D375 ved svinget mellem TM7 og helix 8 af 5-HTR1B (Fig. 6c). Residuerne D67, L68, V70 og L71 i fingersløjfen krydsforbindes med receptorrester R308 og K311 på den indre overflade af TM6 (Supplerende oplysninger, Fig. S10). Disse krydsforbindelsesdata understøttede en konserveret bindingsmåde af Arr2-fingersløjfen med det intracellulære hulrum af 5-HTR1B TM-domænet (Fig. 6a, b). Disulfidkrydsningsdata viste også krydsningssignaler mellem Arr2-resterne R285 og G286 i arrestin-bundsløjfen med ICL1-resten K79 af 5-HTR1B (Fig. 6c og Supplerende oplysninger, Fig. S10). Denne specifikke krydsforbindelse er kun i overensstemmelse med arrestin-orienteringen i Arr2-NTSR1-modellen, men den er ikke forenelig med det visuelle arrestin-rhodopsin-kompleks. Tilsammen understøttede disse krydsforbindelsesdata en kernegrænseflade mellem Arr2-kamregionen og den intracellulære side af 5-HTR1B TM-domænet, som er konserveret med den i Arr2-NTSR1-komplekset (Fig. 6a-c).
5-HTR1B indeholder flere serin- og threoninrester i det centrale område af dets lange ICL3, som kan være fosforyleret til binding til overfladen af det positivt ladede arrestin N-domæne (Fig. 6d). Vi designede cysteinparmutationer i den potentielle grænseflade mellem ICL3 af receptoren og Arr2’s N-domæne og fandt, at ICL3-resterne T268, S295, L298 og E300 blev tværbundet med rester på overfladen af det øverste β-ark, herunder T56, V81, N83, K147 og K157 af Arr2 (Fig. 6e og Supplerende oplysninger, Fig. S10). Residuerne S260 og T268 på ICL3 viste krydsforbindelsessignaler med resterne K11 på den første β-streng og N15 på svinget efter den første β-streng af Arr2 (Fig. 6e og Supplerende oplysninger, Fig. S10). Residue S260 er nær den C-terminale ende af TM5, og dens krydsforbindelse med K11 på den positivt ladede side af Arr2’s N-domæne af Arr2 er kun mulig i Arr2-NTSR1-orienteringen, men ikke i den visuelle arrestin-rhodopsin-orientering, fordi i den visuelle arrestin-rhodopsin-kompleksstruktur er både TM5 og 6 af receptoren placeret på bagsiden af den positivt ladede overflade af arrestin-N-domænens N-domæne.
Vi observerede også et næsten identisk Arr2-krydsforbindelsesmønster mellem 5HTR1A og 5-HTR1B. Der blev observeret tværbindingssignaler mellem fingersløjferesterne D67, L68, V70 og L71 i Arr2 og resterne N404, K405 og D406 (svarende til N373, E374 og D375 i 5-HTR1B) ved svinget mellem TM7 og helix 8 i 5-HTR1A (Supplerende oplysninger, Fig. S11). Residuerne D67 og L68 i fingersløjfen blev også tværbundet med receptorresterne R339 og K342 (svarende til R308 og K311 i 5-HTR1B) på den indre overflade af TM6 (Supplerende oplysninger, Fig. S11). Vi observerede endvidere disulfidkrydsning mellem Arr2-bundlooprester R285 og G286 og ICL1-rest L67 af 5-HTR1A (svarende til K79 af 5-HTR1B) (Supplerende oplysninger, Fig. S11). Disse tværbindingsdata understøtter en lignende kernegrænseflade mellem Arr2 med 5-HTR1A og 5-HTR1B, som er konserveret med den i Arr2-NTSR1-komplekset (Fig. 6a, c).
ICL3 af 5-HTR1A indeholder mere end 100 aminosyrerester (233 til 336) med 12 serin- eller threoninrester, der udgør seks delvise fosforyleringskoder sammen med glutaminsyre- eller asparaginsyrerester (Supplerende oplysninger, Fig. S12). Vi designede cysteinparmutationer for at kortlægge den potentielle grænseflade mellem ICL3 af denne receptor og N-domænet af Arr2. Krydsforbindelsesdata viste, at ICL3-resterne V230, T240, P250, R261, K270 og D285 krydsforbindes med V81 og K160 i Arr2’s N-domæne (Supplerende oplysninger, fig. S11). Rest P14 fra den første β-streng af Arr2 krydsforbindes stærkt med ICL3-rest N300, P308, P315, P318, P321 og R323 af 5-HTR1A (Supplerende oplysninger, fig. S11).Disse krydsforbindelsesdata har sammen med homologimodellen af Arr2-5-HTR1B-komplekset givet et overordnet billede af, hvordan 5-HTR1A og 5-HTR1B rekrutterer Arr2.
I denne artikel rapporterer vi en struktur af Arr2 i kompleks med NTSR1, en klasse A GPCR, ved cryo-EM enkeltpartikelanalyse. Mens bindingsmåden af haleinterfacet mellem receptorens C-terminale hale og den positivt ladede arrestin N-domæne er bevaret med den i det visuelle arrestin-rhodopsinkompleks, viser denne struktur en anden Arr2-orientering end den, der ses i det visuelle arrestin-rhodopsinkompleks. Homologimodellering og kortlægning af grænsefladen ved disulfidkobling viser, at denne kernegrænseflade er bevaret i Arr2-komplekser med 5-HTR1A- og 1B-subfamilien. I disse kompleksmodeller giver orienteringen af Arr2 receptorens ICL3 mulighed for at nå overfladen af Arr2’s N-domæne, hvilket giver mulighed for, at en GPCR, der mangler en C-terminal hale, kan bruge sin ICL3 til at interagere med arrestin N-domænet. Da Arr2 og Arr3 er ubiquitært udtrykte proteinpartnere for signaltransduktion af mange ikke-synlige GPCR’er, har vores strukturelle og biokemiske undersøgelser af Arr2-interaktion med NTSR1- og 5-HTR1-underfamiliens medlemmer givet en alternativ model til forståelse af Arr2’s og Arr3’s interaktion med ikke-synlige GPCR’er.