En lateral flowstrimmel baseret på guldnanopartikler til påvisning af 6-monoacetylmorfin i oral væske

Introduktion

Opioidmisbrug er steget dramatisk i de seneste år og er en vigtig årsag til sygelighed og dødelighed. Ifølge World Drug Report 2017, der er offentliggjort af FN’s Kontor for Narkotika og Kriminalitet, er brugen af opiater og receptpligtige opioider måske ikke så udbredt som cannabis, men opioider er fortsat vigtige stoffer med potentielle skader og sundhedsmæssige konsekvenser . Derfor er det et presserende behov for let og hurtig påvisning af opioider.

Illicit heroinmisbrug er en af de mest almindelige former for opioidafhængighed. Heroin (diacetylmorfin, diamorfin eller Diagesil®) er et halvsyntetisk morfinderivat og et stærkt opioidanalgetikum . Heroinens metabolisme er visualiseret i figur 1 . Heroin hydrolyseres hurtigt til 6-monoacetylmorfin (6-MAM) og til sidst til morfin. Da heroin hydrolyseres hurtigt efter indgift, anvendes dets metabolitter normalt til at bekræfte brugen. Desuden er 6-MAM den eneste specifikke indikator for nyligt heroinmisbrug i forhold til morfin, og det har vakt stor interesse i forskersamfundet.

Der er beskrevet flere metoder til påvisning af 6-MAM, og disse kan inddeles i følgende kategorier: (1) kromatografisk analyse, herunder gaskromatografi og højtydende væskekromatografi ; (2) spektroskopisk analyse såsom Ramen-spektroskopi, infrarød spektroskopi, kemiluminescens , etc.; (3) kapillarelektroforese ; og (4) immunoassay-metoder (antigen-antistof) . Komplekse instrumenteringsteknikker lægger et enormt pres på den grundlæggende screening af lægemidler på grund af behovet for sofistikeret udstyr og professionelle operatører. Laboratoriet er undertiden lukket eller ligger langt væk. Ikke engang politistationer kan rumme dette komplekse og dyre udstyr. En politibetjent skal imidlertid straks vurdere, om et mistænkt materiale indeholder heroin eller ej, og skal reagere hurtigt. Der er således et presserende behov for udvikling af specifikke, pålidelige og enkle metoder til påvisning af ulovlige stoffer i biologiske prøver .

Af metoderne til hurtig påvisning er kolloidale guldnanopartikler (AuNP)-baserede lateralflowstrips (LFS) blevet bredt anvendt til hurtig screening på grund af AuNPs’ størrelses- og afstandsafhængige optiske egenskab, med den første rapport af Mirkin og medarbejdere . Princippet for semi-kvantitative lateral flow-analyser er, at AuNP’ernes røde farve kan ses med det blotte øje fra antigen-antistofkombinationen i løbet af flere minutter . Der findes forskellige kommercielle testkits til påvisning af heroinmisbrug, bl.a. fra NovaBios- og Wondfo-selskaberne. De fleste heroin-screeningskits måler imidlertid kun morfin, men ikke 6-MAM, fordi det er vanskeligt at skelne mellem 6-MAM og morfin. Morfin kan være metaboliseret fra andre stoffer, eller det kan være blevet ordineret. 6-MAM kan entydigt spores til heroin.

Prover omfatter blod, plasma, urin, hår, hår, mundvæske samt i ånde, sved, modermælk, tænder m.m. . De mest almindelige prøver, der anvendes til testning for ulovlig heroin, er blod, urin og mundvæske. Af disse er blodprøven den mest nøjagtige og pålidelige, men den er også invasiv. Urintest er den mest bekvemme og mest udbredte i forbindelse med screening for misbrug af stoffer. Mundvæske anvendes i stigende grad til testning på behandlingsstedet – de er lette at indsamle i offentligheden. Mundvæske er imidlertid meget tyktflydende og har lave koncentrationer af målstoffet; de fleste test anvender derfor urin til 6-MAM-testning. Alle testudviklinger for oral væske vil stå over for det samme problem med hensyn til prøveindsamling og forbedring af følsomheden. En tidligere undersøgelse viste, at 6-MAM ofte påvises i mundvæske. Detektionsstandarden for LFS i 6-MAM i oral væske er 4 ng ml-1 . Her udviklede vi en lateral flow-test for heroin i mundvæskeprøver.

Vi udforskede AuNPs som antistofmærker i en lateral flow-test til hurtig og følsom påvisning af 6-MAM via et kolorimetrisk signal. Først syntetiserede vi 6-MAM og konjugerede det derefter til bovin serumalbumin (BSA) for at gøre det muligt at belægge det på en T-linje. For at overvinde vanskelighederne i forbindelse med mundvæskeprøver blev der desuden valgt typer af nitrocellulosemembraner (NC), opløsningsformlen for prøvepuden og svampeadsorbentpuden for at finde de bedste betingelser for LFS’er til mundvæske. Endelig blev 6-MAM LFS valideret og viste sig at have en fremragende følsomhed og specificitet.

Eksperimentel

2.1. Materialer

Antikroppene mod 6-MAM blev leveret af Bioventure (Shanghai). BSA og polyvinylpyrrolidon (PVP) blev købt hos Sigma (Barcelona, Spanien). Triton X-100, Tetronic 1307 (S9), Ohodasurf On-870 (S17) og STANDAPOL ES-1 (S7) blev købt fra BASF (Tyskland). Destilleret vand (resistivitet 18,2 MΩ cm-1) blev fremstillet ved hjælp af et RephiLe PURIST UV Ultrapure Water-system (Kina). Reel-dispersionssystemet var fra Doyesgo (Kina). Vion IMS Q-Tof-massespektrometeret var fra Waters (USA). Alle standardmaterialer såsom 6-MAM og morfin blev indhentet fra de nationale institutter for fødevare- og lægemiddelkontrol (Kina). Mikroskopet var fra Motic AE2000 (Xiamen, Kina). Alle andre kemiske og immunologiske reagenser, som ikke er specificeret her, var standardhandelsprodukter af analytisk/reagenskvalitet.

2.2. Komponenterne i lateral flow strip

LFS’erne består af et plastunderlag, en svampeadsorberende strimmel (svampepude), en prøvepude, en konjugeret pude, NC-membraner og en absorberende pude. Den svampeadsorberende strimmel er specielt designet til opsamling af oral væske og transporterer hurtigt oral væske ind i prøvepuden. Prøvepuden indeholder et buffersystem og nogle overfladeaktive stoffer. Antistof-AuNP-konjugaterne blev sprøjtet på konjugatpuden for at reagere med prøven og frigøres fra puden og trænge ind i NC-membranen, der er belagt med 6-MAM-BSA på T-linjen og gede-anti-kanin-antikroppe på C-linjen. Den absorberende pude er et filterpapir, der er placeret for enden af strimlen; den opretholder den kapillære strømning. LFS skal blot anbringes i munden eller indsættes i et mundvæskeprøvebæger. En skematisk oversigt over LFS er vist i figur 2. Et skematisk diagram af LFS til 6-MAM-detektion er vist i figur 3.

2.3. Syntese af 6-monoacetylmorfin-kvindeserumalbumin-konjugat

6-MAM blev fremstillet som tidligere beskrevet i forskningsarbejder . Kort fortalt blev morfin først fremstillet ved hydrolyse af heroinalkali. En N-hydroxysuccinimid (NHS)-estergruppe blev derefter tilføjet til 6-MAM-molekylet for at konjugere det til bæreproteinerne (figur 4). Det aktiverede 6-MAM blev sikret ved hjælp af et Waters® Vion IMS Q-Tof-massespektrometer. Derefter blev syntesen udført som beskrevet (figur 5) med visse ændringer. Først blev 80 mg BSA i 6 ml 50 mM kaliumphosphatbuffer (pH = 7,5) afkølet til 0 °C. Derefter blev 20 mg aktiveret 6-MAM i 1 ml vandfri dimethylformamid (DMF) tilsat drypvis ved 0 °C. Blandingen blev opvarmet til stuetemperatur og omrørt natten over. Det resulterende 6-MAM-BSA-konjugat blev dialyseret mod 50 mM kaliumphosphatbuffer (pH = 7,5) med seks bufferskift (mindst 6 timer hver ved 4°C).

2.4. Fremstilling af guldnanopartikler-antistofkonjugater

De 20 nm AuNP’er blev fremstillet via en citratreduktionsmetode . Her blev 2 ml 1% HAuCl4-opløsning tilsat i 100 ml kogende vand under kraftig omrøring, og derefter blev der straks tilsat 2 ml 1% natriumcitratopløsning. Når opløsningen blev rød, blev den kogt i yderligere 15 minutter. Opløsningen blev afkølet til stuetemperatur og opbevaret ved 4 °C til videre brug.

Efter justering af pH-værdien af AuNPs-opløsningen til 9,0 med 0,1 M K2CO3 blev 30 µg 6-MAM-antistoffer tilsat i 10 ml AuNPs-opløsning og inkuberet i 30 min. Derefter blev der tilsat 20 µl 100,0 g l-1 BSA i 15 min for at blokere de reaktive steder. Opløsningen blev centrifugeret ved 3740 g i 15 min, og supernatanten blev re-centrifugeret ved 12 100 g i yderligere 30 min. Alle guldpræcipitater blev blandet og målt for at identificere den maksimale absorbans ved hjælp af UV-visible spektroskopi. Det blev derefter opbevaret ved 4 °C til videre brug.

Den samme metode blev anvendt til at konjugere AuNPs til IgG-antistoffer fra kanin. Ved fremstillingen af konjugatpuden blev antistofkonjugaterne fortyndet til absorbans fem med buffer (0,05 M Tris-HCl indeholdende 10,0 g l-1 BSA, 0,4 % Triton X-100, 5 % trehalose, 10 % saccharose, pH 8,2). Endelig blev 500 µl af blandede AuNPs-antistofkonjugater sprøjtet på en 20 mm2 glasfiber og derefter tørret ved 37 °C natten over.

2.5. Fremstilling af belagt nitrocellulosemembran

For at fremstille lateral flow-teststriben blev 6-MAM-BSA-antigener (0,6 mg ml-1) fordelt på NC-membranerne som testlinjer (T-linje). Kontrollinjerne (C-linje) blev belagt med polyklonale gedeanti-kanin-antiklonale antistoffer (0,15 mg ml-1). De belagte NC-membraner blev tørret ved 37 °C natten over. Ni kommercielle NC-membraner fra fire virksomheder blev evalueret: Millipore (HF90, HF135 og HF180), GE-Whatman (FF120HP og AE100), Sartorius (CN95 og CN150) og Pall (Vivid90 og Vivid170).

2.6. Sensitivitet og specificitet

Strimlen er en kompetitiv test, og begge positioner havde 6-MAM-strimler. Når prøven indeholder 6-MAM, binder den til det nanogoldmærkede antistof på den konjugerede pude. Overskydende antistoffer fortsætter med at bevæge sig langs den kromatografiske retning som følge af kapillær virkning og binder derefter til 6-MAM-antigenet på T-striben. T-linjens signalintensitet er direkte relateret til 6-MAM-koncentrationen i prøven. En mørkere farve angiver en lavere 6-MAM-koncentration.

Negativ mundvæske blev indsamlet fra seks personer og tilsat 6-MAM (400, 100, 40, 10, 4, 1, 0,4, 0,4, 0,1 ng ml-1) med henblik på følsomhedsdetektion. Ti almindeligt misbrugte stoffer blev anvendt til at verificere LFS’ernes specificitet. Disse stoffer var morfin (MOP, 100 µg ml-1), kodein (COD, 100 µg ml-1), tetrahydrocannabinol (THC, 10 µg ml-1), methylendioxymethamfetamin (MDMA, 100 µg ml-1), ketamin (KET, 100 µg ml-1), methylamfetamin (MET, 100 µg ml-1), kokain (COC, 100 µg ml-1), metadon (MTD, 100 µg ml-1), efedrin (EPH, 100 µg ml-1) og pseudoephedrin (PEPH, 100 µg ml-1).

Resultater og diskussion

3.1. Syntese af 6-monoacetylmorfin-bovin serumalbumin-konjugat

NC-membraner er normalt først belagt med et bærerprotein før konjugering af antistof. Der anvendes linkere for at bevare den strukturelle specificitet. Her blev der først tilføjet en NHS-estergruppe til 6-MAM-molekylet som en linker til bæreproteinet. Dette blev valideret med et Waters® Vion IMS Q-Tof-massespektrometer. Vi fandt en bred top i UPLC-kromatogrammerne (ultra-performance liquid chromatography) af aktiveret 6-MAM ved 8,8 min med en m/z på 706.27645 (figur 6) i forhold til en forudsagt m/z på 706.2758. Dette viser, at det lykkedes at binde linkeren til 6-MAM. Betydningen af en præcis syntese er indlysende, fordi kun strukturen er korrekt fastlagt, og dette kan føre til parring med 6-MAM-antistoffer.

Vi anvendte ikke gradient dimethylsulfoxiddialyse, fordi produktet er opløseligt, og den tidligere konjugeringsprotokol er for kompleks. BSA havde flere toppe i UPLC-kromatogrammet (data ikke vist) på grund af de forskellige analoger. Dette førte til en række konjugationsforhold. Der var derfor forskellige toppe i UPLC-kromatogrammet svarende til de forskellige konjugationsforhold. Konjugationsresultaterne kunne mere effektivt bekræftes ved hjælp af antigen-antistofparring end ved hjælp af konjugationsforholdet.

3.2. Typer af nitrocellulosemembranudvælgelse

NC-membraner binder proteiner elektrostatisk via vekselvirkninger mellem nitratesterens stærke dipol og den stærke dipol i proteinets peptidbindinger. Egenskaberne, herunder kapillærstrømningshastighed, signalintensitet og baggrund, blev evalueret, fordi de kunne påvirke LFS’ens endelige ydeevne. Desuden blev der lagt mere vægt på flowhastigheden, fordi den kan påvirke proteinadsorptionskapaciteten og endda følsomheden. En membrans flowhastighed afhænger af de samlede egenskaber ved de porøse strukturer såsom porestørrelse, porestørrelsesfordeling og porøsitet. En større porestørrelse fører til svagere proteinadsorption.

Vi sammenlignede ni NC-membraner (tabel 1). Hver test blev gentaget tre gange, og det gennemsnitlige resultat blev registreret. LFS-resultaterne blev målt på 3 min, og den bedste prøveflowhastighed var under 20 s cm-1. Signalintensiteten ved T-linjen var også nødvendigvis på det normale niveau. En dybere baggrundsfarve hindrede nøjagtigheden. Millipore-membranen HF135 var det bedste valg til 6-MAM efter en omfattende overvejelse af prøveflowhastighed, signalintensitet ved T-linjen og baggrundsfarve.

3.3. Prøvepuden

Løsningen til behandling af prøvepuden er meget vigtig for testen, fordi den tjente som reaktionsbuffersystem, når de orale væskeprøver rehydrerer puden. Opløsningen omfatter normalt et buffersystem med korrekt ionstyrke og pH-værdi; nogle blokerende materialer og overfladeaktive stoffer kan fremskynde oralvæskens strømningshastighed på membranen. Prøvepuden håndterer kompleksiteten af mundvæskens matrixeffekter og gør den kompatibel med NC-membranen. Desuden sikrer buffersystemet frigivelsen af analytter og stabiliserer strømningshastigheden, fordi den orale væske er for viskøs.

Fire forskellige formler blev overvejet. Opløsningsformlerne er angivet i tabel 2. Resultaterne viste, at buffersystem 4 med det overfladeaktive stof STANDAPOL ES-1 (S7) gav den bedste ydeevne ved en prøveflowhastighed på 17 s cm-1 med en normal signalintensitet og en hvid baggrund. Overfladeaktivt stof S7 er et stærkt anionisk overfladeaktivt stof, der giver en stærkere vaskeevne end S17 og S9.

3.4. Opsamling af mundvæske

Oralvæske er vanskeligere at opsamle end urin på grund af deres høje viskositet. Der findes mange former for udstyr til opsamling af mundvæske: vatpinde, svampe, plastikrør og kopper. Nogle metoder stimulerer mundvæske via eddike, mundskyllevæske, sugetabletter osv. En sådan stimulering kan imidlertid ændre koncentrationen af analytter i mundvæsken og er mere kompliceret og tidskrævende. Vi opsamlede endelig mundvæske direkte fra munden ved hjælp af et svampeadsorbent (ESSENTRA, UK), som er en blanding af polymerfibre med en passende porestørrelse.

To slags svampeadsorbenter (K1 og K2) blev specialdesignet, og strukturerne af begge svampebindinger er vist i figur 7. K2 var meget løsere og regelmæssig i forhold til K1. Begge blev evalueret ved at teste væskehåndteringsevnen, herunder ved at tabe vand på svampepuden, lægge den endelige LFS i den negative kaliumphosphatbuffer (pH = 7,0) og lægge den endelige LFS i munden. K2-svampen havde en dobbelt så hurtig prøveflowhastighed (gennemsnitlig 20 s cm-1 ) som K1-svampen for vand, PBS-buffer eller ægte mundvæske. Dette er et meget vigtigt spørgsmål i forbindelse med testning af mundvæske. Konklusionen er, at K2 blev valgt på grund af dens fornemme ydeevne ved håndtering af prøver af mundvæske.

3.5. Følsomhed og specificitet

Små molekyler påvises normalt ved hjælp af en kompetitiv analyse i LFS’er. Her er der intet signal (rød linje) i T-linjen. Dette repræsenterede en koncentration af 6-MAM i prøven, der ligger over cut-off-værdien. Følsomheden for testning af oral væske bør være meget højere end for urintest på grund af den lave koncentration af stofskifteprodukter i oral væske. Her er det lykkedes os at lave en kvalitativ LFS for 6-MAM med en følsomhed på 4 ng ml-1 , hvilket opfylder kravene til generelle detektionsgrænser for oral væske . Resultaterne er vist i figur 8. Desuden viser figur 9 specificiteten i forhold til de almindeligt misbrugte stoffer. LFS for 6-MAM var specifik for 6-MAM uden krydsreaktion især med morfin eller kodein.

Konklusion

6-MAM er den specifikke metabolit af heroin. Vi rapporterer her en LFA for 6-MAM via et særligt konjugat parret med et specifikt antistof. Vi fremstillede et konjugat, der knyttede 6-MAM til bæreproteinet via en NHS-estergruppe i C3-positionen (figur 10). Her identificerede antistoffet acetylgruppen i 6-MAM. Dette er en forudsætning for specificitet for 6-MAM. Endelig fremstillede vi en meget følsom LFS-test uden krydsreaktion med 10 almindeligt misbrugte stoffer, herunder morfin og kodein. Vi identificerede de rette NC-membraner, prøvepude, porestørrelse og svampeadsorbent til at lave en test, der anvender orale væsker på plejetidspunktet.

Med ovenstående fordele kan 6-MAM LFS til oral væskeprøve anvendes til både forskning og industriel brug. Den kunne hjælpe politiet med at spare arbejdskraft og tid/omkostninger ved den indledende screening. Mundvæske er praktisk og mindre invasiv og er velegnet til trafikscreening. Det kan konkluderes, at en LFS for oral væske for heroinmisbrug rettet mod 6-MAM er et lovende produkt til bekæmpelse af narkotikapåvirket kørsel.

Etik

Anvendelsen af heroinprøverne til forskning blev overvåget af det tredje forskningsinstitut under det kinesiske ministerium for offentlig sikkerhed. Alle forfattere erklærer, at de er i overensstemmelse med de etiske standarder.

Datatilgængelighed

Data er deponeret i Dryad Digital Repository: https://doi.org/10.5061/dryad.8r36rp3 .

Forfatternes bidrag

L.Z. udtænkte denne undersøgelse, og X.H og J.Z. hjalp med at udføre eksperimenterne i figur 4 og 5. F.C. og Y.Z. udførte undersøgelserne i figur 6. J.L. analyserede dataene og skrev artiklen. Alle forfattere gav deres endelige godkendelse til offentliggørelse.

Konkurrerende interesser

Vi erklærer, at vi ikke har nogen konkurrerende interesser.

Finansiering

Der er ikke modtaget nogen finansiering til denne artikel.

Disclaimer

Alle udtalelser, resultater og konklusioner eller anbefalinger, der kommer til udtryk her, er forfatternes egne.

Fodnoter

Denne artikel er blevet redigeret af Royal Society of Chemistry, herunder bestilling, peer review-proces og redaktionelle aspekter frem til accept.