Frontiers in Cellularand Infection Microbiology

Introduktion

Bacteroides fragilis, som findes i menneskers og husdyrs gastrointestinale flora, er en anaerobe bakterie. Den er en af de fremtrædende humane kommensaler og en af de mest almindelige isolerede Bacteroides-bakterier fra de kliniske prøver, som forårsager diarré, peritonitis, intraabdominale abscesser, sepsis og endogene purulente infektioner (Sears et al., 1995, 2014).

Det er blevet vist, at B. fragilis forebygger inflammatoriske tarmsygdomme hos dyr med colitis på grund af produktion af det immunmodulerende molekyle polysaccharid A (PSA), der inducerer et antiinflammatorisk immunrespons i tarmvævet (Mazmanian et al., 2008; Lee et al., 2018). B. fragilis’ patogenicitet skyldes flere faktorer, herunder kapslen, ydre-membranproteiner (OMP’er) og særlige enzymer, der omfatter en 20 kDa metalloprotease kaldet Bacteroides fragilis-toksin (BFT) (Sears et al, 1995, 2014).

BFT-producerende B. fragilis, enterotoxigene B. fragilis (ETBF), har været kendt som årsag til diarrélidelser hos mennesker og dyr (Myers et al., 1987; Purcell et al., 2017). ETBF er kendt som en risikofaktor for inflammatorisk tarmsygdom (IBD), og den er til stede i afføringsprøver og biopsiprøver fra patienterne (Prindiville et al., 2000; Basset et al., 2004; Zamani et al., 2017). BFT-ekspression er afsløret for at kløve ekstracellulært domæne af E-cadherin, som er en vigtig strukturel bestanddel af zonula adherens og er ansvarlig for celleadhæsion. Desuden kan BFT aktivere B-catenin-signalering og inducere IL8-sekretion i koloniale epithelceller (Wu et al., 1998). En undersøgelse indikerede, at efter BFT-behandling af HT29/C1-celler, initierede tab af membranassocieret E-cadherin den nukleare lokalisering af ß-catenin, hvilket inducerede c-myc-oversættelse og førte til vedvarende cellulær proliferation (Wu et al., 2003). BFT’s styrke og dens indflydelse på gastrointestinal epithelstruktur og fysiologi tyder på, at tilstedeværelsen af ETBF kan bidrage til kroniske colonsygdomme, herunder onkogen transformation, intestinal inflammation, kroniske coloniske dysfunktioner og colorectale prækancerøse og kræftlæsioner (Wu et al., 1998, 2003; Sears et al., 2014).

Kolorektal cancer (CRC) er en af de mest udbredte kræftformer på verdensplan og udgør 9 % af alle kræftformer, og det er den fjerde årsag til kræftrelaterede dødsfald på verdensplan (Sears et al., 1995; Ferlay et al., 2015). Der er imidlertid en betydelig forskel mellem landene i aldersstandardiseret forekomst af denne kræftsygdom; incidensen i USA og europæiske lande er mere end 25 gange så høj som i afrikanske og asiatiske lande. Sygdoms- og dødelighedsprocenten for CRC er faldet i de seneste år på grund af forbedrede screeningstests, der kan opdage kolorektalmodifikationer på tidligere stadier, og forbedringer i medicinering og procedurer (Boyle og Langman, 2000; Rafiemanesh et al, 2016).

CRC er en af de mest almindelige kræftformer i Iran og er den tredje mest almindelige kræftform blandt iranske mænd (8,1-8,3 pr. 100.000 indbyggere) og den fjerde mest forekommende kræftform blandt iranske kvinder (6,5-7,5 pr. 100.000 indbyggere) (Moghimi-Dehkordi et al., 2008; Kolahdoozan et al., 2010). Risikofaktorerne for CRC er fedme, stillesiddende livsstil, fedtholdig kost, lav grøntsags- og frugtkost, rygning, alkoholmisbrug og ikke-steroide antiinflammatoriske lægemidler (NSAID’er). Kronisk inflammation, IBD, polypper, adenomer og dysplasi forårsager ændringer i tyktarmens celler og gør dem kræftfølsomme (Boyle og Langman, 2000; Johnson et al., 2013).

Forekomsten og dødeligheden af CRC er faldende i udviklede vestlige nationer, mens forekomsten er stigende blandt begge køn i løbet af de sidste årtier i Iran på grund af livsstilsændringer og kostændringer. En anden årsag til dette fald kan være stigningen i antallet af faciliteter og forbedring af udstyr og teknologi, da flere mennesker henviser til sundhedsfaciliteter til screening, mens en person tidligere kunne have haft en kræftsygdom og endda være død, men kræften blev ikke diagnosticeret på grund af mangel på udstyr og faciliteter (Malekzadeh et al., 2009; Siegel et al, 2014).

I denne undersøgelse blev hyppigheden og overflod af ETBF i biopsiprøver fra patienter med CRC og prækancerøse tilstande sammenlignet med dem fra personer uden personlig eller familiær historie af kolorektal sygdom for at undersøge sammenhængen mellem tilstedeværelsen af BFT og tumorudvikling.

Materiale og metoder

Patienter og prøver

I denne case-kontrolundersøgelse blev der indsamlet 120 slimhindebiopsier fra iranske patienter med prækancerøse og CRC-tilstand (n = 68) og kontrolgruppe (n = 52) ved hjælp af koloskopi. Patienter med prækancerøse (Serrerede læsioner, Adenom omfatter lavgradsdysplasi: LGD og højgrads dysplasi: HGD) og kræfttilstande (Colorectal Cancer: CRC), som blev henvist til Imam Khomeini hospitalet i Teheran mellem marts 2015 og jan 2017, blev udvalgt til at deltage i denne undersøgelse. Den etiske komité ved Teheran University of Medical Sciences godkendte undersøgelsesprotokollen. Desuden blev der indhentet informeret samtykke fra alle deltagere. Alle patienter blev diagnosticeret på baggrund af kliniske symptomer samt histologiske og radiografiske standarder, som viste typiske træk med særlig fordeling (Swiderska et al., 2014). Alle data om alder, køn og type af læsioner blev hentet fra patientjournalerne. Alle de patienter, der indgår i undersøgelsen diagnosticeret på tidspunktet for koloskopi og kemoterapi startede ikke for at behandle dem.

I samme periode blev 52 sunde kontroller, uden personlig eller familiær historie af diagnostisk kolorektal sygdom, hvis alder og køn matchede med patienternes, inkluderet i undersøgelsen som kontroller. En nyere historie med diarré og IBD var et udelukkelseskriterium for kontrollerne. Ingen af de personer, der deltog i undersøgelsen, brugte antibiotika eller probiotika inden for de sidste 3 måneder. Alle prøverne blev opbevaret i sterile beholdere med thioglycollatmedium (Merck, Tyskland) og transporteret til laboratoriet i anaerob tilstand med henblik på øjeblikkelig behandling. Der blev også indsamlet 2 slimhindebiopsier fra hver patient til dyrkning og DNA-udtrækning.

Bakteriekultur

To glashomogenisatorer blev anvendt til mekanisk opløsning og homogenisering af alle biopsier; derefter blev de dyrket på Bacteroides Bile Esculin agar (BBE) (Himedia Laboratories Pvt. Ltd, Indien) medium. I denne undersøgelse blev Anoxomat-systemet (MART Microbiology Drachten, Nederlandene) anvendt til at tilvejebringe gasformige atmosfæriske forhold for anaerobe bakterier; derefter blev pladerne inkuberet i et anaerobt kammer ved 37 °C i 72 timer. Desuden blev B. fragilis bekræftet ved hjælp af realtids-PCR-metoden.

DNA-ekstraktion

DNA blev ekstraheret direkte fra biopsivævet ved hjælp af RTP® Mycobacteria Kit (Invitek, Berlin, Tyskland). Den optiske tæthed (OD) af det ekstraherede DNA blev bestemt ved 260 nanometer. Derefter blev DNA’et opbevaret ved -20 °C med henblik på efterfølgende analyse og realtids-PCR.

Realtids-PCR

Sekvenserne af bft- og 16S rRNA-genet blev genfundet fra Genbanken. Primerne og proberne blev designet ved hjælp af primer 3 plus (http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi). Alle de primere og prober, der blev anvendt til påvisning af alle bft-gen-typer, var blevet designet i vores tidligere undersøgelse (Zamani et al., 2017). For at detektere bft-gen-subtyperne blev realtids-PCR udført som tidligere beskrevet (Merino et al., 2011).

Det genomiske DNA fra ETBF-stamme D-134 og RIGLD-klon 1 blev anvendt som positive kontroller (Rashidan et al., 2018). Den negative kontrol var PCR TaqMan master mix med destilleret vand i stedet for DNA.

Standard-DNA blev fremstillet til amplifikation, og antallet af molekyler af skabelonen pr. gram blev beregnet ved hjælp af den definerede formel (Zamani et al., 2017). Standardkurven for bft og 16S rRNA-genet blev vurderet ved hjælp af hver primer og sonde med en 10-foldig seriel fortynding af B. fragilis DNA-prøver, svarende til 101-106 middelværdi pr. gram biopsier.

I overensstemmelse med standardkurven og y-interceptet blev prøver, der ikke viste det fluorescerende signal tidligere end Ct på 38, bestemt som negative. Desuden blev prøver, der producerede fluorescens med en Ct-værdi ≤ 10, fortyndet. Realtids-PCR’ens effektivitet blev bestemt som E = 10(-1/slop) – 1 (Zamani et al., 2017).

Efter optimering af standardkurverne blev fortyndingsserien sat ind i hver amplifikationskørsel. Realtids-PCR-tests blev evalueret ved hjælp af LinGene K Real Time PCR-værktøjet (Bioer, Hangzhou, PR, Kina). Alle test blev udført i et volumen på 25 μL (Zamani et al., 2017). For at sikre kvaliteten blev alle eksperimenter gentaget for anden gang uafhængigt af hinanden, og midlerne blev rapporteret.

For at kontrollere PCR’ens specificitet og produktets forventede størrelse blev primerne anvendt i en konventionel PCR, og amplikonerne blev kørt på agarosegel. Desuden blev specificiteten af de positive amplificerede fragmenter bevist ved sekventering. PCR-produktet blev sendt til Macrogen Corporation i Sydkorea med henblik på sekventering. Sekventeringsresultaterne blev analyseret med Chromas 2.6-softwaren. Derefter blev alle sekvenserne sprængt i NCBI-databasen (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). I alle de sekventerede isolater var procentdelen af lighed med de beslægtede gener (16s rRNA-genet og bft-genet), der findes i NCBI-databasen, mere end 95 %.

Statistisk analyse

Resultaterne blev sammenlignet ved hjælp af Fisher’s exact-, Chi square- og Mann-Whitney-test. P < 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Der blev også beregnet middelværdier ± Std. fejl af middelværdien (SEM) for B. fragilis og ETBF. Data blev analyseret ved hjælp af SPSS 13.0 statistisk software.

I denne undersøgelse blev betinget logistisk regression anvendt til at vurdere odds ratioer (OR) og 95% konfidensintervaller. I dette design er odds ratio en konsistent estimator af hastighedsforholdet for CRC, når udsat med ETBF vs. uudsatte emner.

Resultater

I denne undersøgelse blev 68 prøver indsamlet fra CRC-patienter (36 mænd og 32 kvinder; gennemsnitsalder: 55 år; interval: 35-78) og 52 prøver blev taget fra sunde kontroller (HC) (30 mænd og 22 kvinder; gennemsnitsalder: 56 år; interval: 42-78). Alle patienterne blev diagnosticeret på grundlag af koloskopiprocedurer på tidspunktet for prøvetagningen. Alle patienterne blev diagnosticeret på tidspunktet for koloskopi, hvilket giver i alt 26 patienter med invasiv CRC, 18 patienter med serrerede læsioner, 24 patienter med adenomer, herunder 14 patienter med LGD og 10 patienter med HGD i henhold til den nuværende klassifikation (figur 1). Disse biopsier blev indsamlet fra højre side (ascenderende), venstre side (descenderende) og begge sider hos henholdsvis 22, 32 og 14 patienter (tabel 1).

Resultaterne for B. fragilis-kultur var positive for henholdsvis 31(51%) og 25 (48%) prøver af patienterne og de raske kontroller (tabel 2) (P = 0,7).

I henhold til standardkurven gav fortyndinger af ETBF (kontrolpositiv) DNA ved 101, 102, 103, 104, 105 og 106 Ct-værdier på henholdsvis 15,08 ± 0,1, 18,04 ± 0,2, 21,42 ± 0,2, 25,02 ± 0,2, 28,02 ± 0,4 og 31,96 ± 0,4. Effektiviteten af realtids-PCR’en var mellem 98 og 100 %.

Positive prøver for 16S rRNA-genet og bft-genet var henholdsvis 63 og 47 % hos patienterne. Derimod blev der vist positive resultater i henholdsvis 81 og 3,8 % af HC-prøverne (tabel 3). Forskellen mellem positiviteten af bft-genet hos patienter og HC var statistisk signifikant (P = 0,00).

Også antallet af bft-gener positive prøver i CRC og HC inden for klinisk-patologiske grupper er vist i tabel 3. Den højeste OR blev fundet i gruppen med serrerede læsioner efterfulgt af adenomatøse læsioner med LGD-gruppe. Også OR for alle patienterne (OR 22,22, 95 % CI: 5, 98,74) beskrev forbindelsen mellem ETBF og eksistensen af læsioner.

Resultaterne af den kvantitative analyse af realtids-PCR for 16S rRNA-genet talt for B. fragilis og bft-genet talt for ETBF pr. ng DNA blev vist i tabel 4. Forskellen mellem antallet af kopier af 16S rRNA-genet hos patienter og HC var ikke statistisk signifikant (P ≥ 0,05). Kopiantalet af bft-genet var højere i prøverne fra patienterne end i prøverne fra de raske kontroller (P = 0,00). Desuden var antallet af kopier af bft-genet højere i ETBF-positive prøver i gruppen med forstadieforløbslæsioner sammenlignet med prøverne med CRC; denne forskel var dog ikke statistisk signifikant. Sekventeringsresultaterne bekræftede tilstedeværelsen af bft- og 16S rRNA-generne (datablad 1).

Dertil kommer, at resultaterne af disse prøver viste, at den mest udbredte subtype af bft-genet var bft1 efterfulgt af bft2. Ud af 32 isolater med bft-genet blev 18 (56,2 %) isolater subtypet som bft-1 og 14 (43,7 %) isolater subtypet som bft-2. Desuden blev bft-genet påvist i 2 af HC-prøverne, og de blev alle subtypet som bft-1. Ingen DNA-prøve bar på subtypen bft-3.

Diskussion

Der er stigende beviser for effekten af mikrobiel dysbiose i tarmen, initiering og udvikling af kolorektal cancer (Sears og Garrett, 2014; Gagniere et al., 2016). Selv om incidensen af CRC blev rapporteret lavere i Iran sammenlignet med andre lande, blev det forventet, at dens sats ville stige i fremtiden (Hosseini et al., 2004; Malekzadeh et al., 2009). I tidligere undersøgelser blev det også rapporteret, at ETBF kan have en rolle i forbindelse med diarré og IBD (Myers et al., 1987; Prindiville et al., 2000; Basset et al., 2004; Merino et al., 2011; Purcell et al., 2017; Zamani et al, 2017).

Nogle undersøgelser har antydet, at visse bakteriearter (f.eks. ETBF) kan fungere som patogene bakterier, der afklarer udviklingen af dysbiose i tarmens mikrobielle samfund og udløser CRC (Hajishengallis et al., 2012; Hajishengallis og Lamont, 2016). Den colorectale tumorigenese blev induceret af immunreaktioner og aktivering af proinflammatoriske cytokiner på grund af BFT (Wu et al., 2004, 2009).

Fundene i denne undersøgelse indikerede, at ETBF var signifikant forbundet med de takkede læsioner efterfulgt af LGD. Det højere odds ratio i disse læsioner viste også, at ETBF-eksponering er en risikofaktor for kræfttilstande og især prækancerøse tilstande. Dette understøtter hypotesen om, at BFT-producerende stammer kan spille en vigtig rolle i udløsningen af inflammation og immunologisk respons hos genetisk modtagelige personer og kan føre til CRC. Den første undersøgelse, der påviste en øget forekomst af ETBF i afføringsprøver fra kolorektalcancerpatienter (38 %) sammenlignet med kontrolgruppen (12 %), blev udført af Ulger Toprak et al. (2006). Desuden har nogle tidligere rapporter vist en sammenhæng mellem bft-genet og CRC, især i den sene fase af CRC (Dejea et al., 2014; Boleij et al., 2015; Viljoen et al., 2015). En undersøgelse udført af Purcell et al. viste signifikante associationer af ETBF med tubulære adenomer, serrede læsioner og lavgradsdysplasi, hvilket svarede til resultaterne af den foreliggende undersøgelse (Purcell et al., 2017).

I denne undersøgelse viste forløberlæsioner, herunder dem med lavgradsdysplasi, en stigende tendens i bft-genmængden sammenlignet med dem med CRC; denne forskel var dog ikke statistisk signifikant. Desuden har forfatterne tidligere rapporteret, at ETBF-markører blev observeret i tyktarmen og terminal ileum hos de ulcerative colit-patienter, der er prædisponeret for CRC (Zamani et al., 2017; Rashidan et al., 2018). Tilsvarende blev der i en tidligere undersøgelse kun påvist bft1-subtype af dette gen (Zamani et al., 2017). Selv om bft1-genet var den mest udbredte subtype, blev bft2-genet også fundet i denne undersøgelse.

I denne undersøgelse blev ETBF påvist i læsionerne hos CRC-patienterne, og lignende resultater er også tidligere rapporteret af andre forskere, der undersøgte ETBF i colonslimhindeprøver (Boleij et al., 2015; Viljoen et al., 2015). Nylige undersøgelser af tarmmikrobiomets rolle har vist, at dysbiose i det mikrobielle samfund forekommer i ikke-tumor- og tumorregionerne hos CRC-patienterne (Dejea et al., 2014; Flemer et al., 2017; Purcell et al., 2017). I disse undersøgelser viste, at nogle af bakterierne, herunder Fusobacterium nucleatum, ETBF, Escherichia coli, Streptococcus gallolyticus og Enterococcus faecalis og butyratproducerende bakterier, kan spille vigtige roller i udviklingen af CRC (Dejea et al, 2014; Flemer et al., 2017; Park et al., 2018).

Resultaterne af Real-time PCR til påvisning af B. fragilis viste, at en større procentdel af patienterne og HC indeholdt B. fragilis sammenlignet med kulturmetoden. Guldstandardmetoden til påvisning af bakterier er kulturbaseret, men den kræver et stort antal levedygtige celler, og specielt for anaerobe bakteriekulturer kunne der forekomme nogle begrænsninger. Det kan være, at disse begrænsninger påvirker forskellen mellem resultaterne.

Forskellene i B. fragilis-kulturer og Real-time PCR-resultater mellem kontroller og CRC-prøver er ikke signifikante. Disse data tyder på, at det sandsynligvis er de stammer, der har bft-genet, og ikke B. fragilis i sig selv, der kan bidrage til CRC i denne undersøgelse. Det er blevet vist, at B. fragilis er en fremtrædende human commensal, så denne bakterie kan også isoleres fra sunde kontroller ligesom patienterne. Men hos patienterne med kræft og prækancerøse læsioner steg nogle af de stammer, der indeholder bft-gener, og denne dysbiose kan sandsynligvis fremkalde inflammation. Derudover har nogle undersøgelser vist, at den menneskelige kommensale B. fragilis forhindrede udviklingen af colitis og kan give en effektiv terapeutisk strategi for CRC, mens forskellige undersøgelser tyder på, at enterotoxigene stammer af denne bakterie er forbundet med tarmtumorer på grund af enterotoxinproduktion (Sears et al., 1995, 2014; Mazmanian et al., 2008; Lee et al., 2018).

Der var nogle begrænsninger i denne undersøgelse. Der blev anvendt forskellige metoder til at diagnosticere bft-genet, som blev ekstraheret direkte fra tumorvæv i patienternes tyktarm. Således anbefales det stærkt at gennemføre en stor befolkningsbaseret kohortestudie. Desuden er der behov for yderligere undersøgelser for at bevise en mulig korrelation mellem tilstedeværelsen af bft-genet og serrated læsioner, LGD og CRC.

Konklusioner

Resultaterne af denne undersøgelse tyder på, at ETBF kunne være til stede i slimhindebiopsier hos patienter med prækancerøse tilstande, såsom serrated læsioner og LGD, ud over CRC-patienter. Der blev fundet en signifikant sammenhæng mellem tilstedeværelsen af ETBF i de berørte væv og antallet af disse bakterier i prøverne fra patienterne, især i de prækancerøse kræftfremkaldende læsioner: adenomer med lavgradsdysplasi og serrerede læsioner. Faktisk påvises ETBF oftere i tidlige læsioner, men yderligere forskning med et større antal prøver syntes at være nyttigt for at bestemme præcist.

Det er også nødvendigt med yderligere forskning for at fastslå, om alder, køn, kost og andre miljøfaktorer påvirker ETBF-diagnosen hos mennesker over tid.

Endeligt kunne ETBF være en markør for CRC-prognosen, især i de prækancerøse læsioner, og kunne bruges til at screene disse sygdomme.

Datatilgængelighedserklæring

Råddataene, der understøtter konklusionerne i dette manuskript, vil blive stillet til rådighed af forfatterne uden unødige forbehold til enhver kvalificeret forsker.

Ethisk erklæring

Studierne, der involverer menneskelige deltagere, blev gennemgået og godkendt af den etiske komité for Teheran University of Medical Sciences. Patienterne/deltagerne gav deres skriftlige informerede samtykke til at deltage i denne undersøgelse.

Author Contributions

SZ er førsteforfatter, der udførte alle laboratorieeksperimenter, indsamlede og analyserede data og udarbejdede manuskriptet. RT er den gastroenterolog, der foretog koloskopi og leverede prøverne fra alle tilfælde. LS deltog i undersøgelsens design og koordinering og rådgav i alle dele af undersøgelsen. AS og SJ deltog i indsamlingen af prøverne og udførelsen af testene. MF har ført tilsyn med alle dele af undersøgelsen. Alle forfattere har læst og godkendt manuskriptet.

Funding

Dette arbejde blev støttet af Teheran University of Medical Sciences (Grant No: 32467).

Interessekonflikter

Forfatterne erklærer, at forskningen blev udført i fravær af kommercielle eller økonomiske relationer, der kunne opfattes som en potentiel interessekonflikt.

Anerkendelser

Forfatterne vil gerne takke personalet på Imam Khomeini hospitalet for deres venlige støtte ved indsamling af prøverne.

Supplementært materiale

Det supplerende materiale til denne artikel kan findes online på: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcimb.2019.00449/full#supplementary-material

Datablad 1. Sekventeringsresultater af bft- og 16S rRNA-gener i et isolat.