Frontiers in Pharmacology

Indledning

Biologisk aktive peptider er den generelle betegnelse for forskellige peptider, som udgør forskellige sammensætninger og arrangementer af naturlige aminosyrer. De er kendt for at besidde en række biologiske funktioner som f.eks. antioxidant, immunfremmende, hormonmodulerende, antibakterielle, antitrombotiske, antivirale og antihypertensive aktiviteter på grund af multifunktionelle forbindelser, der stammer fra animalske eller vegetabilske proteiner (Wang et al., 2017). Desuden har de høj fødevaresikkerhed og høj biotilgængelighed, hvilket gør dem til potentielle kandidater til udvikling af funktionelle peptidlægemidler og funktionelle fødevaretilsætningsstoffer (Sarmadia og Ismaila, 2010).

I henhold til Verdenssundhedsorganisationens skøn er CVD ansvarlig for dødeligheden af mere end 17,5 millioner mennesker hvert år. Blandt de vigtige karakteristika ved CVD er hypertension et væsentligt mål for forebyggelse og behandling af CVD (Celermajer et al., 2012). De i øjeblikket anvendte blodtrykssænkende lægemidler som f.eks. captopril og enalapril er begrænset i deres anvendelse på grund af bivirkninger som hoste, udslæt og hovedpine (Yu et al., 2018). Den stadigt stigende forekomst af CVD kræver imidlertid nogle nye og sikre alternativer som f.eks. fødevarebaserede aktive peptider. På det seneste er der gjort betydelige fremskridt med hensyn til identifikation og screening af fødevarekomponenter, som påvirker den kardiovaskulære sundhed positivt (Martinez-Maqueda et al., 2012; Liu et al., 2018). Blandt sådanne forbindelser har peptider fået særlig opmærksomhed på grund af deres antihypertensive virkning. Tidligere er den hypotensive in vitro-aktivitet af peptider primært blevet bestemt ved at måle den hæmmende aktivitet af angiotensin-konverterende enzym (ACE), som er en dipeptidylcarboxypeptidase, der er placeret på cellemembranen og kan forårsage høj skade ved at forstyrre balancen mellem de to hormonsystemer, der regulerer blodtrykket og væskebalancen (Clayton et al., 2015; Gebre et al., 2018). Desuden blev fødevarebaserede antihypertensive peptider bekræftet at udøve en hypotensiv virkning på hypertensive patienter uden nogen toksicitet eller bivirkninger (Martinez-Maqueda et al., 2012). Udskillelse og oprensning af antihypertensive peptider fra fødevareproteiner ville give en ny retning for udvikling af naturlige antihypertensive lægemidler.

Ginkgo biloba frøressourcer er blevet studeret bredt over hele verden på grund af deres bemærkelsesværdige biologiske aktivitet og farmakologiske virkning. Ginkgofrø, som traditionel kinesisk medicin, har en historie på mere end 600 år, men der vides kun lidt om dets vigtigste aktive komponenter. Kun få undersøgelser rapporterede om de antioxidative, anti-mættende og bakteriostatiske virkninger af G. biloba-frøproteinisolat (Lena og Philip, 2002; Huang et al., 2010). Wu et al. (2013) hydrolyserede Ginkgo peptid med alcalase og pepsin for at opnå to antioxidantpeptider med en evne til at fange frie radikaler og hæmme lipidperoxidation. Ginkgo hypotensive peptider skal imidlertid udforskes yderligere for at afdække deres underliggende mekanismer for højere virkning.

Her anvendte vi fire slags proteaser til hydrolyse af GPI for at vælge et af hydrolyserne med høj ACE-hæmmende aktivitet og udføre ultrafiltrering for at opnå komponenter med forskellige MW’er. Virkningerne af MW’er på den ACE-hæmmende aktivitet af GPH’er blev undersøgt. Desuden blev forholdet mellem aminosyresammensætningen og peptidaktiviteten fastslået. De nyekstraherede ACE-hæmmende peptider blev oprenset, identificeret og syntetiseret; deres IC50-værdier blev testet, og peptidhæmningsmønstre ved hjælp af Lineweaver-Burk-plots blev undersøgt. Vi belyste også ACE-hæmningsmekanismen ved hjælp af molekylær docking-analyse.

Materialer og metoder

Materialer

G. biloba L. frøene blev købt fra Linyi by i Shandong-provinsen, Kina. Frøene blev afskallede, afskallede og anvendt til yderligere eksperimenter. Angiotensin I-konverterende enzym og hippuryl-l-histidyl-L-leucin (HHL), hippurinsyre blev købt fra henholdsvis Sigma (St. Louis, MO, USA) og Yuanye Bio-Technology (Shanghai, Kina). Captopril blev indkøbt fra MedChem Express (NJ, USA).

Fremstilling af GPI

G. biloba L.-frøene blev tørret ved 45 °C, derefter knust til pulver og sigtet gennem 80 mesh. Pulveret blev frysetørret efter affenolering og affedtningsbehandling. Det resulterende G. biloba-frøpulver blev opløst i DW (1:20, w/v; pH 10,0). Ovennævnte suspension blev omrørt og ekstraheret i 12 timer efterfulgt af centrifugering ved 10.000 g i 30 minutter. Den opnåede supernatant blev sat til det isoelektriske punkt for ginkgo protein pH 4,62 og inkuberet i 60 min efterfulgt af yderligere centrifugering ved 10.000 g i 30 min. Det opnåede bundfald blev resuspenderet ved hjælp af destilleret vand, og opløsningen blev justeret til pH 7. Derefter blev det opnåede GPI frysetørret indtil næste brug.

Fremstilling af Ginkgo Protein Hydrolyzater (GPHs)

Til dette formål blev 4 % GPI-opløsning fremstillet og hydrolyseret separat med fire proteaser ved deres optimale hydrolysebetingelser i 5 timer. Enzymdoserne var 2.000 U. Efter hydrolysen blev enzymerne inaktiveret ved 90 °C i 10 min, og opløsningen blev centrifugeret ved 3.000 g i 30 min for at opnå de individuelle supernatanter opnået fra fire enzymer.

Grad af hydrolyse

Grad af hydrolyse (DH) blev beregnet ved at henvise til metoden af Kimatu et al. (2017) som følger:

hvor B repræsenterede mængden (mL) af NaOH tilsat for at holde pH konstant under hydrolyseprocessen; Nb var den molære koncentration af NaOH-opløsningen; MP var massen (g) af protein; α betegnede den gennemsnitlige dissocieringsgrad i proteinsubstrater under hydrolyse; htot var det samlede antal peptidbindinger i proteinet.

Isolering og oprensning af ACE-hæmmende peptid

Probe ultrafiltrering blev udført ved hjælp af MSC300 cup type ultrafilter (MoSu, Shanghai, Kina). Prøven blev tilsat fra fødeporten, og nitrogenflasken blev tilsluttet til ultrafiltreringsbægerets slangearmatur. Derefter blev den ultrafiltrerede kop anbragt og pakket på den magnetiske omrører, der var forbundet med nitrogenflasken med et tryk på højst 0,22 MPa. Prøverne blev sekventielt passeret gennem 1, 3, 5 og 10 kDa ultrafiltreringsmembraner, og der blev opnået fire komponenter (<1, 1-3, 3-5 og 5-10 kDa). De fire fraktioner blev opsamlet, frysetørret og derefter anvendt til at teste den ACE-hæmmende aktivitet. Komponenterne med højere ACE-aktivitet blev udvalgt til yderligere oprensning i henhold til den procedure, der er angivet af Zheng et al. (2017). Det frysetørrede hydrolyzat (200 mg), der blev opnået efter ultrafiltrering, blev resuspenderet i renset vand for at opnå en slutkoncentration på 50 mg/mL og underkastet yderligere rensning ved hjælp af Sephadex G-15 gelfiltreringskolonne (1,5 cm × 60 cm). Prøverne blev filtreret med en mikrofiltreringsmembran, og elueringen blev udført med destilleret vand med en strømningshastighed på 1 mL/min. Prøven blev overvåget og separeret ved en bølgelængde på 220 nm ved hjælp af P270 semi-præparativ HPLC (Aixin, Guangzhou, Kina). Fraktioner (7,5 mL hver) blev opsamlet og frysetørret.

Bestemmelse af ACE-hæmmende aktivitet

Denne test blev udført i overensstemmelse med beskrivelserne i den tidligere rapport af O’Loughlin et al. (2014) med nogle ændringer. Kort fortalt blev substratet hippuryl-histidyl-leucin (HHL, 5 mM) og prøverne blandet i 0,1 M Na2 (pH 8,3) med 0,3 M natriumklorid. Derefter blev 50 μL af prøven og 150 μL af substratet tilsat til et centrifugerør, blandet og ladet stå i vand ved 37 °C i 5 minutter. Derefter blev ACE-opløsningen (50 mU/mL) tilsat og inkuberet ved 37 °C i 45 min. Reaktionen blev afsluttet ved at tilsætte 250 μL 1M HCl, og opløsningen blev filtreret gennem et 0,45 μM-nylonsprøjtefilter, inden den blev analyseret ved RP-HPLC (Waters, Milford, MA, USA) på et Inertsil ODS-3 (250 × 4,6 mm, 5 μm partikelstørrelse). Den mobile fase bestod af destilleret vand: acetonitril = 75:25 (V/V, med 0,1 % TFA) med en strømningshastighed på 0,5 mL/min og detektion ved 228 nm. Captopril blev anvendt som kontrol, og den hæmmende aktivitet (%) blev bestemt som nedenfor:

hvor A var toparealet af hippurinsyre med prøven, B var uden prøven.

LC-MS/MS-analyse og identifikation af oprensede peptidsekvenser

De oprensede prøver blev analyseret ved Q Exactive (Thermo Fisher Scientific, MA, USA) ved hjælp af en Easy-nLC 1000 (Thermo Fisher Scientific, MA, USA). Prøven blev afsaltet og lyofiliseret, rekonstitueret i 0,1 % FA-opløsning og opbevaret ved -20 °C indtil næste brug. De to mobile faser var som følger: mobilfase A udgjorde en vandig opløsning af 0,1 % myresyre, og mobilfase B var en vandig opløsning af acetonitril med 0,1 % myresyre (acetonitril var 84 %). Efter at kolonnen er blevet equilibreret med 95% af A-opløsningen, blev prøven indlæst fra autosampleren til Trap-kolonnen. Forholdet mellem masse og ladning af peptidfragmenter blev indsamlet på følgende måde: Der blev indsamlet i alt 20 fragmentmønstre efter hver fuld scanning. Den rå massespektrometriske testfil blev søgt ved hjælp af Mascot 2.2-software til den tilsvarende database.

Syntese af peptider

Potentielle ACE-hæmmerepeptider, der blev identificeret ved LC-MS/MS, blev syntetiseret hos GL Biochem (Shanghai, Kina). Renheden af de syntetiske peptider blev yderligere bekræftet ved HPLC, som var større end 95%.

Kinetik af ACE-hæmning

Den kinetiske hæmningsmodel for G. biloba-peptidet blev testet ved hjælp af metoden af Lin et al. (2017). Kort fortalt fik forskellige koncentrationer af substrat HHL (0,5, 1, 2 og 5 mM) lov til at reagere med ACE. Lineweaver-Burk-plottet var baseret på det reciprokke af reaktionshastigheden (1/v) og substratkoncentrationen (1/). Skæringspunkterne på X- og Y-aksen repræsenterede reciprokkerne af henholdsvis Km og Vmax.

Dockinganalyse

Til dette formål blev der downloadet en tredimensionel strukturfil af ACE-protein (PDB ID: 1O8A) fra RCSB Protein Data Bank (PDB1). Den tredimensionelle struktur af G. biloba-peptiderne blev tegnet ved hjælp af molekylærsimuleringssoftwaren Discovery Studio 3.5. Hydrobehandlingen blev udført, og energien blev minimeret ved hjælp af CHARMM-programmet. Desuden blev Zn2+ bibeholdt i ACE-modellen. DS 3.5-softwaren scorede docking-resultatet i henhold til sin egen scoringsfunktion, baseret på scorerne og den kombinerede frie energi for hvert resultat. Blandt alle resultaterne blev et bedre matchende resultat valgt.

Statistisk analyse

Envejs ANOVA, efterfulgt af Duncans multiple-range-test ved hjælp af SPSS Statistics 20.0 (SPSS, Inc, Chicago, IL, USA) blev anvendt til dataanalyse med en signifikansforskel (P ≤ 0,05).

Resultater

DH og ACE-hæmmende aktivitet af GPH’er

Som det fremgår af figur 1A, blev DH forlænget med tiden under hele hydrolyseprocessen. DH steg hurtigt før 2 h-intervallet, hvorefter stigningshastigheden gradvist aftog med tiden. Generelt var hydrolysehastigheden høj i den indledende 1 time, som derefter blev reduceret eller blev konstant. Blandt de fire proteaser havde alkalase den højeste DH, som nåede 14,7 % efter 5 timer, efterfulgt af trypsin (8,91 %) og dispase (6,91 %). Den laveste DH blev observeret for flavourzyme, som kun var 3,23 % efter 5 h. Disse resultater antydede, at GPI blev spaltet af proteaser på forskellige steder, hvilket resulterede i proteinhydrolyzater med forskellige peptidkompositioner.

Med hensyn til den ACE-hæmmende aktivitet af de fire proteasehydrolyzater blev aktiviteten øget med DH over tidsperioden. Som vist i figur 1B var de hæmmende aktiviteter af alcalase, trypsin, dispase og flavourzyme ved 5 timer henholdsvis 62,70, 39,81, 48,39 og 25,95 %. På grund af deres forskellige spaltningssteder blev der opnået forskellige peptider med forskellige ACE-hæmmende aktiviteter. Blandt dem var aktiviteten af det alkaliske hydrolyzat relativt stærkere, hvilket indikerede, at alkalisk protease effektivt kan producere et hydrolyzat med højere ACE-hæmmende virkning.

ACE-hæmmende aktivitet af GPH’er og membranfraktion

Den ACE-hæmmende aktivitet af GPH’erne og de resulterende fraktioner var signifikant afhængig af MW, som vist i figurerne 1C,D. Ved prøvekoncentrationer på 1 mg/mL steg den hæmmende aktivitet af ACE gradvist, efterhånden som MW for komponenterne blev nedsat. Hæmningsaktiviteten ved 3-5 og 5-10 kDa var henholdsvis 44,94 % (IC50 = 1,257 mg/mL) og 44,04 % (IC50 = 1,765 mg/mL). Efterfølgende steg aktiviteten gradvist med lavere MW og nåede det højeste niveau (69,86 %; IC50 = 0,224 mg/mL) ved <1 kDa.

Purifikation af Ginkgo Peptider

Alcalase anvendes ofte til fremstilling af aktive peptider på grund af dens brede specificitet og stærke evne til at nedbryde proteiner. Fra ultrafiltreringsbehandlingen blev det afsløret, at den ACE-hæmmende aktivitet blev forbedret med faldende MW af polypeptidet. Derfor blev peptidet i fraktionen <1 kDa yderligere oprenset ved hjælp af Sephadex G-15-kolonnen. Det fremgår af figur 2A, at Sephadex G-15 var opdelt i tre komponenter (A1, A2 og A3). De tre komponenter blev opsamlet og lyofiliseret, og deres ACE-hæmmende aktiviteter blev målt. Resultaterne er vist i figur 2B. De ACE-hæmmende aktiviteter af de tre komponenter (1 mg/mL) var henholdsvis 64,08, 58,55 og 74,96 %. Derfor blev den mest aktive A3-komponent udvalgt til strukturel identifikation i det næste trin.

Identifikation af Ginkgo Peptider og Peptidsyntese

For at identificere det potentielle ACE-hæmmende peptid blev den mest aktive komponent A3 analyseret ved LC-MS/MS (Supplerende tabel S1). På grundlag heraf blev tre peptider screenet fra A3-komponenten, og deres aminosyresekvenser var Thr-Asn-Leu-Asp-Trp-Tyr (TNLDWY), Arg-Ala-Asp-Asp-Phe-Tyr (RADFY) og Arg-Val-Phe-Asp-Asp-Gly-Ala-Val (RVFDGAV) (figur 3). De identificerede sekvenser af disse peptider bestod af 5-7 aminosyrerester. For at identificere den ACE-hæmmende aktivitet af disse tre peptidfraktioner blev peptiderne kemisk syntetiseret. De opnåede syntetiserede peptider blev identificeret ved massespektrometri (figurer 4A-C). Resultaterne viste, at IC50-værdierne for TNLDWY, RADFY og RVFDGAV var henholdsvis 1,932, 1,35 og 1,006 mM (figur 4D).

Hæmningsmekanisme for Ginkgo Peptider

Hæmningsmåden for G. biloba-peptidet blev analyseret i henhold til Lineweaver-Burk-plottet. Som det fremgår af figur 5, blev både Vmax og Km ændret, når Ginkgo peptid TNLDWY blev tilsat, Vmax steg med den stigende peptidkoncentration; mens Km ikke ændrede sig signifikant med peptidkoncentrationen, hvilket indikerede, at dets hæmningsmønster kan være en ikke-kompetitiv hæmningsmåde. For RADFY og RVFDGAV ændrede Vmax sig ikke signifikant med koncentrationen; mens Km steg med stigende peptidkoncentration, hvilket indikerer, at begge peptider er kompetitive inhibitorer, som kan binde sig til ACE’s aktive steder, hvorved de blokerer ACE’s binding af ACE til substratet og hæmmer ACE’s aktivitet.

Molekylær docking-simulering mellem peptider og ACE

I denne undersøgelse blev interaktionen af tre peptider med ACE evalueret. Resultaterne viste, at alle peptiderne kunne binde godt til ACE og danne et stabilt kompleks, hvilket indikerer deres anvendelse som en potentiel ACE-hæmmer. Scoren for Cdocker-interaktionsenergi blev vist i tabel 1. Scorerne for TNLDWY-, RADFY- og RVFDGAV-fraktionerne var henholdsvis 102,995, 105,335 og 117,706. Molekylære dockingresultater blev vist i figur 6 og tabel 2. Den optimale dockingposition for TNLDWY kan danne seks hydrogenbindinger, blandt dem dannede den hydrogenbindinger med Ala 354, Tyr523 i S1 aktiv lomme, His353, His513 i S2 aktiv lomme og Zn2+-rester, og den blev fundet stabilt bundet med dem alle. Dette kan være relateret til den stærke ACE-hæmmende aktivitet af peptidet. Det blev observeret fra figur 6B, at RADFY kan danne syv hydrogenbindinger med aminosyrerester og intermolekylære hydrogenbindinger med resterne Gln281, His353, His513 og Tyr520 i den aktive S2-lomme. Dannelsen af disse hydrogenbindinger stabiliserede i høj grad enzym-peptidkomplekset. Desuden dannede RADFY en ionisk binding med Zn2+, konjugerede kræfter med Val380, His383, Glu384, His387, Glu411, Lys511 og Tyr523 samt van der Waals-kraft med aminosyrerest Trp356. Disse interaktioner kan resultere i deformation af Zn2+-liganden og inaktivering af ACE. Sammenlignet med TNLDWY og RADFY kan RVFDGAV danne fire hydrogenbindinger med aminosyrerester, som var stabilt forbundet med ALA354, TYR523 i den aktive lomme i S1 og Glu162 i den aktive lomme i S1′. RVFDGAV kunne imidlertid danne ioniske bindinger med Zn2+, hvilket direkte førte til deaktivering af ACE-molekyler. Desuden dannede det et konjugat med aminosyreresterne såsom Glu162, His353, Glu376, Val379, His387, Phe391, His410, Phe457 og Phe527 (figur 6C).

Diskussion

I de seneste år har fødevareafledte ACE-hæmmende peptider fra planteprotein tiltrukket sig mere og mere opmærksomhed på grund af deres færre bivirkninger. I denne undersøgelse blev alcalase, dispase, trypsin og flavourzyme anvendt til hydrolyse af Ginkgo protein. Den DH- og ACE-hæmmende aktivitet af det Ginkgo proteinhydrolysat, der blev opnået ved hydrolyse af alcalase, blev rapporteret som værende den højeste. Hydrolyseprocessen fandt hurtigt sted i den indledende fase, hvilket resulterede i hydrolyse af mange peptidbindinger, hvorefter hydrolysehastigheden blev bremset på grund af den gradvise reduktion af substraternes tilgængelighed for hydrolyse (Ketnawa et al., 2017; Hu et al., 2018; Wei et al., 2018). Disse resultater var i overensstemmelse med den tidligere rapport om rapsfrøproteinhydrolyzater med effektiv ACE-hæmmende virkning, når de hydrolyseres med alcalase (He et al., 2013).

Angiotensin-konverterende enzym er en multifunktionel ekstracellulær dipeptidase, der findes i forskellige væv. Den hæmmende aktivitet af ACE sænker blodtrykket ved at reducere produktionen af angiotensin II og reducere ødelæggelsen af kininer (Zheng et al., 2017). Den ACE-hæmmende aktivitet af hydrolyzatet var relateret til molekylvægtfordelingen. Ultrafiltreringen blev anvendt til at adskille Ginkgo hydrolyzat i fem komponenter. Ved molekylvægt <1 kDa blev den ACE-hæmmende aktivitet af Ginkgo hydrolyzat rapporteret som den højeste. Denne observation var i overensstemmelse med tidligere undersøgelser, der rapporterede den højere ACE-aktivitet af polypeptider med lav MW-værdi (Wang et al., 2015; Ola et al., 2017). Desuden bekræftede Silvestre et al. (2012), at ultrafiltreringsbehandlingen kan tilbageholde peptider (AAA) ved den C-terminale position for at fremme den ACE-hæmmende aktivitet.

For yderligere at rense det meget aktive ACE-hæmmende peptid blev Ginkgo-komponenten (<1 kDa) separeret ved gelfiltreringskromatografi, og aminosyresekvensen blev identificeret ved hjælp af LC-MS/MS. Der blev således fremstillet tre nye ACE-hæmmende peptider: TNLDWY (1,932 mM), RADFY (1,35 mM) og RVFDGAV (1,006 mM), som viste stærk ACE-hæmmende aktivitet. Ifølge rapporten fra Hernández-Ledesma et al. (2011) var de fleste af de ACE-hæmmende peptider korte sekvenser bestående af 2-12 aminosyrer. Desuden var aktiviteten af det ACE-hæmmende peptid stærkt relateret til tilstedeværelsen af dets C-terminale aminosyre, aromatiske aminosyre og hydrofobiske aminosyre. F.eks. øgede tilstedeværelsen af den aromatiske aminosyre (Tyr, Phe og Trp) i betydelig grad aktiviteten af det ACE-hæmmende peptid. Desuden er Arg også kendt for at spille en vigtig rolle i det hæmmende peptid. Toopcham et al. (2017) viste, at den hæmmende aktivitet af polypeptidet blev reduceret betydeligt efter fjernelse af Arg. Endvidere viste Liu et al. (2018), at aminosyre som Leu i peptidet påvirkede den ACE-hæmmende aktivitet betydeligt uanset dens position ved C-terminus eller N-terminus. Lignende resultater blev også rapporteret af Lee og Hur (2017). Disse undersøgelser rapporterede KPLL-, VLAQYK- og DLP-peptiderne fra forskellige proteinmaterialer med en mærkbar ACE-hæmmende aktivitet i tilstedeværelse af hydrofob aminosyre (Leu). I vores undersøgelse var Tyr placeret ved C-terminus af TNLDWY og RADFY. Desuden indeholdt de to peptider fra RADFY og RVFDGAV Arg ved N-terminus, og indholdet af hydrofobiske aminosyrer i de tre peptider var højere. Frem for alt svarede peptidfragmenterne til de strukturelle karakteristika for ACE-hæmmende peptider.

Den hæmningsmåde af ACE-hæmmende peptider blev observeret generelt ikke-kompetitiv, kompetitiv og blandet. For korte peptider (2-12 aminosyrer) var de fleste af dem kompetitive inhibitorer, og de knyttede sig til ACE-enzymet for at forhindre bindingen af substratet HHL. En lignende undersøgelse af Lin et al. (2017) viste, at peptiderne KYIPIQ og LPLPLPLL fra Qula-kasein udviste en kompetitiv inhiberingstilstand. For ikke-kompetitive inhibitorer binder de imidlertid til andre steder end enzymets substratbindingssted og påvirker i sidste ende substratets binding til enzymet. Lignende mønstre blev observeret i tilfælde af fødevarebårne inhiberende peptider såsom PFPGPIPN fra Qula-kasein og hasselnøddepeptidet YLVR (Lin et al., 2017; Liu et al., 2018). I denne kompetitive tilstand dannede ACE, substrat og peptid et enzym-substrat-inhibitor-kompleks, hvilket forhindrede yderligere frigivelse af produktet og resulterede i et fald i Vmax (Barbana og Boye, 2011).

Undersøgelse af den molekylære interaktionsmekanisme mellem ACE og hæmmende peptider er nyttig for screening og design af nye ACE-hæmmende peptider. Der foreligger imidlertid utilstrækkelige oplysninger om molekylære interaktioner af hæmmende peptider. Molekylær docking er baseret på “lås og nøgle-princippet” for ligander og receptorer og simulerer interaktionen mellem små molekylære ligander og receptorbiomakromolekyler. Bindingsmåden og affiniteten mellem dem gør det muligt at foretage en virtuel screening af lægemidler. ACE er et Zn2+-afhængigt carboxydipeptidenzym, hvor Zn2+ er en vigtig del af det aktive center i ACE (Pina og Roque, 2009). I henhold til tidligere rapporterede data (Pan et al., 2012) blev de vigtigste interaktionsrester på ACE’s aktive center opdelt i tre aktive lommer (S1, S2 og S1′). S1 (Ala354, Glu384 og Tyr523); S2 (Gln281, His353, Lys511, His513 og Tyr520); og S1′ (Glu162-rest). På ACE’s aktive sted udgjorde to histidiner (His383 og His387) sammen med Glu 411 en Zn2+-ligand. Det er blevet rapporteret, at hæmning af peptidinduceret ACE-aktivitet kan opnås ved kombination af hydrogenbindingsstabile enzym-peptidkomplekser (Fu et al., 2017). Desuden kan dannelsen af van der Waals-kræfter med aminosyrerester som His353, Ala 354, Ser355, Glu384, His513 og Pro519, konjugeret interaktion med Tyr360 og ikke-kovalente interaktioner med Glu384, Arg522 også bidrage til stabiliteten af enzympeptidkomplekser. Tilstedeværelsen af disse kræfter vil gøre strukturen af enzym-peptidkomplekset mere stabil, mere befordrende for hæmning af ACE-aktivitet, hvilket kan være årsagen til stærk ACE-hæmmende aktivitet af TNLDWY, RADFY og RVFDGAV.

Konklusion

I denne undersøgelse blev G. biloba frø anvendt til at fremstille potentielle ACE-hæmmende peptider. GPH’er fremstillet af forskellige proteaser udviste forskellig ACE-hæmmende aktivitet in vitro. De højeste DH- og in vitro ACE-hæmmende aktiviteter blev observeret i GPH’er fremstillet af alcalase. De komponenter, der blev fremstillet ved ultrafiltrering med alcalase, viste, at de peptider med mindre MW-værdi gav den stærkere ACE-hæmmende aktivitet. Tre potentielle ACE-hæmmende peptider (TNLDWY, RADFY og RVFDGAV) blev opnået fra peptidfraktionen (<1 kDa) ved hjælp af LC-MS/MS. RVFDGAV viste den højeste ACE-hæmmende aktivitet med en IC50-værdi på 1,006 mM og fremstod som en kompetitiv inhibitor. Molekylære docking-resultater viste, at peptiderne kunne binde fast til ACE og yderligere interagerede med aminosyrerester på det aktive sted for ACE. Vores resultater indikerede, at peptiderne opnået ved enzymatisk hydrolyse af alcalase udviste effektiv ACE-hæmmende aktivitet in vitro, hvilket gør dem til potentielle kandidater til udvikling af funktionelle fødevarer eller antihypertensive lægemidler i fremtiden.

Author Contributions

F-FM, HW, C-KW og KT var involveret i projektdesignet, udførte de fleste af eksperimenterne og udarbejdede manuskriptet. Z-JW og LJ bidrog til den eksperimentelle udformning, udarbejdelse af manuskriptet og indsendelse. Alle forfattere deltog i udarbejdelsen af manuskriptet og/eller reviderede det kritisk for vigtigt intellektuelt indhold.

Funding

Denne undersøgelse blev støttet af de store projekter for videnskab og teknologi i Anhui-provinsen (17030701024, 17030701058 og 17030701028) og centrale forsknings- og udviklingsprojekter i Anhui-provinsen (1704g07020110 og 1804b06020347).

Interessekonflikterklæring

HW var ansat hos Anhui Habopharmqnceutical Co, Ltd. Z-JW var ansat af Anhui Qiangwang Seasoning Food Co., Ltd.

De resterende forfattere erklærer, at forskningen blev udført uden kommercielle eller økonomiske forbindelser, der kunne opfattes som en potentiel interessekonflikt.

Supplementært materiale

Det supplerende materiale til denne artikel kan findes online på: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphar.2018.01579/full#supplementary-material

Footnotes

1. ^ http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do