Integrative genomiske analyser af APOBEC-mutationssignatur, ekspression og germline-deletion af APOBEC3-gener og immunogenicitet i flere kræfttyper

Distinkte mønstre af APOBEC3-gener, forbundet med APOBEC-mutationssignatur i flere kræfttyper

I forlængelse af den tidligere analyse af APOBEC-mutationssignatur målte vi mutationerne ved hjælp af antallet af deaminase C, der var inden for TCW-trinukleotidmotivet ændring til T- eller G-mutationer pr. prøve på tværs af 10 kræfttyper (se Metoder). Vi udførte univariate analyser for at evaluere sammenhænge mellem APOBEC-mutationssignaturen og de overordnede genekspressionsniveauer af APOBEC3A og APOBEC3B. Vi observerede, at APOBEC3A-ekspressionsniveauet var positivt forbundet med APOBEC-mutationssignaturen i i alt seks kræfttyper – blære, bryst, livmoderhals, lunge adenocarcinom, hoved og hals og skjoldbruskkirtel. Der blev ikke observeret nogen signifikante associationer i de resterende kræfttyper, selv om de samme associationsretninger blev observeret (Yderligere fil 1: Tabel S1). Interessant nok observerede vi, at APOBEC3B-ekspressionsniveauet var positivt forbundet med APOBEC-mutationssignaturen i alle kræfttyper, undtagen for pladeformet lungekarcinom (Yderligere fil 1: Tabel S1). I sammenligning med associationerne fra APOBEC3A var APOBEC3B specifikt associeret med APOBEC-mutationssignaturen i mave-, bugspytkirtel- og nyrekræft med henholdsvis P = 5,2 × 10- 11, P = 2,0 × 10- 3 og P = 1,1 × 10- 4 (Yderligere fil 1: Tabel S1). Disse resultater var i overensstemmelse med tidligere undersøgelser . Desuden evaluerede vi også forbindelserne mellem APOBEC-mutationssignaturen og genekspressionen af andre APOBEC3-gener: APOBEC3C, APOBEC3D, APOBEC3F, APOBEC3G og APOBEC3H. Vores resultater viste, at ekspressionerne af disse gener var forbundet med APOBEC-mutationssignaturen varierede i forskellige kræfttyper (Yderligere fil 1: Tabel S2). For eksempel var ekspressionen af APOBEC3C forbundet med øget APOBEC-mutationssignatur i livmoderhals- og hoved- og halskræft, mens dens ekspression var forbundet med nedsat APOBEC-mutationssignatur i mavekræft. Vores resultat viste også, at ekspressionen af APOBEC3D, APOBEC3F og APOBEC3G var forbundet med øget APOBEC-mutationssignatur, mens resultatet af foreningen af APOBEC3G var i overensstemmelse med det tidligere fund . Interessant nok observerede vi, at ekspression APOBEC3H var forbundet med øget APOBEC-mutationssignatur i livmoderhalskræft, men ikke observeret i brystkræft.

Distinct patterns of the isoforms of APOBEC3A and APOBEC3B, associated with APOBEC-mutational signature in multiple cancer types

Vi evaluerede yderligere forbindelser mellem APOBEC-mutationssignatur og ekspressionsniveauer af hver af de isoformer, der er transskriberet fra APOBEC3A og APOBEC3B. I alt seks isoformer blev analyseret, herunder uc003awn og uc011aob transkriberet fra APOBEC3A, uc003awo, uc003awp og uc003awq transkriberet fra APOBEC3B og en anden isoform, uc011aoc, der stammer fra en fusionsbegivenhed, der er involveret i et område, der dækker den sidste introniske del af APOBEC3A til det sidste exon af APOBEC3B (Fig. 1a, b). Vi bekræftede, at isoformerne uc003awn og uc003awo primært blev transskriberet fra henholdsvis APOBEC3A og APOBEC3B (Yderligere fil 1: Figur S1) . Som forventet var foreningsretningen af både uc003awn- og uc003awo-udtryksniveauerne og APOBEC-mutationssignaturen i overensstemmelse med observationerne af de samlede genekspressionsniveauer på tværs af alle kræfttyper (Fig. 1c, d; Yderligere fil 1: Tabel S3). Overraskende nok var ekspressionsniveauet for uc011aoc (APOBEC3A/B) kun positivt forbundet med APOBEC-mutationssignaturen i brystkræft (P = 5,0 × 10- 10) (Fig. 1e; Yderligere fil 1: Tabel S3). Der blev imidlertid ikke observeret nogen associationer for de resterende isoformer i nogen kræfttyper, bortset fra en svag association observeret for uc011aob (APOBEC3A) med hoved- og halskræft (P = 0,02; Yderligere fil 1: Tabel S3).

Ved anvendelse af multiple regressionsanalyser, der omfattede alle isoformer af både APOBEC3A og APOBEC3B, fandt vi, at ekspressionsniveauerne af uc003awn (APOBEC3A) og uc003awo (APOBEC3B) var uafhængigt og almindeligt forbundet med evalueret APOBEC-mutationssignatur i flere kræfttyper: Blære (en marginal sammenhæng for uc003awn), bryst, livmoderhals, lunge adenokarcinom og hoved og hals (tabel 1). Ligeledes blev der observeret en yderligere association for uc011awn (APOBEC3A) i skjoldbruskkirtlen, mens der blev observeret associationer for uc003awo (APOBEC3B) i mave-, bugspytkirtel- og nyrekræft. I overensstemmelse med den univariate analyse blev der observeret en slående association for uc011aoc (APOBEC3A/B) med APOBEC-mutationssignatur i brystkræft (P = 5,3 × 10- 11), og der blev også observeret en yderligere association i lunge adenocarcinom (P = 0,01) (tabel 1). Disse resultater tyder på, at uc011aoc spiller en vævsspecifik rolle med hensyn til at påvirke APOBEC-mutationssignaturen primært i brystkræft, mens uc003awn og uc003awo spiller en allestedsnærværende, men særskilt rolle i hele spektret af kræft hos mennesker. Vores yderligere analyse viste især den positive ekspressionskorrelation mellem isoformen uc011aoc og APOBEC3A på tværs af en lang række kræfttyper, især i brystkræft (Additional file 1: Table S4).

Derudover udførte vi en associeringsanalyse stratificeret efter kliniske undertyper i brystkræft. Vi observerede, at associationerne af isoformerne af uc003awn (APOBEC3A) og uc011aoc (APOBEC3A/B) med APOBEC-mutationssignaturen varierede på tværs af forskellige kliniske subtyper, idet den mest signifikante association blev observeret i LumA-subtypen (Yderligere fil 1: Tabel S5).

Germline APOBEC3A/B-deletion, der påvirker ekspressionsniveauer af isoformer af APOBEC3A- og APOBEC3B-generne

For at undersøge, hvordan germline APOBEC3A/B-deletion påvirker ekspressionen af isoformerne af APOBEC3A og APOBEC3B, identificerede vi først 30 prøver, der forudsiges at bære homozygot deletion, 239 prøver, der forudsiges at bære heterozygot deletion, og 2287 prøver, der forudsiges ikke at have nogen deletion (Yderligere fil 1: Tabel S6, se metoder). Dernæst vurderede vi sammenhænge mellem germline APOBEC3A/B-deletion og ekspressionsniveauerne for hver isoform ved hjælp af univariat analyse (se Metoder). Som forventet observerede vi, at germlinedeletion af APOBEC3A/B var signifikant forbundet med nedsatte ekspressionsniveauer af isoformen uc003awo (APOBEC3B) på tværs af alle kræfttyper ved P < 0,05, undtagen for bugspytkirtelkræft med en P = 0,14. Der blev også observeret signifikante sammenhænge med nedsatte ekspressionsniveauer af uc003awn (APOBEC3A) i tre kræfttyper – blære, bryst og skjoldbruskkirtel (fig. 2; tabel 2). I modsætning hertil viste vores resultater, at germlinedeletion af APOBEC3A/B var signifikant forbundet med et øget ekspressionsniveau af uc011aoc (APOBEC3A/B) på tværs af alle kræfttyper, undtagen mave-, bugspytkirtel- og nyrekræft. For disse var der ingen statistisk signifikans, men havde de samme associationsretninger (Fig. 2; Tabel 2). Især hoved- og halskræft viste den mest signifikante association med P = 3,8 × 10- 65, og bryst- og blærekræft viste den signifikante association med henholdsvis P = 3,0 × 10- 8 og P = 2,9 × 10- 7. Vi udførte desuden den samme analyse stratificeret efter population, og der blev observeret en lignende tendens i disse kræfttyper (data ikke vist). Vores resultater tyder på, at i næsten alle de undersøgte kræfttyper var germline APOBEC3A/B-deletion signifikant forbundet med nedsatte ekspressionsniveauer af uc003awn og uc003awo, men der var et øget ekspressionsniveau af uc011aoc.

Germline APOBEC3A/B-deletion påvirker APOBEC-mutationssignatur, neoantigenbelastninger og relative immuncellesammensætninger, specifikt i brystkræft

En tidligere undersøgelse viste, at germlinedeletion af APOBEC3A/B er forbundet med øget APOBEC-mutationssignatur i brystkræft, mens et lignende mønster, men uden statistisk signifikans, blev observeret i mange andre kræfttyper, såsom blære . Ved hjælp af univariat analyse til at evaluere de overordnede virkninger af germline APOBEC3A/B-deletion på APOBEC-mutationssignatur fandt vi, at deletionen kun var signifikant forbundet med øget APOBEC-mutationssignatur i brystkræft (P = 5,6 × 10- 3; Tabel 3; Fig. 3a). Der blev imidlertid observeret en modsat tendens i de fleste andre kræfttyper, selv om de fleste associationer ikke var statistisk signifikante (Tabel 3). Specifikt i blærekræft observerede vi, at germline APOBEC3A/B-deletion var signifikant forbundet med nedsat APOBEC-mutationssignatur (P = 1.7 × 10- 3; Tabel 3). For yderligere at belyse, om indflydelsen af germline APOBEC3A/B-deletion på APOBEC-mutationssignaturen skyldes dens virkning på genekspression, evaluerede vi yderligere foreninger mellem APOBEC-mutationssignaturen og deletionen med en justering for ekspression af isoformer (se Metoder). På samme måde viste vores resultater, at germline APOBEC3A/B-deletion kun var signifikant forbundet med øget APOBEC-mutationssignatur i brystkræft (P = 2,8 × 10- 6; Tabel 3; Fig. 3b). Der blev observeret en højere effektstørrelse (Beta = – 0,620) af deletionen med et justeret isoformudtryk sammenlignet med den oprindelige observation af den samlede effekt (Beta = – 0,281; Tabel 3). For at vurdere, om den germlinedeletion kan bidrage til andelen af APOBEC-mutationssignatur, analyserede vi også en andel af APOBEC-mutationssignatur i forhold til de samlede mutationer for hver prøve (se Metoder). I overensstemmelse med den oprindelige observation af APOBEC-mutationssignatur observerede vi, at germlinedeletion kun var signifikant forbundet med en øget andel af APOBEC-mutationssignatur i brystkræft (Beta = – 0,287, P = 4,8 × 10- 3 og Beta = – 0,5, P = 1,4 × 10- 4 for den samlede effekt og effekter med justeret genekspression; se tabel 3). Disse resultater indikerer, at germline APOBEC3A/B-deletion, som fører til øget APOBEC-mutationssignatur, sandsynligvis skyldes det er den særskilte funktion af uc011aoc, der er transskriberet fra deletionen, bortset fra dens virkning på øget udtryk af uc011aoc. Det er blevet rapporteret, at APOBEC3H haplotype I (APOBEC3H-I) kan bidrage væsentligt til APOBEC-mutationssignaturen for prøver, der bærer germline APOBEC3A/B-deletioner i brystkræft . Vi analyserede yderligere APOBECEC3H-I haplotypen for i alt 76 prøver, der blev forudsagt at bære germline APOBEC3A/B-deletioner (se Metoder). Vores resultater viste, at APOBEC-mutationssignaturen ikke var signifikant korreleret med APOBEC3H-I haplotypen, uanset hvilke prøver der blev forudsagt at bære homozygote eller heterozygote germline APOBEC3A/B-deletioner (Data ikke vist). Vores resultater er imidlertid i overensstemmelse med den tidligere konstatering, at APOBEC3A/B-proteinet, der er genereret af deletionen, har et højere ekspressionsniveau end APOBEC3A-proteinet baseret på undersøgelsen fra in vitro funktionelle assays .

For yderligere at udforske den særskilte funktion og de potentielle veje, som isoformen uc011aoc-ekspression (transskriberet fra APOBEC3A/B-deletionen) kan være involveret i, analyserede vi gener, der blev samudtrykt med isoformen uc011aoc i de prøver, der blev forudsagt at bære germline APOBEC3A/B-deletioner (se Metoder). En berigelsesanalyse i kanoniske signalveje ved hjælp af IPA viste, at disse sameksprimerede gener var signifikant beriget i forskellige kanoniske veje varierede på tværs af kræfttyper. Specifikt observerede vi, at de mest berigede kanaler var HIPPO-signalering for blære, PTEN-signalering for bryst, iNOS- og Interferon-signalering for lungeadenocarcinom, Acyl-CoA-hydrolyse for mave og DNA-dobbeltstrengsbrud-reparation og fedtsyre-α-oxidation for bugspytkirtel, EIF2-signalering for skjoldbruskkirtel og GPCR-medieret integration for nyre (P < 0,01 for alle; Yderligere fil 1: tabel S7). Derudover blev en funktionel berigelse i celledød og overlevelse almindeligvis observeret i flere kræfttyper, herunder blære, bryst, livmoderhals, lunge adenocarcinom og lungekarcinom (P < 0.05 for alle).

Vi evaluerede yderligere sammenhængen mellem germline APOBEC3A/B-deletion og neoantigenbelastninger. I overensstemmelse med observationen af APOBEC-mutationssignaturen viste vores resultater, at germline APOBEC3A/B-deletion kun var signifikant forbundet med øget neoantigenbelastning i brystkræft (P = 6,5 × 10- 3; Fig. 3c), mens der blev observeret en modsatrettet tendens i mange andre kræfttyper (Yderligere fil 1: Tabel S8). På samme måde fandt vi, at germlinedeletionen var marginalt forbundet med den relative hyppighed af sammensætningen af T-celler (CD8+) i TIL’er, men kun i brystkræft (P = 0,08; Fig. 3d). Den signifikante sammenhæng blev påvist, da vi kammede prøver med både homozygote og heterozygote deletioner og sammenlignede dem med prøverne med ikke-bærende deletioner (en Wilcoxon signed-rank test, P < 0,05). Der blev imidlertid ikke observeret nogen association for andre immunceller. Vores resultater viste, at germlinedeletion af APOBEC3A/B spiller en vævsspecifik rolle med hensyn til at påvirke APOBEC-mutationssignatur og immunogenicitet i brystkræft, hvilket sandsynligvis forstærker resultaterne i tidligere genomviddeassocieringsundersøgelser af potentielle mekanismer for deres association med øget brystkræftrisiko.

APOBEC-mutationssignatur bidrager signifikant til neoantigener

For at undersøge, i hvilket omfang APOBEC-mutationssignatur bidrager til neoantigener, analyserede vi forudsagte neoantigenbelastninger for hver prøve indsamlet fra en tidligere undersøgelse (se Metoder). Ved hjælp af univariate analyser evaluerede vi foreninger mellem APOBEC-mutationssignatur og neoantigenbelastninger for hver kræfttype. Som forventet var APOBEC-mutationssignatur positivt forbundet med neoantigenbelastninger i alle kræfttyper (P < 1,0 × 10- 4 for alle sammenligninger), mens de højeste signifikante forbindelser blev observeret i bryst- og blæretyper med henholdsvis P = 5,1 × 10- 125 og P = 1,5 × 10- 90 (Yderligere fil 1: Tabel S9). På samme måde blev der observeret en generel positiv associationstendens mellem forudsagte neoantigenbelastninger og andelen af APOBEC-mutationssignatur, med undtagelse af mavekræft (Fig. 4; Additional file 1: Tabel S10). Specifikt blev de signifikante associationer observeret i flere kræfttyper, herunder blære, bryst, livmoderhals, lunge adenocarcinom, hoved og hals og skjoldbruskkirtel. Især bryst- og blærekræft viste de bedste associationer med henholdsvis P = 8,9 × 10- 29 og P = 2,8 × 10- 27 (Yderligere fil 1: Tabel S10). Vores resultater tyder på, at APOBEC-mutationssignatur spiller en væsentlig rolle ved at bidrage til biogenese af neoantigener i human cancer.

Sammenhænge mellem relativ abundans af immuncellesammensætninger i TIL’er med neoantigenbelastning og APOBEC-mutationssignatur

For at undersøge forholdet mellem neoantigenbelastning og TIL’er, anvendte vi genekspressionsdata i tumorvæv til at måle hyppigheden af relative cellesammensætninger af hver immuncelletype, herunder B-celle naiv, B-celle hukommelse, T-celle CD8 og T-celle CD4 hukommelsesaktiveret i TILs (se Metoder). Ved hjælp af univariat analyse evaluerede vi sammenhængen mellem neoantigenbelastning og den relative overflod af immuncellekompositioner for hver kræfttype. Vi observerede, at der var en positiv associationstendens mellem neoantigenbelastning og både T-celle CD8+ og CD4+ hukommelsesaktiverede typer i alle kræfttyper undtagen skjoldbruskkirtel og nyre (Binomial test P = 0,11 og P = 0,02 for T-celle CD8+ og CD4+ hukommelsesaktiverede typer, henholdsvis). Der blev observeret et modsat mønster for både B-celle-naiv- og hukommelsestyper på tværs af alle kræfttyper med undtagelse af lunge adenocarcinom (Binomial test P = 0,02 og P = 2,2 × 10- 16 for henholdsvis B-celle-naiv- og hukommelsestyper). Vores resultater viste især, at neoantigenbelastningen havde en sammenhæng med de relative forekomster af både T-celle CD8+ og CD4+ hukommelsesaktiverede og B-celle naive og hukommelsestyper i blærekræft. Der var en sammenhæng for både B-celle naive og memory-typer i brystkræft og T-celle CD4 memory-aktiverede celletyper i lunge adenocarcinom, hoved- og halskræft og bugspytkirtelkræft (Additional file 1: Tabel S11). Da APOBEC-mutationssignaturen bidrog væsentligt til neoantigener, evaluerede vi desuden sammenhængen mellem de relative hyppigheder af immuncellekompositionerne i TIL’er og APOBEC-mutationssignaturen. I overensstemmelse med observationen fra associeringsanalysen af neoantigenbelastningen blev der også fundet et lignende mønster for APOBEC-mutationssignaturen (Additional file 1: Tabel S12). Vores resultater tyder på, at APOBEC-mutationssignatur har en indflydelse på kræfts immunogene evner, såsom tiltrækning af visse immunceller i TILs, muligvis medieret af den øgede neoantigenbelastning.