Isolering, karakterisering og toksikologisk potentiale af Alternaria-mykotoksiner (TeA, AOH og AME) i forskellige Alternaria-arter fra forskellige regioner i Indien

Indsamling og isolering af Alternaria-arter

De inficerede dele såsom blade, frugter og stængler af syge planter fra forskellige regioner i Indien blev indsamlet og bragt til laboratoriet. Bladprøverne blev overfladesteriliseret med 0,5 % natriumhypokloritopløsning, vasket grundigt med sterilt destilleret vand (SDW) flere gange og blev anbragt på kartoffeldextroseagar (PDA)-kulturmedium i Petriskåle i 3-4 dage. PDA-pladerne med inficerede bladstykker blev inkuberet ved 28 °C med 12 timers lys/mørke fotoperiode i 6-10 dage57. For at undgå bakteriel kontaminering blev der tilsat streptomycin i mediet. Konidierne blev produceret enkeltsporet for at opnå rene kolonier, som blev anbragt på steriliseret filterpapir.

Patogenicitetstest

For at bestemme formae-specialerne blev virulensanalysen af isolaterne udført på tomatkultivarer, der er modtagelige for Alternaria. I alt 60 isolater af Alternaria blev testet for patogenicitet. Tomatfrø blev scarificeret i natriumhypoklorit, skyllet i ledningsvand og derefter lufttørret. Planterne blev dyrket separat i potter. Fysiologiske forhold som temperatur og luftfugtighed for plantevækst blev opretholdt ved henholdsvis 28-32 °C og 40-60 % relativ luftfugtighed. Den optimale inokulums koncentration blev opretholdt (2 × 106 sporer/ml) og sprøjtet på bladområdet. Planterne under forsøget blev holdt i dugkamre i 8 timer ved 25 °C. Disse planter blev regelmæssigt overvåget i 2-3 dage med henblik på infektionens sværhedsgrad og sygdomsudvikling i forhold til kontrolbladet, som ikke var podet. Symptomerne begyndte at blive synlige 1 dag efter sprøjtning af sporesinokulationerne. Sygdommens sværhedsgrad blev vurderet fra 1 dag efter inokulationen og indtil 6 dage efter. Dataene blev statistisk analyseret ved hjælp af variansanalyse (ANOVA) og Duncan’s test (P ≤ 0,05).

DNA-udtrækning og identifikation af patogen

Patogenet blev oprindeligt identificeret på grundlag af morfologiske karakteristika, herunder størrelse og form, og konidiernes struktur, og yderligere bekræftet ved ITS-amplifikation ved hjælp af universelle primere ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACACCTGCGG-3′) og ITS4 (5′-TCCTCTCCGCTTATTGATATATGC-3′), der amplifierer ITS-regioner og 5.8S generne, der koder for svampearter. DNA-ekstraktionen blev udført efter den metode, der er foreslået af Doyle og Doyle58 . En lyofiliseret mycellemåtte på 0,5 g blev formalet i en morter og stødpistol med 10 ml CTAB-ekstraktionsbuffer og derefter inkuberet ved 65 °C i vandbad i 30 minutter. Prøven blev derefter blandet med en lige stor mængde afkølet chloroform/isoamylalkohol og forsigtigt blandet efterfulgt af centrifugering ved 10 000 rpm i 10 min. ved 4 °C. Den således fremkomne supernatant blev blandet med en lige stor mængde isopropanol og lod den stå i 2 timer ved 4 °C. Prøven blev igen centrifugeret ved 10 000 rpm i 10 min. ved 4 °C. Pelleten blev derefter skyllet med 70 % ethanol og lufttørret i 4 timer for at fjerne spor af alkohol. Amplifikationsreaktionen for ITS rDNA blev udført i 25 μl reaktionsblanding indeholdende 2,5 μl 10X-reaktionsbuffer, 5 μl af hver desoxyribonukleotidtriphosphat (dNTP) og 1,0 μl af hver af ITS og 5,8 S-regionens universelle fremadrettede primer (ITS1) og omvendt primer (ITS4), 0,3 μl Taq DNA-polymerase, 10-100 ng DNA og 2,5 μl MgCl2. Den optimerede termiske profil for PCR var indledende denaturering ved 95 °C i 3 minutter, denaturering ved 95 °C i 30 sekunder, annealing ved 70 °C i 30 sekunder og endelig forlængelse ved 72 °C i 1 minut med yderligere 40 cyklusser. Amplifikationen blev bekræftet på 1% agarosegeler i 0,5X TBE-buffer, kørt parallelt med standard DNA-molekylvægtmarkør og visualiseret under UV-transilluminator.

ITS-sekvensanalyse

De opnåede ITS rDNA-regioner af udvalgte isolater blev yderligere nedskåret og oprenset ved hjælp af QIAquick PCR-oprensningskit (QIAGEN, Tyskland) i henhold til producentens instruktioner. De oprensede produkter blev endelig sendt til SciGenome Cochin, Kerala, Indien, med henblik på sekventering. Sekvenserne blev sammenlignet med sekvenserne i GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) ved hjælp af NCBI BLAST. BLAST-analysen blev udført med ITS-sekvenser i fuld længde som forespørgsler for at afsløre relationer til offentliggjorte sekvenser. Den højeste homologi og den højeste samlede score blev noteret med henblik på yderligere analyse. De sekvenser, der blev opnået i den foreliggende undersøgelse, blev indsendt til GenBank. ITS-sekvenserne af Alternaria-stammer fra andre formae speciale blev hentet fra NCBI’s GenBank-database og blev anvendt i de fylogenetiske analyser som referencerækkefølger. Alle DNA-sekvenser blev afstemt med programmet Clustal W, der indgår i BioEdit sequence alignment editor59, 60. Den resulterende multiple-alignment-fil blev anvendt til fylogenetiske analyser, som blev udført ved hjælp af MEGA 5.0 med Neighbor-Joining-metoden, der tillader 500 bootstrap-replikater61.

Udtrækning af toksiner fra Alternaria-arter

Udtræk af de toksiske metabolitter blev udført i henhold til Andersen et al.62’s metode med nogle modifikationer. Ekstraktionerne af disse fytotoksiner blev udført på kartoffeldextrose-broth-medium (PDB) ved hjælp af 20 dage gamle kulturer. Der blev skåret tre agarpropper (3 mm) ud fra midten af hver Alternaria-koloni og inokuleret i 200 ml PDB-medium. Kolonier af patogenet blev skåret af ved hjælp af en korkborer (5 mm), hvorefter kolonierne blev inokuleret i PDB-mediet. 20 dage gamle kulturer blev filtreret gennem filterpapir ved hjælp af en vakuumfiltermaskine. Der blev tilsat samme mængde methanol til kulturfiltraterne, blandet ordentligt og opbevaret ved 4 °C i 24 timer. Derefter blev filtratet udfældet og methanolen inddampet til tørhed i en roterende vakuumkoncentrator (IKA® RV 10) ved 43 °C. En lige stor mængde ethylacetat blev tilsat til det ekstraherede filtrat og blandet ordentligt i en skilletragt. Der blev opnået to faser, en organisk fase og en vandig fase. Det vandige lag blev adskilt og ekstraheret med ethylacetat. Ethylacetatekstraktet blev koncentreret ved 44 °C i vakuumfordamper og opløst i methanol.

Rensning og adskillelse af Alternaria-fytotoksin ved hjælp af kolonnekromatografi

Rensning og adskillelse af forbindelser blev udført ved hjælp af metodologi af Devi et al.63 med små ændringer. Kolonnekromatografi (CC) blev udført i en glaskolonne (700 mm × 30 mm), og silicagel (100-120 mesh størrelse Merk) blev valgt som stationær fase. Den mobile fase bestod af rent opløsningsmiddel eller forskellige opløsningsmidler, afhængigt af kravene til betingelserne. Kolonnen blev fyldt med råkompleks, der var ekstraheret fra isolater af Alternaria-arter. Til adskillelse af giftige metabolitter bestod den mobile fase af chloroform: methanol (80:20 og 95:05), benzen: acetone: eddikesyre (60:35:05) blev anvendt til adskillelse af forbindelser, og der blev fulgt en gradient eluering. De forskellige fraktioner, der blev elueret fra CC, blev adskilt ved tyndtlagskromatografi (TLC) og bekræftet ved HPLC-analyse.

Tyndtlagskromatografi (TLC) analyse af phytotoksinerne

Tyndtlagskromatografi (TLC) blev anvendt til at identificere de forskellige phytotoksiner, der produceres af store såvel som små sporer af identificerede Alternaria-arter. TLC blev udført efter metoden af Andersen et al.64. Ved denne metode blev 4,5 g silicagel G254 (13% CaSO4 ½ H2O som bindemiddel) tilsat 25 ml dobbeltdestilleret vand og omrørt med en glasstav, indtil der blev dannet en opslæmning af silicagel. Derefter blev opslæmningen forsigtigt påført på en glasplade og anbragt på et sikkert sted til lufttørring. Der blev anvendt forskellige mobile faser til adskillelse af forskellige phytotoksiner i forholdet chloroform: methanol (80:20; v/v), benzen: acetone: eddikesyre (60:35:5; v/v), chloroform: methanol (95:5; v/v) og ethylacetat: benzen (95:5; v/v). Disse opløsningsmiddelblandinger blev derefter anbragt i ekssikkatorer og blev efterladt i 30 minutter for at mætte miljøet i dem. Inden TLC udføres, blev glaspladerne belagt med silicagel opladet ved at sætte dem i ovnen ved 60 °C i 10 min. Efter opladning blev 5 µl prøver udtværet på forskellige steder 2 cm fra bunden. Efter at prøverne var blevet spottet, blev TLC-pladerne tørret i et ekssikkator i et par minutter. De resulterende pletter blev udviklet ved at eksponere TLC-pladerne for 0,2 % ethanolisk ferrichlorid og/eller visualiseret under UV-lys ved 365 nm. TLC-pladerne blev derefter lufttørret natten over, hvorefter Rf-værdierne blev beregnet. De pletter af forskellige metabolitter, hvis Rf-værdier blev fundet ens med standardernes Rf-værdier, blev skrabet ud, opløst i methanol af HPLC-kvalitet og anvendt til HPLC-analyse.

HPLC-UV-analyse

Fremstilling af standard

TeA (kat. nr.: T1952), AOH (kat. nr.: A4675) og AME (kat. nr.: A4678) blev købt fra Biogenuix (LKT laboratories, Inc., New Delhi, Indien) og anvendt i krystalliseret form til fremstilling af standarden. Stamopløsningen (1000 µg ml-1) og en separat arbejdsopløsning (10 µg ml-1) af toksinerne blev fremstillet i methanol af HPLC-kvalitet og opbevaret ved -20 °C til videre brug. Disse toksiner blev anvendt som standarder til HPLC-kalibrering og til andre yderligere eksperimenter ved at fortynde de fremstillede arbejdsopløsninger.

HPLC-UV-analysebetingelser

Til HPLC-analyse blev prøverne kromatografisk adskilt ved hjælp af en basisdeaktiveret (250 mm lang × 4.6 mm, 5,0 µm partikelstørrelse) C18 Waters Spherisorb, ODS2-kolonne (produkt nr.: PSS831915, USA), som blev tilsluttet til vagtsøjlen, Waters-seriens system (Waters, Waters Corporation, Milford, USA) med UV-VIS-detektor (2998 PDA) og Waters 600E-systemcontroller. 2998 PDA-detektoren er indstillet på 254 nm som integrationsbølgelængde. Prøverne blev injiceret ved hjælp af en 10 μl sløjfe i Waters 717plus autosampler (Waters Corporation, Milford, USA). Søjlen og vagtsøjlen var termostatisk reguleret ved 28 °C. Strømningshastigheden var 0,70 ml/min, og den mobile fase bestod af 75 % methanol af HPLC-kvalitet (opløsningsmiddel A), 25 % af en vandig opløsning (opløsningsmiddel B) af 0,1 M fosfatbuffer tilsat 900 ml DW for 1 liter og pH 5,8 opretholdt med fosforsyre. Instrumentet blev kørt i en lineær isokratisk tilstand, og detektionen blev overvåget i intervallet 200-400 nm. HPLC-metodens pålidelighed til analyse af AME, TeA og AOH blev valideret ved hjælp af detektionsgrænsen (LOD) og kvantificeringsgrænsen (LOQ).

LC-MS/MS-analyse

For yderligere bekræftelse af Alternaria-toksinerne (AME, AOH og TeA) er der udført en kromatografi-tandem-massespektrometrisk (LC-MS/MS)-metode med små ændringer af Tölgyesi et al.65. Metoden omfatter en fast-væskeekstraktion med methanol og en efterfølgende derivatisering for TeA, AOH og AME. Derefter blev prøverne renset med fastfaseekstraktion på polymerbaserede patroner, og til sidst blev toksinerne separeret ved LC-MS/MS. Til LC-MS/MS-analyse blev prøverne fremstillet trinvis.

Reagenser, opløsningsmidler og fremstilling af standarden

Tørrede analytiske kalibreringsmidler for AME, AOH og TeA blev købt hos Biogenuix (LKT laboratories, Inc., New Delhi, Indien). Standarderne blev rekonstitueret med 1,0 ml methanol for at opnå 0,1 mg ml-1 stamopløsninger. Alle stamopløsninger blev opbevaret ved 4 °C. 2,4-dinitrophenylhydrazin (DNPH) og undecanal blev købt hos Sigma-Aldrich. Derivatiseringsreagenset (0,58 % DNPH i HCl-opløsning) blev fremstillet som beskrevet af Siegel et al.7. Stopreagenset var 5 % (v/v) undecanal i methanol. De derivatiserede TeA-, AOH- og AME-standardopløsninger (henholdsvis 1,91 μg/ml, 2,54 μg/ml og 2,71 μg/ml methanol) blev fremstillet ved at blande 1 ml af de 10 μg/ml methanoliske TeA-, AOH- og AME-opløsninger med 1 ml DNPH-opløsning. Blandingen blev efterladt natten over og behandlet som beskrevet i afsnittene om prøveekstraktion og SPE-oprensning. Det endelige volumen blev justeret til 10 ml med methanol. Disse opløsninger blev brugt til at optimere LC-MS/MS-betingelserne for analysen. Der blev fremstillet en samlet 50 mM ammoniumformiatbuffer i vand, og pH-værdien blev justeret til 3,0 med myresyre. Methanol og acetonitril var af LC-MS-kvalitet fra Sigma-Aldrich. Ethylacetat, n-hexan, dichlormethan, myresyre og ammoniumformiat var af HPLC-kvalitet og købt hos Merck (Darmstadt, Tyskland). Kinetex C-18 UPLC LG 500-kolonnen (3 × 100 mm, 2,6 μm), Strata SPE-kassetter (6 ml, 200 mg) og sprøjtefiltre af regenereret cellulose (RC) (15 mm, 0,45 μm) blev købt hos Phenomenex (Utrecht, Nederlandene). Supelco Ascentis Express C-18, cyano (ES-CN) og phenyl-hexyl HPLC-kolonner (2,1 × 100 mm, 2,7 μm) blev købt hos Sigma- Aldrich. Standardtoksinprøver, der blev anvendt til metodeudvikling, blev købt hos Biogenuix (LKT laboratories, Inc., New Delhi, Indien). Prøverne blev opbevaret ved -20 °C, indtil de blev underkastet analyse.

Probeudtrækning

Prover til udvinding af rå metabolitter blev renset ved kolonnekromatografimetode, og fraktionen blev elueret og opløst i methanol. 50 ml af prøven fra hver fraktion blev blandet i 50 ml polypropylen (PP)-centrifugerør, som derefter blev forseglet. Prøverne blev vortex-blandet i 5 sek. og rystet vandret på en CAT S50-shaker ved 600 min-1 hastighed i 45 min. ved omgivelsestemperatur. Derefter blev rørene centrifugeret ved 5 000 rpm i 10 min. ved 20 °C, og det øverste lag blev opsamlet i et nyt 50 ml PP-centrifugerør. 100 μl derivatiseringsreagens (0,596 % DNPH i 2 mol/lit HCl) blev tilsat til prøven og vortex-blandet i 5 sek. Prøven blev ladt til at blive derivatiseret i 1 time ved omgivelsestemperatur. Derefter blev der tilsat 500 μl stopreagens 5% (v/v) undecanal i methanol og vortex-blandet i 5 sek. Prøven blev ladt stå i 30 min. og derefter fortyndet i PP-røret op til 35 ml med 50 mM ammoniumformiatbuffer (pH 4, justeret med myresyre). Prøven centrifugeres ved 5 000 rpm i 10 min. ved 20 °C og underkastes en rensning ved fastfaseekstraktion.

Rensning ved fastfaseekstraktion (SPE)

Strata-XL-patroner (200 mg, 6 ml, 100 μm) blev konditioneret med 6 ml methanol efterfulgt af 6 ml vand og 6 ml 50 mM formiatbuffer. Der blev tilsluttet 75 ml reservoirer til kassetterne, og prøverne blev lagt i reservoirerne. Derefter blev prøverne passeret drypvis. Herefter vaskes SPE-kolonnerne med 6 ml methanol-vand (15/85, v/v) og derefter med 6 ml n-hexan. Patronerne blev vakuumtørret i 5 minutter, inden prøverne blev elueret i glasrør med 5 ml methanol. Prøverne blev inddampet til tørhed ved 45 °C under en svag kvælstofstrøm, og de blev genopløst i 250 μl methanol ved vortexblanding i 20 sekunder. Som et sidste trin blev prøverne filtreret gennem regenererede cellulosefiltre til HPLC-flasker.

Instrumentering og udstyr

Metodeudviklingen blev udført ved hjælp af en Ascentis Express C-18 (2,1 × 100 mm, 2.7 μm) UPLC LG 500 nm-system (Accucore RP-MS 100 × 3,0 MM, 2,6UM, ACQ-TQD-QBB1152, Waters acuity PDA-detektor, Waters Corporation, Milford, MA, USA) koblet til en MassLynx triple quadrupol MS-detektor (Waters, Milford, MA, USA). Dataindsamling og evaluering blev udført med MassLynx version 4.0. Den endelige metode blev også overført til et Thermo ACQ-TQD Quantum Ultra LC-MS/MS-system (Thermo Finnigan, San Jose, CA, USA), som omfattede en Waters acquity QSM binær pumpe (SN- L10QSM943A), en Waters acquity fin autosampler (SN-M10SDI443M), en kolonne-termostat og en TQD Quantum Ultra triple quadrupol MS-detektor. Målsøjletemperaturen og målprøvetemperaturen var henholdsvis 30 °C og 10 °C. Dataindsamling og evaluering blev udført ved hjælp af Xcalibur-software 2.0.7. SP1. Begge systemer var udstyret med en elektrospraygrænseflade (ESI), hvor der udelukkende blev anvendt negativ ionisering under optagelsen. Der blev anvendt kvælstof som tørre- og kollisionsgas. Ionkildeparametrene er opsummeret i den supplerende tabel S2. Endvidere blev metodens overførbarhed undersøgt med et LC-MS/MS-system, der bestod af en Agilent 1100 HPLC koblet til en AB Sciex 4000 triple quadrupol MS (Framingham, MA, USA).

Instrumentbetingelser

Alternaria-toksinerne adskilles på en Ascentis Express C-18 (2,1 × 100 mm, 2,7 μm) UPLC-kolonne udstyret med en 2,1 mm C-18-forkolonne ved hjælp af lineær gradientelution. Fire opløsningsmidler (opløsningsmidler A, B, C og D) blev blandet med den binære pumpe. Opløsningsmiddel A indeholdt acetonitril (ACN) + vand (5:95), opløsningsmiddel B indeholdt ACN: 5 % isopropylalkohol (IPA), opløsningsmiddel C indeholdt 100 % methanol, og opløsningsmiddel D indeholdt ren ammoniumacetat. Strømningshastigheden var 0,5 ml/min. Opløsningsmidlernes mobile fase i den indledende fase var 0,0 % A, 30 % B, 30 % C og 40 % D. I den sidste fase (5 min) var opløsningsmidlerne 0,0 % A, 30 % B, 30 % C og 40 % D. Det var nødvendigt med et tilstrækkeligt vasketrin i gradientprogrammet for at fjerne de akkumulerede lipofile matrixopløsninger. Den samlede analysetid var 5 minutter. Kolonnetermostaten holdt temperaturen på 30 °C, og injektionsvolumenet var 1,0 μl. Autosampleren blev betjent ved 20 °C.

UPLC LG 500 nm-systemet var koblet til en MS/MS-detektor (Micromass Quattro Ultima PT) via et elektrospray-interface (ESI), der fungerer i negativ tilstand. De optimerede ESI-indstillinger var som følger: kildetemperatur 120 °C, desolvationstemperatur 350 °C, tørringsgasstrøm 650 L/Hr, keglegasstrøm 30 L/Hr og kapillærspænding 3,50 kV. Der anvendes kvælstof som tørre- og kollisionsgas (2,67 × 10-6 bar). MRM-tilstand (Multiply monitoring reaction) blev anvendt i MS under detektionen, og der blev scannet to ionovergange for hvert måltoksin. MRM-tilstanden blev anvendt i MS/MS-detektoren, og der blev registreret to ionovergange (kvantificerende og kvalificerende) for hver målforbindelse. De udvalgte ionovergange med de optimerede spændinger (keglelinse eller rørlinse), kollisionsenergier (CE) og opholdstider er opsummeret i tabellen (Supplerende tabel S2).

Vurdering af det toksikologiske potentiale af forskellige Alternaria-mykotoksiner (TeA, AOH og AME)

Måling af omfanget af celledød, som induceres af forskellige mykotoksiner, blev bestemt ved hjælp af metoden med inokulering af løsrevne blade. Til dette formål blev friske bladprøver løsnet fra de drivhusdyrkede planter og vasket korrekt i 3-4 minutter i rindende ledningsvand, steriliseret i 1,0 % (0,01 g/ml) natriumhypochlorit i ca. 1 minut og derefter tørret af med 70 % ethanol på overfladen og til sidst skyllet grundigt med sterilt destilleret vand på aseptisk vis. Endelig blev bladene anbragt på fugtet filterpapir og punkteret med en steril nål på den nederste overflade. Toksinerne blev opløst i sterilt deioniseret vand i en koncentration på 100 μg/ml. Dråber (100 µl) af hver af de tre toksiner blev sprøjtet ind i de sårede blade med en fin kanyle (Dispovan, 1 ml). En kontrolprøve blev justeret ved at injicere sterilt destilleret vand. De behandlede bladprøver blev opbevaret i et fugtigt kammer (27 ± 0,5 °C temp. og 60 % relativ luftfugtighed) under drivhusforhold (14 timers lys- og 10 timers mørkecyklus ved 27 °C). Der blev foretaget regelmæssig observation (hver 24. time i 6 dage) for at finde frem til eventuelle ændringer med relevans for de toksikologiske virkninger, som udviklede sig i de injicerede prøver i forhold til kontrolprøverne. Forsøgsopstillingen blev opretholdt i tre gentagelser, og den procentdel af bladarealet, der blev påvirket som følge af toksisk induceret celledød, blev målt med en Systronic bladarealmåler 211 og beregnet ved hjælp af nedenstående formel.

Bestemmelse af celledød ved hjælp af Evans blue uptake assay

Tabet af cellens levedygtighed (celledød) blev evalueret ved hjælp af Evans blue farvningsmetoden (Baker og Mock, 1994). Tomatbladene blev behandlet med den samme koncentration (250 μg/ml) af alle tre toksiner. De behandlede blade blev farvet med 0,25 % (v/v) vandig opløsning af Evansblå i 15 minutter. Efter vask med destilleret vand i 30 min. blev bladene skåret ud og lagt i blød med 500 µl N,N-dimethylformamid i 1 time ved stuetemperatur. Den optiske tæthed af den frigjorte Evansblå blev målt spektrofotometrisk ved 600 nm.

Statistisk analyse

Statistisk analyse blev udført ved hjælp af IBM SPSS Statistics ver. 20 software via variansanalyse (envejs ANOVA) efterfulgt af Duncan’s multiple range test ved P ≤ 0,05 signifikansniveau. Data blev udtrykt som gennemsnit ± standardafvigelse (SD) for mindst tre gentagelser af hver metabolit. Statistiske dataanalyser blev analyseret i udvalgte 48 isolater af Alternaria-arter, som var patogene i naturen.