Mikroforplantning af Anthurium spp.

2.1. Vævskultur af Anthurium

In vitroformeringsmetoder har flere fordele i forhold til konventionel formering som f.eks. fleksibel justering af faktorer, der påvirker regenerering som f.eks. explanttype, næringsstof- og plantevækstreguleringsniveauer og miljøforhold, produktion af kloner i den ønskede hastighed, fortsat produktion under sæsonændringer ved hjælp af vævskulturmetoder øger også planternes multiplikationshastighed .

Explanttype

Succesen af vævskultur er relateret til det korrekte valg af explanter. Skud eller skudspidser og knudekulturer er de mest almindeligt anvendte kulturtyper ved mikroformering af planter. Eksplantater fra skudspidser og nodale stængelsegmenter er velegnede til øget axillær forgrening. Anthuriummikroformering fra akselknopper, skudspidser, laminaeksploranter, knude, bladstilke og mikroskår er blevet anvendt med succes . Blandt disse plantedele er blade den mest anvendte eksplantatkilde i vitrokultur af Anthurium.

Genotypen af Anthurium spiller en vigtig rolle i vitropropagation. Undersøgelserne viste, at forskellige genotyper reagerede forskelligt på de samme kulturbetingelser. Derfor er det nødvendigt at fastlægge en passende procedure for hver enkelt Anthurium-sort, som kan tilpasses til kommerciel produktion.

Det er vigtigt for planter at udvælge den type eksplantat, der kan fremkalde callogenese og orgonogenese. I direkte og indirekte orgonogeneseundersøgelser er det vigtigt at anvende unge bladeksponater for at sikre en vellykket dyrkning. Martin et al. observerede et højere antal skud i de brune unge laminaeksploranter end unge grønne lamina. Viégas et al. påpegede også vigtigheden af at anvende nye brune blade til callusinduktion. Bejoy et al. rapporterede, at eksponater udskåret fra lysegrønne blade viste bedre callusudvikling end lysbrune blade. Atak og Çelik anvendte også unge brune og grønne blade af Anthurium andreanum til at evaluere effektiviteten af callusdannelser. De opnåede at reducere callusdannelsestiden ved at anvende brune bladeksploranter og inducerede callusdannelsesprocenten 50 % mere end ved brug af grønne blade.

Etablering af aseptisk kultur

Det andet vigtige trin i mikroformering er at opnå aseptisk kultur af plantemateriale. Aseptiske kultursystemer er effektive til at udrydde de bakterielle, svampe- og insektforurenende stoffer. De sterilisationsprotokoller, der er anvendt til forskellige Anthuriumexplantekilder, er angivet i tabel 1. NaOCl er det vigtigste desinfektionsmateriale, der anvendes ved etablering af aseptiske kulturbetingelser for Anthurium. NaOCl er blevet anvendt i koncentrationer på mellem 1 % og 5 %. Inkuberingstiden for eksplantaterne i natriumhypochlorid viste forskelle på grund af koncentrationerne. Der er også behov for at anvende ekstra desinficerende opløsninger for at udrydde svampe- og bakterieforureninger. Benomyl , Cetrimite, gentamicin og streptomycinsulfat anvendes effektivt til dette formål.

Kulturmedium

Kulturmediet har indflydelse på forplantningseffektiviteten i plantevævskulturanvendelser. Der anvendes organiske forbindelser, vitaminer og plantevækstregulatorer til at stimulere sund vækst. Vævsvæksthastigheden og de morfogenetiske reaktioner påvirkes i høj grad af de medfølgende næringsstoffer.

Der findes flere basalmedier som Chu , Gamborgs B5 , Murashige og Skoog , Murashige og Tucker og Nitsch og Nitsch . Disse medier anvendes med succes til etablering af vævskulturer af forskellige eksplantater af forskellige planter.

I undersøgelser af plantevævskulturer er der blevet anvendt forskellige kombinationer af hvert medie baseret på forskellige koncentrationer af makro- og mikronæringsstoffer for at udvikle effektive protokoller. De hurtige og effektive vævskulturprotokoller er vigtige for mikroforplantning af Anthuriumas i lige så høj grad som for andre planter.

Succesen af plantevævskultur afhænger af sammensætningen af det anvendte medium. Forskellige kombinationer af makronæringsstoffer som kvælstof, kalium, calcium, fosfor, magnesium og svovl og mikronæringsstoffer som jern, nikkel, klor, manganase, zink, bor, kobber og molybdæn ændrer mediets beskaffenhed.

Hver planteart har sin egen mediesammensætning, eller den bør forbedres for at opnå bedre resultater. Ændringerne kan foretages i makro- og mikronæringsstoffer, sukkerindhold, plantevækstregulatorer, vitaminer og andre kvælstoftilskud.

MS-medier med visse ændringer er ofte blevet anvendt i vævskultur af Anthurium. Forskellene skyldes, at der anvendes forskellige koncentrationer af plantevækstregulatorer i kombination med MS-organiske stoffer, der anvendes til at opnå de ønskede væv.

Stikstof er et vigtigt makronæringsstof i plantelivet. Det er en vigtig bestanddel af proteiner og nukleinsyrer. Nitrat er den vigtigste kilde til kvælstof. NO3- reduceres til ammonium efter optagelsen. Planter har mulighed for at bruge den reducerede form af kvælstof i deres stofskifte. Nitratoptagelsen sker effektivt ved en sur pH-værdi. Men efter nitratoptagelsen bliver mediet mindre surt. Når ammonium optages, gør det mediet mere surt. pH-værdien i plantekulturmediet er vigtig, fordi i et buffermedie påvirker begge ioner den effektive kvælstofoptagelse i et bufferet medie. Formen og mængden af kvælstof i medierne har en betydelig indvirkning på cellevækst og differentiering. pH-kontrol i medierne er ikke den eneste grund til at anvende begge ioner, for store mængder ammoniumioner er giftige for planterne. Medier, der indeholder høje niveauer af NH4+, hæmmer også klorofylsyntesen.

Det er kendt, at rodvækst induceres af NO3- og reduceres af NH4+. Men morfogenese styres af den samlede mængde kvælstof i mediet, og den har brug for både NO3- og NH4+. På grund af den optimale anvendelse af NH4+: NO3- har en nøglerolle i morfogenese, og derfor er balancen mellem NO3- og NH4+ forskellig for forskellige planter og forskellige typer kulturer. Denne situation indebærer, at dette forhold bør justeres specifikt for hver enkelt planteart og til forskellige formål. Ændring af NO3- til NH4+-forholdet ved små ændringer påvirker differentiering og vækst.

MS-medie, der ofte anvendes til vævskultur af Anthurium, og forholdet mellem NO3- og NH4+ er 66:34 på dette medie. Af denne grund anvendes generelt modificeret MS-medium til Anthurium-organogenese. Forskere har undersøgt ændringerne af ammoniumnitratkoncentrationen i Anthurium-medier. Hamidah et al. anvendte MS-makroelementer i halv styrke med 2,5 mM ammoniumnitrat til in vitro-stamkulturer. Mens Puchooa anvendte 200 mg/L reduceret ammoniumnitratkoncentration til calluskultur, øgede de mængden til 720 mg/L til regenerering. Dufour og Guérin anvendte forskellige sammensætninger af NO3 og NH4 til at evaluere udviklingsresultaterne. Ifølge deres resultater viste et forhold på 0,37 bedre plantevækst og udvikling. Atak og Çelik foretrak at anvende MS-salte i halv styrke med NH4NO3 sænket til 250 mg/L til skudregenerering. Winarto et al. forbedrede en protokol til callusinduktion og planteforyngelse, og NWT-3-mediet indeholder 750 mg/l NH4NO3.

I kulturbetingelser har brugen af syntetiske kemikalier med lignende fysiologiske aktiviteter som plantehormoner kapacitet til at inducere plantevækst som ønsket. Auxin og cytokininer er de vigtigste hormoner, der regulerer vækst og morfogenese i plantevævskultur. Deres kombinerede anvendelse fremmer væksten af calli, cellesuspensioner, rod- og skududvikling og har evnen til at regulere morfogenesen. Der findes syntetisk auxin og cytokininer ud over naturlige hormoner. Forskellige kombinationer og koncentrationer af plantevækstregulatorer som f.eks. 2,4-dichlorphenoxyeddikesyre , naphthaleneddikesyre , benzylaminopurin og kinetin blev anvendt til at indikere callusdannelse fra forskellige former for explantationer af Anthurium-kultivarer. I indledende undersøgelser er induktion og regenerering af callus efterfulgt af skud- og rodforyngelse de vigtigste trin i vævskultur af hele planter. Da Anthurium er en vigtig kommerciel plante, er hovedformålet med vævskultur af Anthurium at udvikle en hurtig og mere effektiv vævskulturprotokol for at forkorte tiden.

Som det fremgår af tabel 2, anvendes ofte en kombination af 2,4-D og BA i kulturmedier til at inducere callusdannelse fra bladeksploranter i forskellige Anthurium-sorter. Også tilsætning af BAP og 2-iP til callusmediet er blevet evalueret af forskellige forskere. De koncentrationer af 2,4-D, der anvendes i callusmediet, varierer fra 0,08 mg/l til 1 mg/l 2,4-D. BA-koncentrationerne varierer mellem 0.1 mg/l og 1 mg/l.

Mikroformerede planter kræver et udviklet rodsystem for at kunne modstå de ydre miljøforhold. Rodning af skuddene sker in vitro. Derfor er det nødvendigt at bestemme den passende auxintype og -niveau i de medier, der er nødvendige for at fremme roddannelse.

Aktiveret trækul tilsættes til mediet for at fremme rodvækst . AC består af kulstof, og det anvendes ofte i plantevævskultur til at absorbere gasser og opløste faste stoffer. Det er ikke en vækstregulator, men det har en evne til at ændre mediets sammensætning .

Der er flere fordelagtige anvendelser af trækul afhængigt af kulturtypen. Disse er adsorption af sekreterede forbindelser fra dyrkede væv, fald i de phenoliske oxidationer, pH-ændringer af mediet for at optimere for morfogenese, forebyggelse af uønsket callusvækst, simulering af jordbundsforhold på grund af evnen til at fremme roddannelse, evne til at bruge i produktion af sekundære planteprodukter under kulturbetingelser .

Den vigtigste effekt af at bruge AC til mediet er det rigorøse fald i koncentrationerne af plantevækstregulatorer og andre organiske kosttilskud. AC viser større adsorptionskapacitet over for phenoler, der almindeligvis produceres af såret væv, plantehormoner som IAA, NAA, IBA, BA, kinetin, zeatin og andre hormoner . AC’s adsorptive egenskaber ændrer sig med renhed, pH og densitet . Anthurium-frøplanter opformeret af Atak og Çelik blev rodfæstet i et medium indeholdende AC og er vist i figur 1.