Mikromekanikken i lungealveoler: struktur og funktion af surfaktant og vævskomponenter

Under åndedrætscyklussen er de distale luftrum i lungeparenkymet kontinuerligt udsat for volumenændringer. Disse volumenændringer pålægger deformationer på duktale og alveolære luftrum og vigtigst af alt på inter-alveolære septa. Sådanne deformationer kan bedst beskrives med begrebet belastning, som er størrelsen (f.eks. længde, overflade eller volumen) af en struktur efter deformation i forhold til udgangssituationen (Vlahakis og Hubmayr 2005). På organskalaen beregnes den belastning, der pålægges lungen, derfor ved hjælp af tidevandsvolumenet, der svarer til lungedeformationen, og det funktionelle restvolumen, der svarer til lungens udgangssituation. Under mekanisk ventilation er tidalvolumenet givet af respiratoren, mens det funktionelle restvolumen svarer til lungens volumen ved et givet positivt ekspiratorisk sluttryk (PEEP). Stress er på den anden side defineret som kraft pr. areal, således at stress og tryk har samme enhed (Vlahakis og Hubmayr 2005). På mikroskopisk niveau er der beskrevet trykændringsrelaterede ændringer af mikroarkitekturen og dermed deformation i duktale og alveolære luftrum samt interalveolære septa (Gil et al. 1979; Bachofen et al. 1987; Tschumperlin og Margulies 1999; Roan og Waters 2011). På baggrund af disse observationer giver det fysiologisk mening at skelne mellem duktale og alveolære luftrum, da de ud fra et anatomisk synspunkt er forskelligt afgrænset med delvist forskellige stabiliserende elementer, hvilket resulterer i forskellige mekaniske egenskaber (Wilson og Bachofen 1982; Haefeli-Bleuer og Weibel 1988).

Extracellulær matrix, celler og mikromekanik i duktale og alveolære luftrum

Et økonomisk udformet fibernetværk tjener til stabilisering af distale luftrum, der bærer og overfører de spændinger, der er forbundet med lungens elastiske rekyltryk (= trans-alveolært tryk). Sidstnævnte er defineret som forskellen mellem trykket i de acinære luftrum og pleuraloverfladen (Loring et al. 2016). In vivo er trykket ved pleuraloverfladen sammenlignet med det atmosfæriske tryk normalt negativt og er hovedsageligt baseret på lungens elastiske rekyl, som har sit fundament i det elastiske fibernetværk og overfladespændingen (Fredberg og Kamm 2006; Wilson og Bachofen 1982). Det aksiale system af elastiske og kollagenfibre stammer fra væggene i de ledende luftveje, går ind i acini-centrene og bidrager til dannelsen af alveolære indgangsringe og omgiver derved alveolærkanalerne. Alveolærkanalen som sådan har således ikke sin egen væg, men er i stedet afgrænset af alveolernes indgangsringe, som omfatter elementerne i det aksiale netværk af bindevævsfibre. Med andre ord omslutter det aksiale fibersystem luftkanalenes luftrum (fig. 4). Derfor resulterer volumenændringer i alveolærkanalerne primært i en deformation af de alveolære indgangsringe og en strækning af det aksiale fibersystem. I denne forbindelse er det blevet observeret, at diameteren af alveolære indgangsringe bliver mindre med faldende lungevolumen (Mercer et al. 1987). De alveolære vægge er imidlertid dannet af interalveolære septa, som først og fremmest omfatter et alveolært kapillærnetværk, forskellige celletyper og et minimum af stabiliserende bindevævselementer. Det aksiale system af bindevævsfibre, der er koncentreret ved de alveolære indgangsringe, er forbundet med det perifere system, der stammer fra pleura, ved hjælp af alveolære septalvægsfibre, der er placeret mellem de basale laminae af alveoleepitelet og endothelet, svarende til den tykke side af luft-blodbarrieren. Disse fibre på den tykke side udgør rygraden i de interalveolære septa og overfører de de detensionskræfter, som i tilfælde af homogen spændingsfordeling i lungen genereres af trykgradienterne mellem det acinære luftrum og pleurahulen (Mead et al. 1970) (fig. 4). I den forbindelse er det blevet vist, at volumetætheden af kollagen og elastiske fibre i septaerne stiger mod septaernes frie kant og danner alveolærkanalens “væg” (Mercer og Crapo 1990; Toshima et al. 2004). Elastiske fibre har et lineært spændings-deformationsforhold over et bredt deformationsområde, der tillader en fordobling af deres grundlængde (= 200 % deformation), således at disse fibre bidrager til elastisk rekyl og stabilisering af lungeparenkymet ved lavere lungevolumener, herunder også området for normal vejrtrækning, der normalt defineres som volumenspektret mellem 40 og 80 % af den samlede lungekapacitet (TLC) (Suki et al. 2011; Yuan et al. 2000). Kollagenfibre har på den anden side et mere eller mindre krøllet forløb ved lave lungevolumener. Som følge heraf bliver kollagenfibrene lige ved større lungevolumener og er da karakteriseret ved et meget ulineært spændings-deformationsforhold og høj stivhed (Suki et al. 2005).

De stabiliserende komponenter i de interalveolære septa og dermed i de alveolære luftrum omfatter også den alveolære epitheliale basallamina, som formodes også at blive stressbærende ved større lungevolumener (Maina og West 2006). En forøgelse af alveolernes volumen kan resultere i en strækning af de alveolære epitelceller, som er fastgjort til basallaminaen via celle-matrixadhæsioner (Tschumperlin og Margulies 1999). Dette udgør en vigtig forskel i forhold til den alveolære kanal, som mangler en grænse med en sammenhængende epithelforing. Elektronmikroskopiske vurderinger af basallamina på den tynde side af luft-blodbarrieren i de interalveolære septa viste imidlertid foldning selv ved større lungevolumener (f.eks. over 80 % af TLC), hvilket indikerer, at basallamina (og dækcellerne) i det mindste i nogle områder ikke er helt strakt (Bachofen et al. 1987). I den sunde lunge gør disse meget økonomisk organiserede stabiliserende systemer af bindevævselementer, der er beskrevet ovenfor, det muligt at ændre volumen under respirationen med minimal indsats og uden at forstyrre parenkymets afgørende gasudvekslingsfunktion (Weibel et al. 1991; Weibel et al. 1992). Desuden er det sandsynligt, at deformation af vævskomponenterne sker uden stor belastning af alveoleepitelet i en intakt lunge under normal tidevandsindånding, da stilladset er stressbærende, mens overfladespændingen i tilstedeværelse af et intakt surfaktantsystem er reduceret ved lave lungevolumener.

Den basale lamina og de andre komponenter i den ekstracellulære matrix udgør det stillads, som de cellulære komponenter, herunder alveolære epitelceller, interstitielle celler og endotelceller, er fastgjort til via celle-matrix-kontakter som f.eks. fokale adhæsioner. Selv om cellerne kan udøve deformerende kræfter på den omgivende ekstracellulære matrix, er det blevet vist, at lungernes mekaniske egenskaber kun ændres i mindre grad i løbet af decellulariseringen af lungestilladset (Nonaka et al. 2014). I denne sammenhæng er det blevet vurderet, at de cellulære komponenter i de interalveolære septa kun bidrager lidt til lungernes samlede mekaniske egenskaber som f.eks. elastisk rekyl og stivhed (Oeckler og Hubmayr 2008). Desuden kan belastning og stress, der virker på den ekstracellulære matrix, overføres til de stressbærende elementer i cellerne via celle-matrix- og celle-celle-kontakter, såsom plasmamembranen og cytoskelettet, en mekanisme, der synes at være mest relevant ved større lungevolumener. Disse kræfter resulterer i celledeformation og er blevet anslået til at udgøre 5000 Pa ved en fokal adhæsion. I den forbindelse rapporterede Tschumperlin og Margulies en forøgelse af overfladen af den epitheliale basallamina med 35 % ved sammenligning af lungevolumener, der svarede til 42 % og 100 % af TLC (Tschumperlin og Margulies 1999). Derfor kan cytoskelettet og plasmamembranen i alveolære epitel- og endothelceller ved større lungevolumener også blive stressbærende på grund af deres tilknytning til basallamina (Cong et al. 2017). Derfor bliver disse cellelag modtagelige for stressfejl, f.eks. ved skadelig ventilation med øget tidalvolumen, som har vist sig at resultere i ultrastrukturelle tegn på skade på endothel- og epitelceller som f.eks. disruption af den cellulære plasmamembran, blebbing og denudation af basallamina (Costello et al. 1992; Fu et al. 1992; Dreyfuss og Saumon 1998). Det skal bemærkes, at type II alveolære epitelceller ifølge disse undersøgelser syntes at være mindre skadelige ved øget belastning (Dreyfuss og Saumon 1998). Ikke desto mindre er der blevet observeret forskellige mekanismer, der gør det muligt for cellerne at modstå øget belastning uden at fejle. Øget belastning på celleniveau kan også forekomme under fysiologiske forhold, f.eks. ved dyb indånding, under fysisk træning eller suk. Plasmamembranens folder sig ud for at tilpasse sig de laterale spændingskræfter. Men selv hvis der opstår brud i plasmamembranen, kan cellerne reparere disse defekter uden at undergå celledød. Plasmamembranbrud med en diameter på mindre end 1 µm kan repareres ved termodynamisk lateral strømning af plasmamembranen, der danner lipiddobbeltlag på en Ca2+ -uafhængig måde (Vlahakis et al. 2002; Cong et al. 2017). Desuden er det blevet påvist, at strækning af celler aktiverer den såkaldte deformationsinducerede lipid-trafikering, som omfatter overførsel af endogene lipidvesikler til den tilsvarende brud, men også endocytose af en brudt plasmamembran og dannelse af et membranplaster (Cong et al. 2017).

Overfladespænding og alveolær mikromekanik

Det pulmonale surfaktantsystem bidrager også til lungemekanikken og stabiliserer alveolerne, især ved lavere lungevolumener (Bachofen og Schürch 2001). Høj overfladespænding ved grænsefladen mellem luft og væske har vigtige virkninger på den alveolære mikroarkitektur og fører til en reduktion af det alveolære overfladeareal ved at forårsage kollapsbarhed af luftrummene. Dette modvirkes af det intra-alveolære overfladeaktivt stof ved at reducere overfladespændingen i slutningen af udåndingsfasen. Det overfladeaktive overfladeaktive surfaktantlag ved grænsefladen mellem luft og væske forhindrer ikke blot alveolær kollaps og ødemdannelse i slutningen af ekspirationen (Possmayer et al. 2001), men også grænsefladespænding. Grænsefladespænding i forbindelse med høj overfladespænding er baseret på væsker, der svinger på epitelets overflade under vejrtrækning og deformerer f.eks. alveolære epitelceller af type II via forskydningskræfter. Grænsefladespændinger kan derfor alene resultere i en alvorlig dysfunktion af alveolære type II-epitelceller, som det er illustreret i in vitro-testsystemer (Hobi et al. 2012; Ravasio et al. 2011).

I en sund lunge er makro- og mikromekaniske egenskaber domineret af overfladespænding ved grænsefladen mellem alveolær luft og væske ved små lungevolumener, mens ekstracellulære matrixkomponenter ved større lungevolumener bliver stressbærende og definerer lungestrukturen og mekanikken (Bachofen et al. 1987; Wilson og Bachofen 1982; Bachofen og Schürch 2001). Det aksiale system af fibre, der omgiver de alveolære indgangsringe, danner et cirkulært gitter, som omgiver alveolærkanalen og afbalancerer overfladespændingen ved grænsefladen mellem luft og væske i alveolen (fig. 4). De spændinger, der opstår som følge af overfladespændingen i alveolerne, virker på en sådan måde, at de interalveolære septa hober sig op i alveolens hjørne, således at alveolernes overfladeareal mindskes. Derved strækkes de elastiske og kollagenfibre, som omgiver alveolærkanalerne og koncentrerer sig ved septalvæggenes kanter. Disse fibre afbalancerer således de kræfter, der opstår som følge af overfladespændingen ved grænsefladen mellem luft og væske i alveolen. Det intra-alveolære surfaktantsystem stabiliserer sammen med fibernetværket det alveolære overfladeareal, der er tilgængeligt for gasudveksling, som ellers ville falde med stigende overfladespænding (Wilson og Bachofen 1982). Ved at fylde lungen med saltvand ophæves grænsefladen mellem luft og væske og dermed overfladespændingen. Dette har flere virkninger på mikroarkitekturen, f.eks. en forholdsvis snæver diameter af alveolærkanalerne, uregelmæssig alveolær tekstur med udbulende kapillærer og manglende septaplader i de alveolære hjørner (Gil et al. 1979). I den luftfyldte lunge med bevaret overfladespænding er de alveolære vægge flade, og kapillærerne buler ikke ud i luftrummet, mens alveolærkanalerne ser ud til at være bredere. Sammenlignet med saltvandsfyldte lunger har luftfyldte lunger derfor reducerede alveolære overfladearealer som målt ved designbaseret stereologi på grund af overfladespændingens afsmittende effekt (Gil et al. 1979). Øget overfladespænding som følge af f.eks. skader på surfaktantproducerende type II alveolære epitelceller er forbundet med en yderligere forøgelse af alveolærkanalens diameter og tab af alveolært overfladeareal, hvilket er strukturelle ændringer, der let kan misforstås som lungeemfysem (Mouded et al. 2009). Disse observationer tyder på, at det alveolære overfladeareal er en direkte funktion af overfladespændingen: jo højere overfladespænding, jo lavere alveolært overfladeareal ved lave til intermediære lungevolumener på op til 80 % af TLC (Bachofen et al. 1979; Bachofen og Schürch 2001). Overfladespændingen ved grænsefladen mellem luft og væske reduceres af surfaktant til næsten nul mN/m i slutningen af ekspirationen, således at alveolerne stabiliseres, og det aksiale system af elastiske fibre kun strækkes lidt ved lavere lungevolumen (Wilson og Bachofen 1982; Bachofen et al. 1987). Dette samspil mellem overfladekræfter og fibersystemet er af stor betydning, da det indebærer, at under normal vejrtrækning, f.eks. ved 40-80 % af TLC, er de cellulære komponenter i de interalveolære septa, som f.eks. alveoleepitelet, beskyttet mod potentielt skadelige mekaniske belastninger. Ved større lungevolumener, f.eks. over 80 % af TLC, øges overfladespændingen, men elastiske og kollagenfibre og epitelbasallamina strækkes, således at de nu stabiliserer og former luftrummene og potentielt kan overføre stress og belastning til cellerne. Da disse vævskomponenter bliver stressbærende, og deres egenskaber definerer de mekaniske egenskaber ved større lungevolumener, kan overfladespændingen negligeres (Wilson og Bachofen 1982; Maina og West 2006). I denne sammenhæng er det blevet vist, at aldring resulterer i en udvidelse af luftrummet og en reduktion af lungens elastiske tilbageslag. Disse observationer er for nylig blevet foreslået at kunne forklares ved en ren aldersrelateret omfordeling af elastiske og kollagenfibre i de interalveolære septa “væk fra alveolærkanalen”, hvilket understreger relevansen af den rumlige fordeling og orientering af fibernetværkene (Subramaniam et al. 2017).

Mekanismer af alveolær mikromekanik

Som skitseret ovenfor tyder lungens strukturelle design på, at inter-alveolære septa er beskyttet mod overvældende mekanisk stress og belastning, i det mindste under tidal ventilation under sunde forhold (Bachofen og Schürch 2001). Dette aspekt er af stor betydning, da in vitro cellekulturundersøgelser har illustreret, at alveolære epitelceller er modtagelige for belastningsinduceret celleskader (Tschumperlin et al. 2000; Dolinay et al. 2017), et spørgsmål, som utvivlsomt er relevant in vivo i forbindelse med ventilationsinduceret lungeskade (VILI) (Cong et al. 2017). Vores nuværende viden om alveolær mikromekanik og mekanikken i deformationen af alveolerne, herunder deres vægge, under ventilation er imidlertid stadig meget begrænset (Roan og Waters 2011). Dette skyldes begrænsninger i rumlig og tidsmæssig opløsning af tilgængelige billeddannelsesteknikker, som ikke tillader direkte visualisering af acinær mikromekanik, defineret som arkitektoniske og funktionelle ændringer i løbet af åndedrætscyklussen. En meningsfuld undersøgelse, der også tager hensyn til den cellulære belastning i de interalveolære septaer, ville kræve en elektronmikroskopisk opløsning. På grundlag af kvantitative vurderinger af det alveolære overfladeareal eller alveolernes størrelse på forskellige stadier af tryk-volumen-kurven er det blevet anslået, at deformationen og dermed alveolens belastning i lineære dimensioner under tidalånding (normalt defineret mellem 40 og 80 % af TLC) er på omkring 4 % (Tschumperlin og Margulies 1999; Mercer et al. 1987) til 10 % (Gil et al. 1979) og kan i princippet endda stige til 20 % og mere (Gil et al. 1979; Mercer et al. 1987), hvis den inspiratoriske reserve er udtømt, f.eks. under dybe suk eller fysisk træning (Fredberg og Kamm 2006). Fredberg og Kamm understregede relevansen af disse vurderinger af alveolær belastning. De beregnede, at de alveolære strukturer i løbet af deres levetid skal klare den åndedrætsrelaterede alveolære belastning i op til 109 belastningscyklusser, og konkluderede endvidere “Efter standarderne for almindelige tekniske materialer er disse belastninger ekstreme og synes at kræve vævsstrukturer, der er ret betydelige” (Fredberg og Kamm 2006).

Ud fra dette ræsonnement opstår spørgsmålet om, hvordan inter-alveolære septa klarer den volumenændringsrelaterede belastning. Med andre ord, hvilke mekanismer er det, hvormed alveolerne og frem for alt de inter-alveolære septa tilpasser sig respiratorcyklusrelaterede alveolære og septale belastninger uden at udsætte de alveolære epitelceller for unødig mekanisk stress. Elegante undersøgelser for over 30 år siden, hvor der blev anvendt kvasistatiske forhold og vaskulær perfusionsfiksering af lungevæv ved definerede inspiratoriske og ekspiratoriske tryk under tryk-volumen (PV) loops, afslørede, at forskellige mekanismer for deformation af septalvæggen er involveret og kan resultere i individuelle alveolære volumenændringer under inspiration og ekspiration. Gil og medarbejdere diskuterede 4 mekanismer: (1) rekruttering/derekruttering af alveolære enheder; (2) isotropisk strækning og nedstrækning med ballonlignende ændringer af alveolernes størrelse; (3) ændringer i alveolernes form (f.eks. fra dodekaedrisk til sfærisk og omvendt), som på grund af forskellig geometri er forbundet med ændringer i alveolernes størrelse; og (4) foldning og udfoldning af alveolevægge og harmonika-lignende deformation, som kan ligne foldning og udfoldning af en papirspose (Gil et al. 1979). Disse potentielle mekanismer blev afledt af ex vivo-tilgange af isolerede og perfunderede lunger og evaluerede lungens adfærd i et interval af tryk ved luftvejsåbningen fra næsten nul (0,1 cm H2O) til op til 30 cm H2O (= 100 % TLC) (Bachofen et al. 1987). Disse observationer er derfor vanskelige at sammenligne med in vivo-situationen, hvor lungevolumen normalt ikke falder under restvolumen. I de første respirationscyklusser i en afgaset lunge spiller rekruttering af komplette alveoler under inspirationen en vigtig rolle og forklarer den øgede hysterese i de indledende kvasi-statiske PV-sløjfer (Bachofen et al. 1987; Bates og Irvin 2002; Carney et al. 1999). Modelbaserede tilgange ved hjælp af magnetisk resonansbilleddannelse har givet beviser for, at alveolær rekruttering under inspiration kan være involveret under fysiologiske forhold hos raske mennesker (Hajari et al. 2012). Disse modelprædiktioner er imidlertid i modstrid med en række andre undersøgelser, der anvender direkte visualisering af alveoler eller kvantitative vurderinger af lungestrukturen ved hjælp af designbaseret stereologi til at undersøge alveolær mikromekanik i sunde lunger. Disse undersøgelser fandt ingen beviser for intra-tidal rekruttering og derekruttering af komplette alveoler i en sund lunge under in vivo forhold over funktionelt restvolumen (Oldmixon og Hoppin 1991; Schiller et al. 2001; Pavone et al. 2007; Perlman et al. 2011; Sera et al. 2013; Knudsen et al. 2018; Lovric et al. 2017). I et indbyrdes forbundet netværk af alveolære vægge er alveolerne blevet forudsagt at være meget stabile med afbalancerede spændinger, der virker på inter-alveolære septa, så længe overfladespændingen er reduceret og harmoniseret mellem alveoler af forskellig størrelse (Fung 1975; Mead et al. 1970).

Figur 5 opsummerer sandsynlige koncepter for alveolær mikromekanik under deflation i sunde lunger baseret på morfometriske undersøgelser ved hjælp af fikseret lungevæv på forskellige stadier af kvasi-statiske PV-sløjfer (Gil et al. 1979; Bachofen et al. 1987; Oldmixon og Hoppin 1991; Oldmixon og Hoppin 1991; Tschumperlin og Margulies 1999; Knudsen et al. 2018). Det skal dog understreges, at lungens volumenhistorie samt de betingelser, under hvilke lungerne blev undersøgt, f.eks. in vivo vs. ex vivo, er af stor relevans, hvorfor modstridende resultater er blevet offentliggjort. Ved ret lave lungevolumener (= faldende luftvejsåbningstryk) er det blevet observeret, at dannelsen af folder af interalveolære septalvægge forekommer ret hyppigt, så udfoldning og foldning af alveolære septalvægge (men ikke komplette alveolære enheder) synes at være relevant for den alveolære mikromekanik, især ved lave lungevolumener. Dette er blevet vist ved strukturelle vurderinger udført både under ex vivo (Tschumperlin og Margulies 1999) og in vivo forhold (Knudsen et al. 2018). Det er faktisk blevet påvist, at vævselasticiteten under mekanisk ventilation med PEEP på 1 cm H2O var signifikant forøget sammenlignet med mekanisk ventilation med en PEEP på 5 cm H2O i raske rottelunger. Med andre ord bliver lungen stivere, hvis trykket ved luftvejsåbningen reduceres fra 5 til 1 cm H2O. Baseret på etableringen af struktur-funktionsforholdet viste denne stigning i lungestivhed en høj korrelation med faldet i den gennemsnitlige alveolære størrelse, som højst sandsynligt kunne tilskrives forekomsten af folder i inter-alveolære septa under deflation fra 5 til 1 cm H2O, som observeret på elektronmikroskopisk niveau (Knudsen et al. 2018; Tschumperlin og Margulies 1999). Det skal bemærkes, at antallet af åbne alveoler ikke var forskelligt mellem lunger fikseret in vivo (lukket bryst) ved luftvejsåbningstryk på 1 og 5 cm H2O ved udånding, så der var ingen tegn på derekrutering af alveolære enheder. I stedet kunne en nedgang i overfladeareal og alveolært volumen forbindes med dannelsen af folder/foldninger af inter-alveolære septa. Andre forskere, der har anvendt en lignende eksperimentel opsætning (in vivo, lukket brystkasse), har imidlertid sat spørgsmålstegn ved relevansen af denne mekanisme i en sund lunge, da foldning eller sammenkrøllning af interalveolære septa næppe blev set inden for områder med et luftvejsåbningstryk på 3-16 cm H2O. Det kunne dog ikke udelukkes, at der kunne dannes folder under dette trykområde (Oldmixon og Hoppin 1991). Ved mellemliggende til højere lungevolumener, der når op til 100 % af TLC (normalt defineret som lungevolumen ved 30 cm H2O transpulmonalt tryk), har flere forskere påpeget, at der forekommer formændringer af alveolære luftrum og strækning/udstrækning af alveolære vægge (Roan og Waters 2011). Gil og medarbejdere beskrev ændringer i form fra en polyedrisk til en mere kugleformet konfiguration under ex vivo-betingelser (Gil et al. 1979). Tschumperlin og Margulies målte i en ex vivo-forsøgsopstilling overfladen af den epitheliale basallamina under deflationsleddet af en PV-loop, der kommer fra 25 cm H2O, og observerede ret stabile værdier i intervallet ca. 80-40 % af TLC, mens der var et betydeligt fald i intervallet mellem 100 og 80 % TLC. Ud fra disse data foreslog forfatterne, at strækning af alveolære epitelceller er af stor relevans over 80 % af TLC, mens under 80 % TLC er deformationer uden stor ændring i basallaminas overfladeareal (og derfor strækning af alveolære epitelceller) dominerende for mikromekanikken, f.eks. udfoldning/foldning af septalvægge eller ændringer i form (Tschumperlin og Margulies 1999). Den samlede belastning i to dimensioner af den basale lamina og dermed af de vedhæftede epitel- og endothelceller er blevet anslået til at udgøre 35 % mellem 40 og 100 % TLC, mens området mellem 80 og 100 % TLC bidrog med 80 % af denne samlede belastning (Tschumperlin og Margulies 1999). I denne sammenhæng resulterede 25 % belastning i to dimensioner af et monolag af primære alveolære epitelceller, som kunne svare til en permanent ventilation af lungen til lungevolumener, der ligger mellem 80 % og 100 % TLC, i cellulære skader såsom endoplasmatisk retikulumstress og apoptose (Dolinay et al. 2017). Disse resultater illustrerer, at lungevolumen under ventilation ikke behøver at overstige TLC for at påføre alveoleepitelet unødig, potentielt skadelig belastning.

Med ex vivo metoder fandt andre forskere beviser for rekruttering og derekruttering i et interval af luftvejsåbningstryk mellem 0 og 30 cm H2O (Gil og Weibel 1972; Bachofen et al. 1987) svarende til tryk-volumen forholdet over hele TLC-området i en isoleret lunge. Derfor varierede volumenhistorien mellem de ex vivo-undersøgelser, der observerede alveolær derekrutering, og de undersøgelser, der ikke gjorde det. Under normal vejrtrækning og under in vivo-forhold falder lungevolumenet normalt ikke under den funktionelle restkapacitet og dermed under PV-loopens nedre infliktionspunkt (Salazar og Knowles 1964; Venegas et al. 1998), et aspekt, der er meget forskelligt fra ovennævnte ex vivo-forsøg, således at forekomsten af alveolær derekrutering ved slutningen af ekspirationen er mere end tvivlsom inden for området for fysiologisk vejrtrækning. Ved hjælp af in vivo-mikroskopi og den ufysiologiske situation med afgasede, men sunde hundelunger observerede Carney og medarbejdere alveolær rekruttering indtil et lungevolumen svarende til ca. 80% af TLC, mens de alveoler, der var åbne, var karakteriseret ved mere eller mindre stabile individuelle volumener (Carney et al. 1999). Synkrotron refraktionsforstærket computertomografi til direkte visualisering af lungeacini in situ gav ingen beviser for alveolær rekruttering hos mus under oppustning under kvasi-statiske forhold og understøttede konceptet om formændringer og harmonika-lignende udfoldning under inspiration (Sera et al. 2013).

Flere ex vivo- og in vivo-undersøgelser viste også, at i området for fysiologisk vejrtrækning (f.eks. transpulmonale trykgradienter under 10 cm H2O) finder volumenændringer overvejende sted i alveolære kanaler, mens en mindre del af volumenændringerne finder sted i alveolerne (Sera et al. 2013; Mercer et al. 1987; Knudsen et al. 2010, 2018). Under spontan vejrtrækning er det blevet estimeret fra synkrotronrøntgenbilleder, at 34 % af tidalvolumen resulterer i en forøgelse af alveolært volumen, mens de resterende 66 % ender i luftkanal- eller ledningsluftrummene under inspiration (Chang et al. 2015). Disse resultater bekræftes groft sagt af in vivo-mikroskopi, der viser, at alveolernes størrelse kun øges lidt under tidalventilation (Schiller et al. 2001). Derfor synes de volumenændringer i alveolærkammeret, der er relateret til tidalventilation, at være forholdsvis lave, således at variationer i alveolernes lineære dimensioner er blevet anslået til 3-4%. Ved større volumener, f.eks. transpulmonale trykgradienter > 10 cm H2O, tyder morfometriske data imidlertid på, at 50 % af volumenændringerne under et PV-loop sker i alveolærkanaler og alveoler hver især (Mercer et al. 1987).