Miniature bioreaktorer: nuværende praksis og fremtidige muligheder

Indledning

Molekylærbiologiens og genmanipulationsteknologiens fremkomst i løbet af det sidste kvart århundrede har haft en dramatisk indvirkning på medicinal- og sundhedsindustrien, idet en lang række af de mange anvendelser af denne teknologi er baseret på evnen til at skabe rekombinante cellelinjer til terapeutisk gavn for mennesker. Ud over udviklingen af disse genetisk modificerede organismer er der fortsat behov for at forbedre produktiviteten af vildtypen, fremskynde screeningen af nyopdagede mikrober og fortsætte udviklingen af beslægtede opgaver som f.eks. forbedring af vækstmedier og procesoptimering. Traditionelt har udviklingen af celledyrkningsprocesser krævet screening af et stort antal cellelinjer i shake flask-kulturer og derefter yderligere afprøvning af succesfulde kandidater i bioreaktorer på bænk før pilotskalaundersøgelser . Behovet for at foretage et stort antal udviklingsdyrkninger har resulteret i fremrykning og stadig mere udbredt anvendelse af bioreaktorsystemer i lille skala, der tilbyder en miniaturiseret HT-løsning til procesudvikling.

De vigtigste celletyper, der anvendes til fremstilling af terapeutiske produkter, er bakterie- og pattedyrkningceller, som hver især har unikke fordele og begrænsninger, der har indflydelse på den type bioreaktor, der anvendes til procesudvikling. Bakterieceller er generelt robuste og ikke modtagelige for shear-skader, hvilket betyder, at der kan anvendes radiale impeller-systemer med høj shearing (f.eks. Rushton-turbiner) og høje omrøringshastigheder. Dette giver sådanne bioreaktorer en høj masseoverførselsevne, hvilket gør det muligt at understøtte hurtigt metaboliserende mikrobielle celledyrkning med høj celletæthed og øge den produktmængde, som sådanne bioprocesser kan give. Selv om pattedyrceller ikke har en beskyttende cellevæg og derfor typisk er mere modtagelige over for forskydning og kræver en mere skånsom håndtering end deres bakterielle modstykker, kan de fleste af de kommercielt anvendte cellelinjer dyrkes i omrørte tankbioreaktorer, om end med konstruktionsmæssige ændringer. F.eks. kan der i stedet for Rushton-turbiner anvendes aksialhjul af marinetypen med lav forskydning for at cirkulere cellerne og næringsstofferne forsigtigt i et miljø uden skillevægge, og der kan tilsættes skubbeskyttende midler som f.eks. serum eller Pluronic F-68 til cellekulturmedierne.

Ud over udvikling af terapeutiske lægemidler kan MBR’er anvendes til udvikling af vækstmedier; stammeforbedring gennem metabolisk teknik eller rettet evolution; og såkaldt bioprospektion af naturprodukter – alle er processer, der medfører en stor bioreaktorbyrde, som kan lettes ved brug af HT-miniatureenheder. MBR’er kan navnlig reducere arbejdsintensiteten og materialeomkostningerne i forbindelse med det store antal celledyrkningsprocesser, der er nødvendige i forbindelse med udvikling af bioprocesser, hvilket øger paralleliteten og det opnåelige gennemløb, og som sådan er de af stigende interesse . Det er vigtigt, at sådanne anordninger, når de anvendes til procesudvikling, kan være pålidelige og nøjagtigt efterligne bioreaktorer i laboratorie- og pilotskala, således at vækstkinetik og produktekspression – optimeret i miniatureskala – kan forventes at kunne opskaleres kvantitativt.

Selv om de utvivlsomt er mere egnede til HT-drift end konventionelle bioreaktorer i laboratorieskala, er MBR’er i øjeblikket typisk mindre instrumenterede og har også begrænsede muligheder for off-line prøveudtagning på grund af de små anvendte volumener (fra ca. 0,1 ml til ca. 100 ml); dette betyder, at der i øjeblikket er en afvejning mellem informationsindholdet i form af datakvalitet og -mængde fra bioreaktoren, der opnås ved både online- og off-line-måling, og den eksperimentelle gennemstrømning, illustreret i figur 1. Da ingen anordning endnu har løst alle udfordringerne i forbindelse med miniaturisering, dvs. nøjagtig efterligning af procesbetingelser i stor skala og samtidig bevarelse af den fulde funktionalitet af konventionelle bioreaktorer, er det forfatternes hensigt at gennemgå den nuværende udvikling og derefter angive, hvor teknologien sandsynligvis vil udvikle sig i fremtiden, således at de nuværende HT-fordele kan udvides, og den informationskløft, der i øjeblikket eksisterer mellem bioreaktorplatforme i miniature- og laboratorieskala, reduceres. I denne gennemgang er de forskellige MBR’er, der er beskrevet, grupperet på grundlag af deres omrøringsmetode (dvs. rystning, omrøring eller gasudladning) med henvisning til den type konventionel bioreaktor, som de enten efterligner eller er afledt af; de vigtigste specifikationer og karakteristika for prototyper og kommercielle miniaturecelle-dyrkningsapparater, der kan fungere parallelt, er opsummeret i tabel 1.

Miniature rystede bioreaktorsystemer

Rystede systemer har været anvendt i bioprocesser lige siden de allerførste forsøg på at dyrke antibiotikaproducerende mikrobielle kulturer i 1940’erne. De anvendes stadig i vid udstrækning i industrien og den akademiske verden som et redskab til lægemiddelopdagelse, medie-, stamme- og produktoptimering og procesudvikling . De omfatter mange forskellige udformninger og volumener, lige fra shake kolber på flere hundrede milliliter og helt ned til mikrotiterplader (MTP) med et volumen på få mikroliter.

Shake kolber

I de sidste 50 år har forskere anvendt celledyrkning i shake kolber som et middel til procesudvikling i lille skala, med volumener fra ca. 10 ml til 500 ml . Shake kolberne findes i mange forskellige udformninger, de kan være fremstillet af glas eller plast, og nogle af dem er forsynet med skråvægge for at fremme luftning og blanding. De kan omrøres ved hjælp af enten orbital eller lineær omrystning og kan anbringes i et temperaturkontrolleret kabinet. Blandt de faktorer, der påvirker dyrkningen af rystekolber, kan nævnes beholderstørrelse, fyldningsvolumen, konstruktionsmateriale, skillevæggenes geometri, rystningsfrekvens og den type prop, der anvendes til at forsegle beholderen. Büchs hævder, at rysteflasker anslås at blive brugt til over 90 % af alle dyrkningsforsøg i industrien og den akademiske verden, hvor der dyrkes en lang række mikroorganismer, f.eks. bakterier, svampe og gær samt pattedyrsceller . Det er let at se, hvorfor de er så udbredte: de er en billig og effektiv måde at udføre mange typer af industrielt relevante celledyrkning til procesudvikling på en reproducerbar måde. Desuden er de lette at betjene og stort set uimodtagelige over for mekaniske komplikationer. I det meste af den lange periode, hvor de blev anvendt, var der kun få væsentlige ændringer af teknologien, ingen online overvågning af kulturer og ingen manuelle tilsætninger og prøveudtagninger. Først for nylig er der blevet indført instrumenterede rystekolber, som er designet til at måle og potentielt kontrollere pH- og DOT-niveauerne online . pH og opløst ilt kan måles ved hjælp af et rutheniumoxidfarvestof, som fluorescerer kvantitativt ved tilstedeværelse af henholdsvis hydrogenioner og ilt, når det stimuleres med en LED-lampe. Dette farvestof kan enten inkorporeres i et plaster og fastgøres i en kolbe eller påføres spidsen af en fiberoptisk sonde og nedsænkes i den pågældende kultur. Andre parametre, der nu kan måles online, omfatter iltoverførselshastighed (OTR) og kuldioxidudviklingshastighed (CER) – og herfra kan respiratorisk kvotient (RQ) udledes . Når sådanne parametre overvåges online, kan der gennemføres mere sofistikerede celledyrkningsstrategier som f.eks. substrattilførsel baseret på ændringer i pH-værdien af kulturbouillon som følge af cellestofskifte . Desuden har Akgün et al. for nylig udviklet et nyt shake flask-system, der er i stand til kontinuerlig drift og dermed øger omfanget af parallel bioprocesudvikling ved hjælp af rystede systemer.

En væsentlig begrænsning af shake kolber er imidlertid deres afhængighed af overfladebeluftning, hvilket fører til reduceret iltoverførsel i forhold til omrørte tankreaktorer (STR’er). Wittmann et al. rapporterede samlede volumetriske masseoverførselskoefficienter (kLa) værdier på op til 150 h-1 i shake kolber. kLa værdier på 151 h-1 (600 ml, 200 rpm) til 277 h-1 (100 ml, 200 rpm) er blevet registreret i et nyt, kasseformet, shake kolbe system udviklet af Kato og Tanaka , som er tilstrækkeligt høje til at udføre de fleste batch celledyrkning uden at hæmme den mikrobielle vækst. Disse forskere inkorporerede gasgennemtrængelige membraner i de øverste hjørner af deres prototype-kolber, hvilket gav mulighed for en mere effektiv gasstrøm ind i beholderen under omrystning, hvorved de overvandt det problem, der findes i konventionelle shake-kolber, med at indføre mere luft i systemet på en steril måde. I forbindelse med dyrkning, hvor iltbehovet er højt, kan indførelsen af baffler øge OTR ved lavere omrystningsfrekvenser; høje hastigheder kan dog føre til overdreven stænkning, hvilket kan medføre, at den gasgennemtrængelige prop (ofte fremstillet af vat) i kolbens top bliver blokeret på grund af væskemætning. En sådan blokering har vist sig at reducere systemets evne til at overføre ilt alvorligt, hvilket kan give problemer, hvis der dyrkes en hurtigt reagerende aerobe . Iltmangel kan sænke væksthastigheden, ændre produktionsdannelseshastigheden og/eller generere uønskede giftige biprodukter, f.eks. acetatdannelse hos Escherichia coli .

Mikrotitreplader

MTP’er (også kaldet microwell-plader) blev først introduceret i 1951 som en platform for diagnostiske tests og anvendes stadig i vid udstrækning inden for biovidenskaberne . De håndterer diagnostiske test som f.eks. enzyme-linked immunosorbent assays, der udnytter muligheden for at udføre mange identiske reaktioner parallelt og i en meget lille skala. Det er denne fordel, der har ført til, at MTP’er er blevet anvendt som miniature rystede bioreaktorer i screeningsfasen af procesudviklingen til evaluering af cellelinjer . Pladerne er normalt fremstillet af plast, men der findes også glas- og metalversioner. Blanding kan opnås ved hjælp af pipetteudsugning eller magnetisk agiterede omrøringsstænger; orbital omrystning af hele pladen på en opvarmet blok, der er i stand til at kontrollere dyrkningstemperaturen, er dog langt den mest almindelige metode. Antallet af brønde i MTP’er er typisk 6, 12, 24, 96 og 384, og der findes nu op til 1536 og 3456 brønde til ultra-high-throughput screening (UHTS) . Brønde kan enten være rektangulære eller cylindriske, idet kvadratiske geometrier fremmer blanding og iltoverførsel ved at efterligne virkningen af baffler. Plader med firkantet bund virker på samme måde ved at begrænse hvirvling af væske inde i brønden og dermed øge turbulensen i systemet. På grund af det øgede overfladeareal som følge af større væskedissipation op ad siderne af hver enkelt mikropulje og den øgede drivkraft for ilt som følge af bedre opblanding er OTR proportional med rysteamplituden og -frekvensen, og det kan derfor være gavnligt at øge disse parametre. Hermann et al. har desuden rapporteret, at OTR er omvendt proportional med fyldningsvolumen, især ved højere rystningsfrekvenser . Der er imidlertid et punkt, hvor enhver forøgelse af omrøringen resulterer i spild af procesvæske (medmindre brønden er afdækket – hvilket har sine egne problemer med reduceret iltoverførsel til brønden). Som det er tilfældet med rystekolber, skyldes MTP’ernes relativt lave iltoverførselskapacitet (kLa værdier på op til 200 h-1 i 96 brøndplader), at de er rystede systemer og er afhængige af overfladebeluftning til masseoverførsel. I modsætning hertil rapporterede Kensey et al. kLa-værdier ved hjælp af sulfitoxidationsmetoden på op til 1600 h-1 i en MTP med 48 brønde og standardgeometri med 3 mm orbitalkast ved 1400 rpm ved brug af et fyldningsvolumen på 300 μl, hvilket kan sammenlignes med konventionelle STR’er. Ved at anvende en beregnet proportionalitetskonstant var dette hold i stand til at relatere den iltoverførselskapacitet, der er opnået ved hjælp af en kemisk metode, til biologiske medier.

Der findes også metoder til bestemmelse af kLa i lille skala, som giver data, der er direkte sammenlignelige med værdier, der er opnået under procesbetingelser. F.eks. har Duetz et al. og Doig et al. anslået kLa ved hjælp af massebalance under iltbegrænsningsbetingelser ud fra den lineære vækst af henholdsvis Pseudomonas putida i en MTP og Bacillus subtilis i en prototype af en miniaturebobbelkolonne-reaktor (MBCR). Desuden er den dynamiske udgasningsmetode ofte at foretrække frem for sulfitoxidationsmetoden til bestemmelse af kLa-værdier, da den normalt udføres i vand . Dette system er derfor koalescerende, og selv om det ikke er identisk med biologiske medier, er det mere repræsentativt for celledyrkningsbetingelser end natriumsulfitmetodens helt ikke-koalescerende betingelser. Denne teknik er imidlertid vanskelig at anvende i MTP’er, da det ofte er nødvendigt at standse rystningen før DOT-målingerne for at få nøjagtige målinger, hvorved masseoverførselsmiljøet ændres på et kritisk tidspunkt. På grund af de problemer, der er forbundet med anvendelsen af etablerede metoder til bestemmelse af kLa i MTP’er, har vi for nylig udviklet en ny metode, der er baseret på bio-oxidation af catechol ved hjælp af enzymet catechol-2,3-dioxygenase . Denne metode gav lignende kLa-værdier sammenlignet med den dynamiske gasningsmetode, og da den er hurtig og ikke kræver nogen antagelser om kinetikken, mener vi, at denne metode er velegnet til kLa-evaluering i MTP’er og andre anordninger i lille skala.

MTP’er lider også til en vis grad under netop den egenskab, der gør dem attraktive som en højgennemstrømningsanordning – små volumener – fordi fordampning kan fjerne en betydelig del af væsken i brønden . Der kan anbringes åndbare membraner oven på pladerne for at begrænse denne fordampning, men så er iltoverførselsevnen dog reduceret. Zimmermann et al. rapporterede om en membran, der opnåede en moderat grad af vandtilbageholdelse og iltoverførsel; kLa-værdierne blev imidlertid reduceret med en faktor fem, hvilket yderligere forværrer problemet med den lave iltoverførselsevne, der er indbygget i rystede systemer. Selv om fordampning er et potentielt problem i alle MBR-systemer, synes MTP’er at være mere modtagelige for dette problem, fordi de typisk anvender de mindste procesvolumener. MTP’er med 3456 brønde giver den højeste gennemstrømning af alle tilgængelige miniaturecellekultiveringsenheder og har vist sig kvantitativt at kunne opretholde væksten af CHO-celler (Chinese Hamster Ovary), selv om et så lille procesvolumen (1 – 2,2 μl) betyder, at denne enhed sandsynligvis ikke vil være i stand til at efterligne de mekanismer, som større rystede beholdere fungerer efter; f.eks. ville overfladespændingseffekter strække sig gennem hele brønden, hvilket alvorligt begrænser blandingskapaciteten. Desuden ville det ikke være muligt at fjerne mediet med henblik på off-line prøveudtagning.

Og selv om MTP’er anvendes i vid udstrækning i opdagelsesforskning, har de lidt under mangel på instrumentering på samme måde som shake kolberne, hvilket begrænser det udvalg af data, der kan indsamles. For nylig er der imidlertid blevet udviklet teknikker til at måle pH og DOT i sådanne systemer . Lye og kolleger har f.eks. undersøgt virkningen af pH-kontrol på biomasseudbyttet og vækstkinetikken for en filamentøs bakterie i en MTP . På trods af nogle af de iboende begrænsninger ved MTP’er, når der udføres celledyrkning, er der sket fremskridt med hensyn til karakterisering af disse beholderes blanding, masseoverførsel og instrumentering, hvilket betyder, at de unikke fordele ved disse anordninger med hensyn til automatiseringspotentiale og iboende HT-kapacitet fører til, at de i stigende grad anvendes som MBR’er på et tidligt stadie.

Spin tubes

Den tidlige udvikling af små pattedyrcellekulturprocesser i lille skala er traditionelt blevet udført i T-kolber og bioreaktorer i lille skala (ofte spinnerkolber, typisk med et volumen på 500 ml) . Selv om de oprindeligt stort set var udefinerede enheder, er der blevet arbejdet på at karakterisere det tekniske miljø i spinnerflasker, hvilket har gjort dem lettere at bruge som nedskalerede fartøjer . Ikke desto mindre er det en kendsgerning, at deres relativt store volumen gør dem ikke levedygtige som HT-teknologi, hvilket betyder, at der er et reelt behov for miniaturebioreaktorer, der kan anvendes sammen med pattedyrceller til parallelle celledyrkning. For nylig er spin tubes blevet udviklet og anvendt som et procesudviklingsværktøj i lille skala til dyrkning af pattedyrceller. Spinrørene, der først blev beskrevet af De Jesus et al., synes at have flere fordele i forhold til spinnerflasker, f.eks. mindre procesvolumen. De er siden blevet markedsført af ExcellGene SA (Valais, Schweiz) under navnet TubeSpin Satellites. Disse dyrkningsbeholdere består af modificerede 50 ml centrifugeringsrør, der er monteret på en roterende orbital shaker, som er anbragt i et inkubator. Kulturmængderne er 5 ml til 35 ml pr. reaktor, og off-line-analysen foretages ved hjælp af hele rør på offerbasis. Dette system har ikke de instrumenter, der er nødvendige for at udføre fuldt karakteriserede dyrkninger af pattedyrsceller; det er imidlertid et nyttigt redskab til medieoptimering og produktivitetsforbedring og giver udvikling af cellekulturer et højgennemløbsaspekt, idet udviklerne af dette system oplyser, at de kan behandle 1000 forskellige kulturer pr. uge. Det relativt store volumen og de lave fordampningshastigheder, der findes i denne anordning, er en fordel, når der er tale om langsomt voksende pattedyrsceller, hvor kulturerne kan vare mange dage, men det skal dog påpeges, at der ikke er foretaget nogen teknisk karakterisering af blanding og masseoverførsel i dette system, og derfor anvendes spinrør i vid udstrækning til screeningsformål.

Miniature stirred bioreactorsystemer

Miniature stirred bioreactors (MSBR’er) baseret på konventionelle STR’er er blevet udviklet som et alternativ til rystede MBR-systemer til tidlig procesudvikling og cellekarakterisering. Typisk er disse enheder nøje modelleret efter bioreaktorer i laboratorieskala og giver således større potentiale for overvågning og kontrol end andre miniature bioreaktorplatforme. De har normalt et procesvolumen, der ligger mellem MTP’er og rystekolber, og konstruktionsmaterialerne varierer meget, idet der anvendes Perspex , Pyrex , polymethylmethacrylat (PMMA) og rustfrit stål. Figur 2 illustrerer vores prototype af MSBR med et arbejdsvolumen på 18 ml, som er fremstillet af rustfrit stål og Pyrex og udstyret med optiske sonder til online måling af pH og DOT. Denne beholder er blevet karakteriseret med hensyn til blandingseffektivitet og iltoverførselsevne. Det har vist sig at være i stand til at efterligne konventionelle STR’er i celledyrkning med varierende reologi, forskydningsfølsomhed og iltbehov (dvs. den filamentøse bakterie Saccharopolyspora erythraea, der producerer erythromycin, og rekombinant E. coli, der producerer henholdsvis plasmid-DNA og antistoffragment). Enheden kunne med succes dyrke en række organismer på grund af dens relativt høje kLa-værdier (480 h-1 ved 7000 rpm ved hjælp af den dynamiske udgasningsmetode) og korte blandingstider (4,8 s ved 7000 rpm – over dobbelt så hurtigt som et 7 L kar baseret på samme specifikke effektindtag). De høje iltoverførselshastigheder understøttede væksten af hurtigt respirerende organismer (E. coli), mens en effektiv blanding gjorde det muligt for beholderen at opretholde homogene forhold ved håndtering af tyktflydende gæringsbouillon – som ofte forekommer ved dyrkning af filamentøse organismer. Omrøringshastigheden kunne også styres meget nøje, hvilket bidrog til at forhindre skader på shear-følsomme mycelorganismer gennem overdreven krafttilførsel. Desuden er beholderens effektforbrug ved gasning blevet målt, hvilket har resulteret i beregning af pumpehjulets effektantal over et bredt spektrum af driftsbetingelser og derfor gør det muligt at nedskalere celledyrkning på pålidelig vis på grundlag af samme specifikke effektindtag . Selv om denne MSBR er en prototype, ville det være muligt at multiplexe en sådan anordning for at opnå et højere gennemløb.

Ved at sørge for omrøring og aktivt beluftning af beholderen er masseoverførselshastigheder tæt på en konventionel STR i laboratorieskala blevet rapporteret for andre MSBR’er i litteraturen. Lamping et al. har f.eks. rapporteret kLa-værdier på 360 h-1 ved 1 VVM og 3000 rpm ved hjælp af den dynamiske udgasningsmetode i en prototype af en MSBR, hvis design svarer til det i figur 2 viste. Desuden har det samme hold med succes modelleret iltoverførslen i en prototype af en miniaturebioreaktor ved hjælp af CFD-analyse (Computational Fluid Dynamics), som var baseret på de relevante tekniske parametre for hastighedsfeltet, boblestørrelsen, gasophobningen og energispredningshastighederne inde i MBR.

Puskeiler et al. har for nylig rapporteret kLa-værdier på over 700 h-1 (12 ml volumen) og så høje som 1600 h-1 (8 ml volumen) for en MSBR, der omrøres ved 2300 rpm. Dette system anvender et nyt gasinducerende pumpehjul, der resulterer i en meget høj iltoverførselsevne. I denne undersøgelse blev den dynamiske udgasningsmetode anvendt til at måle kLa, selv om der blev anvendt ikke-koalescerende forhold, hvilket gør det vanskeligt at foretage en direkte sammenligning med værdier fra cellekultiveringsmedier eller koalescerende væsker. I samme artikel blev systemets evne til at opretholde fed-batch celledyrkning beskrevet, hvilket illustrerer potentialet i miniature bioreaktorteknologier til at understøtte sådanne industrielt vigtige strategier. Desuden blev det påvist, at det er muligt at foretage online overvågning og styring. Den i rapporten beskrevne anordning, der er udviklet i samarbejde med H+P Labortechnik AG (Oberschleissheim, Tyskland), er en integreret enhed (“Bioreaktorblok”), der kan understøtte op til 48 cellekulturer samtidig . Et integreret væskehåndteringssystem gjorde det muligt at måle pH-værdien i en time ved at dosere prøver på 20 μl i kommercielt tilgængelige MTP’er med påsatte pH-patches. Otte minutter senere justerede det samme væskeprøvetagningssystem så pH-værdien ved hjælp af 4 M NaOH. Selv om brugen af automatiseret væskehåndtering til pH-kontrol er en fin løsning, erkender forfatterne, at dette kan være upraktisk, hvis det anvendes i forbindelse med følsomme organismer, der kræver en mere responsiv pH-justering. Det fremgår imidlertid af rapporten, at et forbedret overvågningssystem er ved at blive udviklet sammen med industrielle partnere med henblik på hyppigere overvågning, hvilket kan øge antallet af samtidige fermenteringer, der kan overvåges effektivt. DOT blev målt i systemet ved hjælp af en prototype af en sensorblok med optiske sonder, selv om kun 8 reaktorer ud af 48 dyrkningsbeholdere blev overvåget samtidigt . En sådan anordning kan også integreres med standard robotudstyr til at udføre væskehåndteringsopgaver som f.eks. inokulering, fodring og prøveudtagning .

Med en anden fremgangsmåde har Fluorometrix Corporation (Stow, Massachusetts, USA) udviklet en MSBR-konstruktion med flere beholdere kaldet Cellstation®. Denne MBR anvender optisk teknologi til at muliggøre in situ on-line overvågning af op til 12 parallelle dyrkninger for pH , DOT og optisk tæthed (OD), og omrøringen sker ved hjælp af dobbelte skovlhjul af padletypen. Hver beholder har et arbejdsvolumen på op til 35 ml og er fastgjort til en karrusel, der roterer, så alle beholdere kan prøvetages og overvåges i rækkefølge. Det optiske sensorsystem er blevet valideret ved at påvise pH- og DO-sensorernes konsistens over en periode på 70 timer i en pattedyrcellekulturproces . Desuden har Raos forskningsgruppe ved University of Maryland, som har tætte forbindelser til virksomheden, for nylig offentliggjort oplysninger om to prototyper af MSBR-systemer med 24 brønde, som yderligere forbedrer denne teknologis gennemstrømning.

Parallelt med denne MSBR-udvikling har Dasgip AG (Jülich, Tyskland) introduceret Stirrer-Pro Flask, der er en del af deres Fedbatch-Pro® cellekultur-serie, som omfatter op til 16 kulturkar (arbejdsvolumen 200-275 ml) og tilbyder en omrøringsdrevet iltoverførselskapacitet og en fed-batch-kapacitet. pH og DOT kan overvåges ved hjælp af standardsteriliserbare sonder og styres uafhængigt for hvert kar ved automatisk tilsætning af syre/basevæske og variation af luftstrømmen/omrøringshastighed henholdsvis. Substrattilsætning kan knyttes til enten DOT- eller pH-udløserpunkter, hvilket giver mulighed for en fuldt automatiseret fed-batch-kapacitet. Kombinationen af mekanisk omrøring (mellem 10 og 1 000 omdrejninger i minuttet) og gassparging viser, at dette system er i stand til at understøtte hurtigt voksende bakteriekulturer med en høj celletæthed og derfor vil være nyttigt i forbindelse med udviklingen af sådanne bioprocesser. Det anvendte arbejdsvolumen er imidlertid relativt stort sammenlignet med de fleste af de andre behandlede systemer, og opsætningen er kompliceret på grund af et stort antal rør og ledninger til tilsætning og målinger. Der er også udviklet en variant af dette system, der indeholder op til 16 shakeflasker udstyret med pH-sonder, som giver mulighed for intermitterende fodring og parallel pH-kontrol.

Som et mindre alternativ til STR’er i laboratorieskala, der kan fungere parallelt, såsom Sixfors®-systemet udviklet af Infors AG (Bottmingen, Schweiz), har forskere ved University College London i samarbejde med HEL Groups BioXplore bioreaktorvirksomhed (Barnet, UK) udviklet og karakteriseret et MBR-system med 4-16 kamre med fuldt integreret og automatiseret kontrol af DOT og pH. Selv om hver beholder har et maksimalt arbejdsvolumen på 100 ml og dermed ligger i den øvre ende af MSBR-teknologien, er udviklingen af selvstændig software til overvågning af sådanne bioreaktorer et skridt i retning af at give MBR’er den samme grad af kontrol og automatisering som konventionelle bioreaktorer.

Miniature bubble column reactors

Bubble columns anvender gassparging i stedet for omrøring som et middel til at fremme blanding og iltmassetransport til celledyrkning. Som et alternativ til omrørte eller rystede anordninger har vi udviklet en miniatureboblesøjlereaktor (MBCR), der er baseret på en MTP med porøse membraner (fritter), der fungerer som hele grundlaget for hver enkelt brønd . Luft gennemtrænger fritten og strømmer op gennem hver brønd og tilfører ilt til hver enkelt voksende kultur. Forudsat at hver fritte er fremstillet efter en høj specifikation og har samme porøsitet, er strømningshastigheden til hver kolonne lige stor og kan beregnes. Dette forhindrer, at variationer i luftstrømningshastigheden påvirker resultaterne kunstigt.

Doig et al. beskriver i detaljer konstruktionen og karakteriseringen af en prototype af en MBCR med 12 brønde, som er i stand til at understøtte aerob dyrkning af Bacillus subtilis-kulturer, idet hver kolonne har et arbejdsvolumen på 2 ml. Der blev rapporteret kLa-værdier på op til 220 h-1 ved hjælp af den dynamiske udgasningsmetode ved en overfladisk gashastighed på 0,02 ms-1. En af fordelene ved denne type anordning er, at beluftningen i modsætning til en MTP sker via direkte sparging. Dette har den virkning, at systemets evne til iltmassetransport øges i forhold til en MTP, fordi sparging øger det overfladeareal, der er til rådighed for gas-væske-masseoverførsel, i forhold til overfladebeluftning alene. Selv om nogle kLa-data for MTP’er, der er beskrevet i denne gennemgang, er væsentligt højere end de målte MBCR-værdier, skal det påpeges, at mange af MTP-værdierne er udledt under ret kunstige forhold, der er udformet med henblik på at maksimere iltoverførslen, mens kLa-værdierne for MBCR, der er vist ovenfor, ville være reproducerbare under celledyrkningsforhold.

Ud over det store overfladeareal, der er til rådighed for iltoverførsel, betyder manglen på omrøring i MBCR’er, at strømtilførslen og dermed iltoverførslen er lettere at modellere end i STR’er, da der er færre parametre at tage hensyn til, idet den overfladiske gashastighed og boblestørrelsesfordelingen er nøgleparametre ved opskalering/nedskalering af boblekolonner . Endvidere er anordningen stationær i modsætning til rystet, hvilket gør det lettere at instrumentere den, da omrøringen af de fleste MTP-systemer skal stoppes, før der kan foretages måling i en pladelæser. Den mekaniske enkelhed kombineret med en potentielt høj iltoverførsel og nem prøvetagning gør MBCR’er velegnede til parallel celledyrkning. Dette kan bl.a. være med henblik på forbedring af medium eller stamme og procesudvikling på et tidligt stadium. MBCR’er kunne også anvendes til at efterligne og forudsige præstationen af store reaktorer. I den forbindelse har vi for nylig påvist en god korrelation mellem iltoverførselshastigheden og det volumetriske effektforbrug (P/V) for miniature- (2 ml) og laboratorieskala (100 ml) boblesøjler ved hjælp af gasdiffusorer med samme porestørrelse, hvilket gør det muligt at forudsige kLa som funktion af P/V . I samme arbejde viste vi også en sammenlignelig celledyrkningsydelse ved hjælp af MBCR i forhold til en STR i laboratorieskala baseret på samme kLa-værdier. Disse resultater viser, at MBCR har potentiale som en nedskaleringsanordning. Denne prototype af MBCR-enheden var ikke instrumenteret, selv om vi i efterfølgende arbejde har udstyret denne enhed med optiske fluorescenspletter og brugt den til at måle DOT under celledyrkning. Temperaturen kunne styres ved at koble apparatet til et vandbad og cirkulere temperaturreguleret vand gennem det lukkede rum mellem kolonnerne (se figur 3). Lignende MBCR’er er tidligere blevet udviklet af andre ; disse beholdere anvender dog volumener på ca. 200 ml og er derfor to størrelsesordener større end den af Doig et al. beskrevne anordning , hvilket begrænser den grad af parallel drift, der kan opnås.

Andre miniatureanordninger

MicroReactor Technologies (Mountain View, CA, USA) har ved hjælp af konceptet med en integreret sensorplade udviklet et hybrid celledyrkningssystem baseret på en rystet, bafflet MTP med 24 brønde med en brøndkonfiguration, der muliggør ensartet varmeoverførsel på tværs af pladen. Det foreslåede arbejdsvolumen for hver brønd varierer fra 3 til 5 ml, og luft indføres i væskefasen ved sparging gennem sintre i bunden af hver brønd, hvilket øger iltoverførselsevnen sammenlignet med tilsvarende designede rystede systemer. Denne nyligt markedsførte dyrkningsanordning (licenseret i Europa af Applikon Biotechnology AB, Nederlandene) er instrumenteret ved hjælp af fiberoptiske sonder til online overvågning af DOT og pH-værdi i alle brønde samtidig. Anordningen giver også mulighed for uafhængig styring af temperatur, DOT, pH-værdi (ved hjælp af gassparging) og luftgennemstrømningshastighed for alle 24 brønde. Enheden overvinder et af de grundlæggende problemer i forbindelse med MTP-baserede HT-enheder – nemlig hvordan man kan montere instrumentering i alle brønde i pladen – ved at fastgøre alle sensorpatches til bunden af hver brønd og derefter placere hele pladen på en rystende inkubatorplatform, der har integreret instrumenteringskredsløb, hvorved hver brønd kan overvåges uafhængigt af hinanden. Den vigtigste anvendelse vil sandsynligvis være i de tidlige faser af procesudviklingen (f.eks. udvælgelse af stamme og optimering af medium). Der er endnu ingen offentligt tilgængelige data om teknisk karakterisering af blanding og iltoverførsel og sammenligning af dyrkningsresultater med data fra bioreaktorer i laboratorieskala.

Der er for nylig sket en udvikling, der har til formål at reducere MBR’ernes skala til procesvolumener på under en milliliter. Selv om disse miniaturesystemer giver de største muligheder for HT-anvendelse, er der en praktisk grænse for, hvor små kulturvolumener kan blive. Enheder, der anvender for små procesvolumener, kan finde det umuligt at udføre dyrkninger med tilstrækkelig overvågning og prøveudtagning. Selv om OD, DOT og pH kan overvåges online, kan andre kritiske parametre som f.eks. substratkoncentration og produktudbytte ofte ikke overvåges; det kan dog være muligt at omgå dette problem for visse processer ved at inkorporere markører som f.eks. grønt fluorescerende protein i produktet . Fordampning kan blive et betydeligt problem i sådanne ekstremt små kulturvolumener, hvis man arbejder med lange bakterie- og pattedyrkningsprocesser; i betragtning af det ekstremt lille procesvolumen vil det også være en teknisk udfordring at kontrollere pH-værdien nøjagtigt gennem væsketilsætning. Ikke desto mindre repræsenterer driftsstørrelsen et radikalt fremskridt i udformningen af MBR’er og øger deres potentielle anvendelse til HT-parallel celledyrkning betydeligt.

I den forbindelse har Jensens forskningsgruppe ved MIT udviklet en sub-milliliter MBR-prototype, der er blevet modificeret og udvidet til et multiplexed system, der kan udføre otte instrumenterede mikrocelledyrkning med arbejdsvolumener på 150 μl . Ved hjælp af standardmetoder til mikrofremstilling er dyrkningsbrøndene af PMMA og poly(dimethylsiloxan) (PDMS) immobiliseret på en aluminiumsbase, der indeholder alle sensorelementer, og iltoverførsel er muliggjort via diffusion gennem en gaspermeabel membran og magnetomrørere, der kan styre omrøringen individuelt for hver enkelt reaktor. DOT, pH og OD kan overvåges online ved hjælp af optiske sonder. Gruppen rapporterede, at anordningen kan opretholde E. coli batch-dyrkning, men at DOT faldt til 0 % efter 2-3 timer, muligvis som følge af iltbegrænsning . Dette er sandsynligt i betragtning af, at den maksimale kLa-værdi, der blev målt i denne MBR, kun var 75 h-1. Ikke desto mindre viste forfatterne, at vækstadfærden var sammenlignelig med den, der blev opnået ved hjælp af en række større celledyrkningsapparater . Den samme forskningsgruppe har også detaljeret DNA-mikroarray-genekspressionsanalyse af E. coli dyrket i et 50 μl MBR . Dette arbejde markerer et reelt fremskridt i MBR-udviklingen, da det ikke blot viser et principbevis, men også muliggør en meget parallel analyse af genekspression og kan bruges til at forbedre forståelsen af cellens fysiologi under dyrkning ved hjælp af en tilgang på systemniveau . Maharbiz et al. rapporterede om udviklingen af en array-baseret anordning, der kombinerer mikrovællereaktorer med siliciummikrofabrikationsteknologi, som er i stand til at understøtte E. coli-dyrkning i otte 250 μl-brønde samtidig. I lighed med MIT-reaktoren (beskrevet ovenfor) var brøndene placeret på en bundplade, der indeholdt sensorer til pH- og OD-målinger (DOT blev ikke målt, men forfatterne anfører, at det ville være muligt). Ilt blev genereret elektrokemisk i hver kultur, og omrøring blev leveret af en perle af rustfrit stål, som blandede kulturen, spredte ilten og opløste overfladeskummet. Dette forskerhold fremlagde imidlertid ingen sammenlignende data i bench-scale, som kunne bruges til at afgøre, om opskalering ville være mulig fra en sådan anordning.

Et andet kommercielt system til HT-drift er blevet udviklet af Bioprocessors Corp. (Woburn, MA, USA). Dette celledyrkningsapparat (kaldet SimCell®) er i stand til at drive og uafhængigt styre op til 1500 kulturer, hvilket gør det muligt at anvende metoder til fuld faktoriel eksperimentel planlægning med henblik på procesoptimering . Denne “reactor-on-a-chip”-anordning er baseret på et mikrofluidisk design med en gaspermeabel membran, der muliggør iltoverførsel, og blandingen sker ved at dreje mikro-bioreaktor-array-chips i miljøkontrollerede inkubatorer med fugtet luft for at minimere fordampningen. Dette system kan være meget automatiseret og er integreret med en robot til overførsel af plader fra en inkubator til en målestation til måling af pH, DOT og celletæthed og en fluidikstation, hvor der kan tilsættes medier til fed-batch-drift og syre/base til pH-kontrol. Volumenet i hver reaktor varierer fra ca. 300 μl til ca. 700 μl afhængigt af anvendelsen (mikrobielle celler eller pattedyrceller), og hver reaktor kan drives i batch-, fed-batch- eller perfusionstilstand. Det har vist sig, at anordningen kan anvendes til dyrkning af E. coli og gær og giver en vækstkinetik, der kan sammenlignes med den, der opnås ved brug af konventionelle STR’er. Virksomheden har også beskrevet vækst af CHO-celler uden iltbegrænsning ved høj celletæthed og har anvendt CFD-simuleringer (Computational Fluid Dynamics) til at vise, hvordan det fysiske miljø, der ses i store bioreaktorer med pitched-blade, er blevet genskabt. kLa i systemet er blevet modelleret af CFD og anslået til mellem 60 og 500 h-1, værdier svarende til dem, der findes i shakeflasker og suboptimale STR’er .

MBR’er som et nedskaleringsværktøj

Det skal bemærkes, at ikke alle miniaturecellekultiveringssystemer er designet til opskalering/nedskalering af eksisterende bioprocesser; det er blevet nævnt i denne gennemgang, hvordan sådanne anordninger kan anvendes til mange anvendelser som f.eks. vurdering af rekombinant/vildtypeorganisme på et tidligt stadium, stammeforbedring og udvikling af vækstmedier. De miniaturesystemer, der anvendes i de senere faser af procesudviklingen, f.eks. til optimering af drifts- og kulturbetingelser, bør imidlertid kunne skaleres. Derfor er det afgørende, at veletablerede “tommelfingerregler”, der ofte anvendes i industrien til at skalere fra bench-top-processer til produktionsbeholdere, undersøges for at se, om de kan anvendes til at opskalere fra MBR’er . Disse gennemprøvede metoder omfatter skalering på grundlag af gassens effekt pr. volumenenhed, omrørers spidshastighed, konstant DOT, iltmassetransportkapacitet (kLa) eller blandingstid. Der findes dog ikke nogen “one size fits all”-metode, og det skal derfor understreges, at der ikke findes et enkelt grundlag for ækvivalens, der kan anvendes universelt på alle MBR’er. Ingen af de systemer, der er beskrevet i denne gennemgang, kunne anvende alle de etablerede opskalerings-/nedskaleringsmetoder, der er beskrevet ovenfor. Det er f.eks. vanskeligt at opnå en konstant DOT-værdi i rystede systemer sammenlignet med konventionelle STR’er, da manglen på mekanisk omrøring (og sparging – i tilfælde af MTP-baserede systemer) betyder, at det teknisk set er meget vanskeligt at kontrollere DOT-niveauet over et kritisk niveau i disse anordninger. Denne særlige egenskab er ikke i sig selv et problem, så længe de dyrkede celler er tilstrækkeligt langsomt voksende (enten naturligt eller ved brug af et svagt vækstmedium og/eller ved drift ved en temperatur, der ikke fremmer maksimal væksthastighed), men den begrænser brugen af sådanne systemer til at udføre mange processer med høj celletæthed, der involverer hurtigt voksende mikroorganismer med et højt iltbehov.

En indikation af, hvilket nedskaleringskriterium der bør anvendes for en bestemt bioproces (og dermed en indikation af, hvilken miniaturiseringsplatform der er at foretrække for den pågældende proces), kan opnås ved at undersøge cellekarakteristika og procesbetingelser for den pågældende bioproces. For en hurtigtvoksende organisme som E. coli eller Bacillus subtilis er det normalt iltoverførsel, der bliver begrænsende, mens skubbelastning sandsynligvis ikke vil være et stort problem; derfor kan nedskalering af en sådan celledyrkning udformes på grundlag af lige specifik effekttilførsel eller på grundlag af lige kLa. En forudsætning for at vælge samme kLa er imidlertid, at man kan foretage en nøjagtig vurdering af den tilførte effekt til miniaturebioreaktoren. Det arbejde, der er udført på UCL i en 10 ml MBR, bekræfter tidligere arbejde udført af Bujalski et al., som viste, at pumpehjulets effektantal falder med fartøjets diameter. Det er derfor vigtigt ikke at anvende impellereffekttal i konventionel skala til estimering af effekttilførslen i MBR’er, da dette kan føre til iltbegrænsning af mikrober, der reagerer hurtigt, ved at overvurdere den effekt, der overføres til systemet.

En særlig udfordring er væksten af filamentøse organismer på grund af deres komplekse morfologi. Gæringsbouillon, der indeholder sådanne organismer, har en forholdsvis høj viskositet og kræver ekstra effekttilførsel for at opretholde en passende opblanding og masseoverførsel. Desuden er filamentøse organismer meget større end encellede bakterier og kan være mere modtagelige over for skubskader. Heydarian et al. rapporterede f.eks., at den gennemsnitlige hyferlængde af den erythromycinproducerende bakterie Saccharopolyspora erythraea oversteg Kolmogorovs mikroskala for turbulens i en standard 7 L bioreaktor over et stort interval af driftsbetingelser . For S. erythraea er det blevet vist, at hvis mycelierne skæres for meget, hvilket resulterer i en for kort hyferlængde, kan dannelsen af erythromycinproduktet blive påvirket . Derfor kan det være tilrådeligt at vælge spidshastighed som grundlag for nedskalering, når der anvendes filamentøse organismer. Selv om de mekanismer, der styrer pelletdannelsen i filamentøse kulturer, ikke er velforståede, har Vecht et al. rapporteret en sammenhæng mellem faldende OTR og en reduktion i den gennemsnitlige pelletstørrelse i Streptomyces tendae . De konkluderede, at pelletdannelsen i denne organisme hovedsagelig skyldes hydrofobiske interaktioner, der kontrolleres af DOT. I betragtning af den skadelige virkning, som pelletdannelse kan have på produktionen af sekundære metabolitter i mange filamentøse organismer – på grund af hæmning af iltoptagelsen i pellets centrum, der stiger med pelletsdiameteren – er det klart, at MBR’er i forbindelse med nedskalering af filamentøse celledyrkningsprocesser skal opretholde de niveauer af opløst ilt, der findes i den storskalaproces, som nedskaleringsprocessen er baseret på, for at opretholde produktudbyttet. Lige kLa er vanskeligt at anvende til nedskalering, da det normalt beregnes i modelsystemer, der kun i ringe grad ligner de faktiske gæringsbouilloner. Desuden påvirkes kLa af ændringer i koalescens og reologi i kulturbouillon i løbet af en dyrkningsproces – ændringer, som er meget vanskelige at måle og tage højde for. Nøglen ved valg af grundlag for nedskalering af bioreaktorer er, at cellerne ikke udsættes for belastninger, der ligger ud over dem, der forekommer i stor skala.

Af de miniatureanordninger, der er omtalt i denne gennemgang, er det klart, at nogle søger at efterligne bioreaktorer i stor skala i deres geometri. F.eks. er de fleste MSBR’er og MBCR’er geometriske faksimiler af bioreaktorer i stor skala. At bevare den geometriske lighed har fordele for en effektiv skalasammenligning, da det gør det muligt at bevare nogle vigtige antagelser; f.eks. er det lettere at forudsige det hydrostatiske tryk og dermed iltopløseligheden ved forskellige driftsstørrelser, hvis man opretholder et lige stort højdeforhold. Dette giver sådanne anordninger en fordel, da deres mekanismer til at opnå iltoverførsel og -blanding og til beregning af den tilførte effekt kan baseres på de samme principper, som er fastlagt i stor skala. Fluiddynamikken vil være den samme, selv om det er vigtigt at bemærke, at nogle dimensionsløse tal, der beskriver fluiddynamikken, f.eks. Reynolds-tallet i omrørte beholdere, synes at have mindre indflydelse på så små skalaer . Mere grundlæggende er der et spørgsmål om, hvor effektive MBR’er kan være, når de når en så lille størrelse, at deres strømningsegenskaber og mekanismer for masseoverførsel og opblanding er anderledes end dem, der findes i de bioreaktorer i stor skala, som de forsøger at efterligne. MTP’er er særligt sårbare i denne henseende, da deres mangel på mekanisk omrøring betyder, at overfladespændingseffekter er vigtigere end i MSBR’er, hvor pumpehjul kan mindske denne effekt og bidrage til at opretholde en effektiv væskeblanding. Desuden er der fare for, når der anvendes ekstreme forhold med MTP’er (med hensyn til rystningsfrekvens og fyldningsvolumen), at al procesvæsken danner en tynd film langs brøndens indvendige overflade, hvilket i høj grad begrænser blandingen og forværrer den skadelige virkning af overfladespænding. Forskellige strømningsregimer i MBR’er som følge af forskellige omrøringsmetoder kan have en indvirkning på sådanne systemers evne til reproducerbart at udføre celledyrkning; hvis betingelserne er forskellige i lille og stor skala med hensyn til blanding og gas-væske-masseoverførsel, kan det føre til problemer, f.eks. udvælgelse af kloner, der ikke er egnede til produktion, eller forskelle i produktkvaliteten, især for rekombinante proteiner. På den anden side viser arbejde udført af Micheletti et al., at det er muligt at overføre skalaen fra rystede til omrørte systemer, hvis kriterierne for opskalering vælges omhyggeligt . Ved hjælp af en nyligt indført korrelation til kLa-forudsigelser i MTP’er var de i stand til at opskalere dyrkningen af E. coli, der overudtrykker et transketolaseenzym, fra et microwell-system (1 mL volumen) til et 1,4 L STR-system på grundlag af konstant kLa. Samme gruppe fremlægger også de første data om tilfredsstillende opskalering af en pattedyrcellekulturproces ved hjælp af en konstant gennemsnitlig energispredningshastighed .

Automatisering af MBR’er

Automatisering af MBR’er er nøglen til udvidelse af HT-kapaciteten. Flere af de miniaturesystemer, der er udviklet for nylig, anvender en modificeret MTP som udgangspunkt (f.eks. og Applikon MicroReactor®). Disse systemer ser i øjeblikket ud til at være meget lovende, fordi de er lette at integrere med eksisterende robot-automatiseringsplatforme. MTP’er, som sådanne systemer er designet på, er baseret på et standardiseret fodaftryk, er mekanisk enkle, og selve standardiseringen af deres design gør dem ideelle til at blive indbygget i automatiserede robotplatforme, der virkelig bringer sådanne teknologier ind på HT-området og giver dem mulighed for at udføre hundredvis af cellekultiveringer parallelt med et fodaftryk, der ikke er meget større end en konventionel bioreaktor i pilotskala. Alternativet er at udvikle et miniature-bioreaktorsystem, der i sig selv kan automatiseres. De teknologier, som Weuster-Botz’ gruppe i samarbejde med H+P Labortechnik og Bioprocessors Corp. har udviklet, er eksempler på denne fremgangsmåde. Sådanne anordninger tilbyder en vis grad af HT-kapacitet samt sofistikeret indbygget robotteknologi i tilfælde af Bioprocessors Corp’s SimCell®-system.

Robotteknologiske anordninger, der anvendes i forbindelse med MBR’er, er normalt udstyret med multiple-pipetteringshoveder monteret på arme, der er i stand til at bevæge sig i tre dimensioner over hele arbejdsområdet. Pipetteringshovederne kan også klare forskellige MBR-geometrier, og separate robotarme kan samle og placere hjælpeudstyr overalt i arbejdsområdet. Denne pick and place-funktion betyder, at én robot kan inokulere, pH-regulere, tage prøver og foretage tilføjelser til en MBR, hvilket giver en virkelig integreret løsning. Desuden kan robotter forbinde celledyrkningsplatforme med analyseinstrumenter (f.eks. HPLC-systemer) og udføre komplekse analyser som f.eks. ELISA for antistofprodukter ved hjælp af realtidsprøver – analyser, der udnytter robottens evne til at udføre tusindvis af væskehåndteringsoperationer i løbet af kort tid. Aseptiske betingelser for cellekultivering kan opretholdes ved at indkapsle robotten i et specialbygget biosikkerhedsskab.