Ny indsigt i ANGPLT3 i kontrollen af lipoproteinmetabolismen og risikoen for kardiovaskulære sygdomme

ANGPTL3’s rolle i lipidmetabolismen ved at forstyrre lipoproteinclearance

Det cirkulerende niveau af TG er relateret til lipolysehastigheden af TG-rige lipoproteiner (TRL’er). Tre lipoproteinlipaser, herunder LPL, EL og hepatisk lipase (HL), er ansvarlige for lipolysen af TG i lipoprotein. Som nævnt ovenfor er LPL det hastighedsbegrænsende enzym, der spiller en afgørende rolle i lipolysen af TRL’er i cirkulationen, og LPL-aktiviteten i hvidt fedtvæv (WAT) øges i spisetilstand, mens den mindskes i fastende tilstand . EL, der er placeret i lumen af vaskulære endotelceller, er mere specifik i hydrolysen af lipoproteinphospholipider, især i HDL-partikler, snarere end TG . Tidligere resultater har vist, at både LPL- og EL-aktiviteten var øget hos Angpt3-/- mus, ledsaget af ophobning af TRL’er i BAT og muskler i stedet for WAT. Disse resultater antydede, at og TG i apolipoprotein blev importeret i BAT og muskel i stedet for WAT, hvilket giver beviser for, at ANGPTL3 tydeligvis kunne hæmme LPL- og EL-aktivitet , forhindre TG i hydrolyse og derefter fremskynde fjernelsen af partikler rige på TG . Der var ingen rapport om øget HL-aktivitet ved ANGPTL3-mangel.

For flere år siden blev der stillet et spørgsmål om mekanismen mellem ANGPTL3-mangel og lave LDL-C-niveauer. Da LPL eller EL ikke har den funktion at hydrolyserer kolesterylestere, var spørgsmålet stadig uopklaret. I 2015 observerede Wang, at både vildtype mus og Ldlr, Lrp1 eller ApoE knockout mus havde næsten samme niveauer af LDL-C efter behandling med Angptl3 antistof; desuden havde hver gruppe meget på én grad af reduktion i LDL-C niveauer . Vi kunne således udlede af disse resultater, at reduktionen af LDL-C i Angptl3-mangelsvage mus ikke var forårsaget af øget kolesterolclearance gennem LDL-receptoren. Den nedsatte syntese af VLDL-C kan være den plausible forklaring.

Rollen af ANGPTL3 i påvirkning af lipoproteinproduktion

Flere tilgange kan fremme den hepatiske VLDL-syntese, og den vigtigste tilgang er afhængig af gyldigheden af TG syntetiseret fra tilførslen af plasma FFA fra adipocytter lipolyse , VLDL og CM-rester og monosaccharidet transporteret gennem portvenen . I mellemtiden kan insulinsignalvejen også påvirke hepatisk VLDL-syntese og sekretion på grund af insulinets direkte virkning ved at mindske lipidering af TG-rige VLDL-partikler .

Forskerne har allerede fundet, at hepatisk VLDL-TG-sekretion ikke blev ændret i KK/Snk-mus sammenlignet med KK-mus af vildtype, i mellemtiden viste disse KK/Snk-mus heller ingen signifikant forskel i produktionshastighederne af apolipoprotein B-100 (apoB100) og mængden af sekretionerede VLDL-partikler . Interessant nok har undersøgelser foretaget for at undersøge virkningen af ANGPTL3 på lipolysen i 3 T3-L1 adipocytter og fandt, at inkubation med human ANGPTL3 kunne øge frigivelsen af FFA i mediet, svarende til effekten af epinephrin . Disse observationer var i overensstemmelse med de rapporterede lave FFA-niveauer hos personer med ANGPTL3 LOF-mutation. Da KK/Snk-mus udviste ekstremt lavere TG-koncentration og FFA i plasma, tyder det på, at reduceret lipidering af VLDL i ANGPTL3-mangelmus kan være forårsaget af nedsat tilførsel af FFA fra cirkulationen til leveren, hvilket resulterer i en nedsat mængde TG i hver VLDL-partikel. Derudover har en anden undersøgelse med ANGPTL3-mangelhepatocytter fundet, at silencing af ANGPTL3 kunne forårsage et skift i at udnytte monosaccharid i plasma i stedet for FFA , hvilket også gav beviser til teorien om fortyndet FFA tilført i leveren.

Colesterol og andre kolesterolmetabolitter, enten syntetiseret af leveren eller indtaget fra vores daglige kost , er de naturlige ligander for LXR . Som tidligere beskrevet kunne den aktiverede LXR stimulere galdesyreudskillelse og lipogenesens fremskridt, i mellemtiden kunne den fremme omvendt kolesteroltransport formidlet af HDL og dermed beskytte leveren mod overdrevent kolesterol . Undersøgelser har vist, at syntetiske LXR-ligander og en kost med højt kolesterolindhold kunne inducere genekspressionen af hepatisk ANGPTL3 . Da ANGPTL3 er et downstream-mål for LXR, er det værd at bemærke, at reduceret tilgængelighed af substrater kan mindske hepatisk syntese af kolesterol, hvilket resulterer i sekretion af kolesterolfattigt VLDL i ANGPTL3-mangelsvage mus . Tværtimod kan et lavt LXR- og lavt ANGPTL3-ekspression (ved ANGPTL3-mangel eller inaktivering af ANGPTL3) derfor være forbundet med et lavere kolesterolniveau i leveren . Vi kunne således ud fra disse resultater udlede, at reduktionen af LDL-C i Angptl3-mangelmusene i det mindste delvist skyldtes den nedsatte syntese af VLDL-C. Forsøg er i gang for yderligere at undersøge mekanismens potentiale.

Den indirekte virkning af ANGPTL3 på lipidmetabolismen ved at forstyrre insulinfølsomheden

Men selv om ANGPTL3’s rolle i lipidmetabolismen er relativt klar, er forholdet mellem ANGPTL3 og insulinfølsomhed fortsat usikkert. Kun få undersøgelser har påvist ANGPTL3’s rolle i reguleringen af insulinfølsomhed og glukosemetabolisme. I 2013 sammenlignede Rebciuc og kolleger insulinfølsomhed hos bærere af den homozygote og heterozygote LOF-mutation i ANGPTL3 med ikke-bærere. De fandt, at plasmainsulin, glukose og homeostatic model assessment of insulin resistance (HOMA-IR) var signifikant lavere hos homozygote forsøgspersoner sammenlignet med heterozygoter og ikke-bærere forsøgspersoner, hvilket tyder på, at homozygoter havde højere insulinfølsomhed end hos heterozygoter og ikke-bærere forsøgspersoner . Disse data manifesterede ANGPTL3 kan påvirke insulinfølsomheden og spille en rolle i modulering af glukosemetabolismen hos mennesker. Desuden fandt Wang et al., at plasmakoncentrationer af glukose og insulin er sammenlignelige mellem Angptl3-/- og wild-type genotyper hos mus, og Angptl3-/- mus udviste en højere optagelseshastighed af deoxyglukose i WAT, BAT og hjertet . In vitro-undersøgelser anvendte de immortaliserede humane hepatocytter og fandt også, at ANGPTL3-mangel tydeligvis kan øge optagelsen af deoxyglucose . Interessant nok var ANGPTL3’s virkning på insulin- og glukosemetabolisme gensidigt. Data fra Tikka et al. har afsløret, at både insulin og rosiglitazon kunne mindske sekretionen af ANGPTL3 på en dosisafhængig måde, og silencing af ANGPTL3 forbedrede glukoseoptagelsen i hepatocytter med ca. 45% .

Baseret på det faktum, at ANGPTL3 og insulin interagerer, kunne vi foreslå den indirekte effekt af ANGPTL3 på lipidmetabolismen ved at forstyrre insulinfølsomheden. Samlet med disse konklusioner kan vi spekulere i, at silencing af ANGPTL3 kan forbedre insulinfølsomheden og øge glukoseoptagelsen og udnyttelsen af perifere organer.

Funktionen og mekanismen af ANGPTL3 i inhiberingen af LPL-aktivitet

Da ANGPTL3’s funktion i inhiberingen af LPL-katalytisk aktivitet er blevet godt demonstreret, har forskerne undersøgt mekanismen af ANGPTL3 og LPL-aktivitet. For det første bidrager den unikke struktur af ANGPTL3-peptidet til den hæmmende virkning af ANGPTL3. ANGPTL3-peptidets N-terminale coiled-coil-region indeholder tre vigtige aminosyrer, asparaginsyre, histidin og glutamin , som kan forhindre LPL i at binde sig til glycosylphsphatidylinositol-forankret højdensitetslipoproteinbindingsprotein 1 (GPIHBP1) , et protein, der udtrykkes på kapillære endotelceller og transporterer LPL til stedet i kapillærlumen. Dette fremskridt kan reducere LPL’s aktivitet hos mennesker. I 2009 fandt Yau og hans gruppe desuden, at ANGPTL3 kunne fremskynde LPL’s udfoldningsforløb, idet det fremmer dissociationen af katalytisk aktive LPL-dimerer til inaktive LPL-monomerer, hvilket fører til en tydelig reduktion af LPL-aktiviteten . De fandt også, at selv om ANGPTL3 og ANGPTL4 havde lignende, men ikke identiske veje til at reducere LPL-aktiviteten, er ANGPTL3’s effektivitet med hensyn til at hæmme LPL meget svagere end ANGPTL4’s . Desuden demonstrerede Liu og hans kollega i 2010 for en anden potentiel mekanisme for ANGPTL3 og LPL-aktivitet. De viste, at ANGPTL3 stimulerer den ekstracellulære spaltning af LPL af furin, og simuleringen kunne resultere i dissociation af LPL fra celleoverfladen og reduktion af de katalytiske funktioner af LPL .

Så ved at syntetisere alle de ovennævnte data kan vi spekulere i, at ANGPTL3 har en meget lavere effekt på LPL end ANGPTL4. ANGPTL3’s mekanisme i LPL-aktivitet kan involvere udfoldning af dimerstruktur af LPL og forhindrer LPL i at binde sig til GPIHBP1. Endelig er en vigtig forskel mellem de to proteiner, at ANGPTL3 hæmmer LPL gennem en endokrin vej, og ANGPTL4’s virkning på LPL kan være gennem autokrine veje og lokale parakrine.

Funktionen af ANGPTL3 i fremme af dyslipidæmi og risikoen for CVD

Der er betydelig dokumentation, der afslører, at forhøjet niveau af plasma LDL-C er de uafhængige risikofaktorer for CVD . For nylig har andre undersøgelser også vist, at forhøjede plasma TG-niveauer også spiller en vigtig rolle i udviklingen af CVD . En målrettet indsats mod LDL-C og TG kan effektivt forhindre udviklingen af CVD. Da både personer med LOF-mutationer i ANGPTL3 eller mus med Angptl3-mangel har en lipidsænkende lipoproteinprofil og reduceret plasmaniveau af LDL-C og TG, kunne vi spekulere i, at ANGPTL3-mangel kan føre til en lav risiko for CVD hos mennesker.

Rapporten fra Deway afslørede, at hos 45.226 personer havde bærere af en LOF-mutation i ANGPTL3 27% lavere TG-niveauer og 9% lavere LDL-C-niveauer end ikke-bærere . Hos 13 102 personer med CVD var tilstedeværelsen af en LOF-mutation i ANGPTL3 forbundet med en 41% lavere risiko for CVD. For det andet brugte forfatterne APOE*3 Leiden.CETP-mus til at undersøge virkningerne af et monoklonalt antistof mod ANGPTL3-antistof, Evinacumab. Som forfatteren rapporterede, var Evinacumab-behandling forbundet med en tydelig reduktion af det samlede kolesterolniveau og TG-niveauet . Desuden kunne Evinacumab også føre til et betydeligt større fald i det aterosklerotiske plaqueområde i aortakroppen . Disse resultater er en stærk illustration af forholdet mellem ANGPTL3 og risikoen for CVD.

En anden seneste rapport er fra Stitziel og hans kolleger offentliggjort i 2017, som bekræftede den direkte sammenhæng mellem ANGPTL3, dyslipidæmi og risikoen for CVD gennem tre forskellige metoder. For det første fandt Stitziel, at de tre personer, der var bærere af homozygote mutationer i ANGPTL3, ikke viste tegn på koronar aterosklerotisk plaque sammenlignet med ikke-bærere . For det andet brugte de en metaanalyse til at undersøge mere end 180.000 personer, herunder 21.980 personer med CVD, og observerede, at ca. 1 ud af 309 personer var heterozygot bærer af en LOF-mutation ved ANGPTL3-gensekventering. Selv om denne mutation er sjælden, havde de heterozygote bærere ca. 34 % lavere risiko for CAD sammenlignet med ikke-bærere. Det er bemærkelsesværdigt, at der var en reduktion på 17,3 % i plasma TG og en reduktion på 11,8 % i LDL-C. Plasma-HDL-C blev imidlertid også reduceret med ca. 5,2 %, selv om forskellene ikke er statistisk signifikante . Denne del af dataene afslørede, at LOF-mutation i ANGPTL3 kunne reducere risikoen for dyslipidæmi hos mennesker sandsynligvis via en reduktion af niveauet af LDL-C og TG, ikke niveauet af HDL-C . Endelig observerede forskergruppen, at risikoen for myokardieinfarkt blev reduceret med 29% sammenlignet med den højeste tertil af personer med den laveste tertil af ANGPTL3 hos 1493 patienter med CVD og 3231 kontroller, efter justering for plasma LDL-kolesterol og TG . Indtil videre var dette det eneste resultat, der afslørede forholdet mellem plasmakoncentrationen af ANGPTL3 og risikoen for CAD , hvilket tyder på, at ANGPTL3 kan påvirke forløbet af CAD via en uafhængig metode ud over sin funktion til at kontrollere lipidmetabolismen.

Ud over den hæmmende egenskab over for LPL kan ANGPTL3 også undertrykke aktiviteten af EL , hvilket kunne forklare fænomenet for det nedsatte HDL-C-niveau hos mus med Angptl3-mangel og hos personer, der bærer LOF-mutation i ANGPTL3. Data fra Stitziel offentliggjort i 2017 viste imidlertid, at LOF-mutationen i ANGPTL3-bærere med LOF-mutation i ANGPTL3 hos 20.092 individer udviste 5,2 % reduktion i HDL-C . I mellemtiden præsenterede Deway også et resultat, at i 45,036 deltagere i DiscovEHR-undersøgelsen reducerede niveauet af HDL-C omkring 6,1% i LOF-mutation af ANGPTL3-bærere . Således er den biokemiske mekanisme og forholdet mellem ANGPTL3 og EL fortsat uklar.

Samarbejdet mellem ANGPTL3 og ANGPTL8 i styring af lipidmetabolisme

Både ANGPTL3 og ANGPTL8 er sekretede proteiner og viser en effekt af at hæmme LPL-medieret plasma TG hydrolyse. Co-ekspression med ANGPTL3 kan i høj grad øge sekretionen af ANGPTL8 . Flere undersøgelser har undersøgt, om disse to ANGPTL-proteiner kan interagere med henblik på regulering af LPL-aktiviteten. De fandt, at ANGPTL3 og ANGPTL8 kunne samarbejde om reguleringen af plasma TG-niveauet . Som tidligere nævnt kunne henholdsvis Angptl3 og Angptl8 overekspression begge føre til dramatisk forhøjede serum TG-niveauer hos mus, men Quagliarini fandt imidlertid, at Angptl8 synes at være inaktiv i Angptl3-/- mus, mens Angptl8 i tilstedeværelse af Angptl3 kan reducere LPL-aktiviteten mere effektivt. I mangel af ANGPTL8 faldt ANGPTL3’s evne til at hæve plasma TG-niveauet derimod svagt i mangel af ANGPTL8 . I en anden undersøgelse observerede Chi også, at ANGPTL3 eller ANGPTL8 alene kun kunne hæmme LPL ved koncentrationer, der langt oversteg de fysiologiske niveauer, især når LPL var bundet til sin endothelcellereceptor GPIHBP1. ANGPTL8 kunne imidlertid fremme ANGPTL3’s evne til at hæmme LPL, men kun når de to proteiner blev co-eksprimeret i den samme 293 T-celle . Proteininteraktionsanalyser i denne undersøgelse viste også, at ANGPTL8 i høj grad øgede ANGPTL3’s evne til at binde LPL, hvilket indikerer, at en fysisk interaktion mellem ANGPTL3 og ANGPTL8 kan forårsage dette funktionelle samarbejde.

Biokemiske undersøgelser har nemlig vist, at ANGPTL3 og ANGPTL8 kunne co-immunopræcipiteres i musenes plasma eller i kulturmediet af celler, der udtrykker begge proteiner . Haller har foretaget en intensiv undersøgelse, og der er fremlagt nogle beviser for at verificere, om ANGPTL3 skal danne et kompleks med ANGPTL8 for at gøre sig selv mere aktiv i forhold til at hæmme LPL. Ved hjælp af en muteret form af ANGPTL3, der mangler LPL-hæmmende aktivitet, viste Haller, at ANGPTL3-aktivitet ikke var påkrævet for dens evne til at aktivere ANGPTL8 , og at samekspression af Angptl3 og Angptl8 kunne føre til en langt mere effektiv stigning i TG hos mus end Angptl3 alene , hvilket tyder på, at den vigtigste hæmmende aktivitet af dette kompleks stammer fra ANGPTL8. Et antistof mod ANGPTL8’s C-terminus kunne vende den hæmmende virkning på LPL af ANGPTL8 i tilstedeværelse af ANGPTL3. Antistoffet forstyrrede ikke ANGPTL8-ANGPTL3-komplekset, men kommer tæt på det LPL-hæmmende motiv i ANGPTL8’s N-terminus i ANGPTL8 . Samlet set antydede disse data, at ANGPTL3 kunne fungere som en bindingspartner og aktivator for ANGPTL8, og ANGPTL8 kunne fremme sin egen evne til at hæmme LPL og øger plasma TG-niveauerne i tilstedeværelse af ANGPTL3.