Ny indsigt i apoptosoms struktur og funktion

Den tidlige strukturelle information var afgørende for at afsløre domæneorganisationen af apoptosomet. Det humane apoptosom indeholder syv Apaf-1-molekyler, der er symmetrisk arrangeret i en hjulformet struktur for at danne et centralt nav bestående af NOD’er med syv forlængede HD2-arme, der hver især ender i et V-formet område, der er dannet af de to β-propeller . α/β-foldningen af NBD og HD1 binder ADP/dATP mellem sig, mens WD40-repeterne danner de 7- og 8-bladede β-propeller . I modsætning til tidligere forslag blev det fundet, at laterale interaktioner mellem α/β-foldningen af tilstødende Apaf-1-molekyler bruges til at organisere det centrale nav, mens N-terminale CARD’er sidder over denne ring og er uordnede i fravær af pc-9 (PDB 3J2T) . Nylige nær-atomare strukturer har imidlertid vist, at Apaf-1 CARDs danner et disk-lignende træk på overfladen af det aktive apoptosom i tilstedeværelse af pc-9 CARDs, og dette arrangement adskiller sig fra det, der findes i CED-4 og Dark (fig. 1 og 2) . Stabiliteten af den centrale hub opretholdes af et komplekst netværk af α-helikale interaktioner, hydrogenbindinger og saltbroer mellem tilstødende NBD- og HD1-moduler fra tilstødende Apaf-1-molekyler . WHD/HD1-kontakterne på tilstødende protomerer ser ud til at understøtte apoptosomassamlingen med WHD-domæner, der bygger bro over tilstødende NBD- og HD1-domæner . Som det sker i Mørk, er ISM-helixen i Apaf-1 (α12) parret med helix α13 gennem omfattende hydrofobiske interaktioner for at danne et helix-loop-helix-motiv i hver underenhed, som igen interagerer lateralt med tilstødende underenheder for at danne et spiralformet pæletræhegn, der angiver den centrale pore i ringen .

I sunde celler findes Apaf-1-monomerer i en lukket, inaktiv konformation med ADP indlejret i en spalte i grænsefladen af NBD-HD1 (PDB 1Z6T, 3SFZ) . Denne lukkede konformation antyder, at der er behov for omfattende konformationsændringer af monomeren for at lette apoptosom-samlingen. I modsætning til apoptosomdannelse i C. elegans og Drosophila binder cytochrom c frigivet fra mitochondrier under apoptosesignalering til monomer Apaf-1, hvilket udløser konformationsændringer, der fører til nukleotidudveksling (ATP eller dATP kan erstatte ADP) og efterfølgende oligomerisering af en udvidet Apaf-1 for at danne apoptosomet (Fig. 3) . For at forstå de konformationsændringer, der finder sted, er der behov for nøjagtige modeller af inaktive og forlængede tilstande af Apaf-1. Der er blevet bestemt to krystalstrukturer af inaktive Apaf-1-monomerer med bundet ADP, hvor den ene mangler β-propellerne og den anden mangler de N-terminale CARD-domæner for at lette krystalliseringen. NOD i disse to krystalformer er imidlertid stort set identisk, og dette har gjort det muligt at konstruere en konsensusmodel for hele Apaf-1 monomeren med bundet ADP . Flere grupper har nu opnået næsten atomare strukturer af det humane apoptosom ved hjælp af enkeltpartikel-kryo-EM, som giver indsigt i den udvidede konformation af Apaf-1 i fravær og tilstedeværelse af pc-9 (PDB 3JBT, 5JUY, 5WVE; Fig. 3) . Som forudsagt er konformationen af Apaf-1 i den centrale hub, HD2-armene og den regulerende region stort set identisk i både inaktive og aktive apoptosomer . Disse undersøgelser har givet vigtige detaljer om specifikke rester, der er involveret i interdomæne van der Waals-kontakter inden for enkelte Apaf-1-molekyler, afsløret rester, der er kritiske for domæneinteraktioner, der stabiliserer det aktive apoptosom, og vist interaktioner inden for det V-formede sensordomæne i tandem 7- og 8-bladede β- propeller, som danner cytokrom c-bindingsfladen

I Apaf-1 apoptosomet er dATP-bindingsstedet placeret ved NBD-HD1-grænsefladen og er delvist dannet af Walker A-loop’en og loop’en mellem HD1 og WHD. Mens Apaf-1 kan binde ADP i den inaktive tilstand, er der en lille præference for at bruge dATP til apoptosom samling in vitro (gennemgået i ref. ), mens ATP er meget mere rigeligt in vivo (~ 2 mM for ATP vs. 10 μM for dATP). . En vis stabilisering sker gennem interaktioner mellem en argininrest (Arg265) i NBD’en sammen med Ser325 og Tyr359 i HD1 og det bundne ATP/dATP-molekyle. En rotation af NBD-HD1-parret om α-helix 20 i WHD placerer HD1-WHD-loop’en i bunden af nukleotidlommen , hvilket gør det muligt for NBD-HD1-parret at danne omkredsinteraktioner inden for den centrale hub under samlingen . Dette bryder også interaktioner med WHD, der normalt stabiliserer en lukket konfiguration .

Sensor β-propeller og cytochrom c-binding

Apoptosomhjulets “eger” rager udad fra navet ved HD2-domænerne, og hver arm danner basen af den V-formede region, der indeholder de to β-propeller-sensor-domæner. I den længste Apaf-1 isoform, (Apaf-1XL), som er udtrykt i de fleste væv , danner de femten WD40 gentagelser tandem 7 og 8-bladede β-propeller, og en nylig cryo-EM undersøgelse viste, at dette har en ny lukkemekanisme . Denne topologi af β-propellerne ligner den, der findes i actin interagerende protein (Aip1p), hvor linkeren fra HD2 danner d-strengen af det sidste blad i den 8-bladede β-propeller (angivet af den lille blå region, der er til stede i begyndelsen af 7-bladet propeller i fig. 1a), før den krydser over for at danne 7-bladet β-propeller . Denne topologi blev verificeret af en krystalstruktur af murin Apaf-1 ved 3,0 Å opløsning og synes at være bevaret i de mørke β-propeller .

I Apaf-1 apoptosomet danner de V-formede β-propeller den cytochrom c-bindingslomme, og interaktionen med cytochrom c synes at være stabiliseret ved hjælp af hydrogenbindinger og saltbroer . Både reducerede og oxiderede former af cytokrom c kan interagere med apoptosomet for at formidle dets aktivering . Det er interessant, at cytokrom c synes at interagere fortrinsvis med den 8-bladede β-propeller, mens der dannes en mere begrænset kontaktflade med den 7-bladede β-propeller . Cytochrom c er opløst ved ~ 6 Å opløsning i de nye kort, på grund af lokal bevægelse, og molekylet er roteret ~ 90°, i forhold til en tidligere model baseret på molekylær docking i et kort, hvor helicer ikke blev opløst . Directed mutagenese afslørede kritiske rester i cytochrom c, der er nødvendige for stabil association med Apaf-1 β-propeller, og nogle af disse rester (G56, P76, I81) er vigtige for apoptosomdannelse og efterfølgende caspaseaktivering .

Truncated Apaf-1 molekyler, der mangler WD-40 gentagelsesregioner, kan også samles for at danne apoptosomer, der er konstitutivt aktive, men som adskilles over tid . Dette har antydet, at β-propeller kan være noget hæmmende for samling, mens de også stabiliserer Apaf-1 apoptosomet . β-propellerne i Apaf-1-apoptosomet er imidlertid placeret ved høj radius og interagerer ikke med tilstødende underenheder, og de interagerer heller ikke med andre domæner i monomeren, med undtagelse af HD2. Derfor er destabiliseringsmekanismen fortsat mystisk. Selv om det er spekulativt, kunne manglen på β-propeller i trunkerede apoptosomer svække HD2-interaktionerne med det centrale hub, hvilket fører til en tidsafhængig adskillelse.

Det er nu klart, at cytokrom c-binding forårsager en opadgående rotation af β-propeller-regionen, hvilket afbryder forbindelsen mellem den 7-bladede β-propeller og NBD-HD1-parret i den inaktive Apaf-1-monomer , mens den 7-bladede β-propeller roterer mod den 8-bladede β-propeller i en klemmende bevægelse . Disse hændelser destabiliserer den autoinhiberede Apaf-1 konformation og letter nukleotidudveksling ved at fremme konformationsændringer, der eksponerer ADP-bindingslommen for at muliggøre ATP/dATP-binding . Dette stabiliserer Apaf-1-monomeren i en udvidet konformation, således at den kan interagere med naboprotomererne. Båndforskydningsforsøg tyder på, at nukleotidudveksling og tilknyttede konformationsændringer i Apaf-1 kan forekomme som reaktion på cytochrom c-binding, fordi der ikke blev påvist væsentlige ændringer i Apaf-1-konformationen ved tilsætning af dATP i fravær af cytochrom c . Samlet set understøtter disse data en sekventiel model, hvor cytokrom c-binding sker før nukleotidudveksling for at lette overgangen fra en lukket til en udvidet Apaf-1-konformation. Desuden tyder disse resultater på, at WD40-repeats fungerer som sensorer, der udløser den indledende apoptosom samling ved at binde cytochrom c.

Mulige mekanismer for procaspase-9 aktivering

Procaspase-9 rekrutteres af apoptosomet til at danne et holoenzym, der øger dets katalytiske aktivitet . I opløsning er pc-9 en konstitutiv monomer, når den ikke er bundet til Apaf-1, mens aktive caspaser generelt er dimerer . Det er bemærkelsesværdigt, at et dimerisk samspil mellem to pc-9-monomerer i et krystalgitter fremmer dannelsen af et aktivt sted på den ene katalytiske underenhed, mens den anden underenhed forbliver i en inaktiv konfiguration (PDB 1JXQ), og et lignende fænomen forekommer i CED-3-dimere ved høj koncentration . Det N-terminale CARD i pc-9 interagerer med Apaf-1 CARD(s) for at rekruttere den apikale procaspase til apoptosomet, og dette fremmer aktivering af det katalytiske domæne, som er adskilt fra CARD’et af en lang linker (fig. 2a) . Desuden er p20- og p10-underenhederne i det katalytiske domæne også forbundet af en linker, der er genstand for selvspaltning . For at forstå, hvordan pc-9 aktiveres, er vi således nødt til at forstå den rolle, som CARD’er og pc-9-linkere spiller i holo-apoptosomet.

Der er blevet foreslået forskellige modeller, der forklarer mekanismerne for pc-9-aktivering af apoptosomet . Den “proximity-inducerede dimeriseringsmodel” forudsiger, at rekruttering af pc-9-molekyler til Apaf-1-apoptosomet kan lette homodimerisering, hvilket menes at føre til pc-9-auto-aktivering . Indtil for nylig havde ingen strukturelle eller biokemiske beviser imidlertid vist, at pc-9 er homodimerisk, når den er bundet til apoptosomet (se nedenfor ). Den “inducerede konformationsmodel” foreslog, at Apaf-1 apoptosomet er en platform, der binder pc-9 for at lette dets aktive konformation . Nyere modellering foreslog, at aktiveringen af pc-9 primært formidles via allosterisk regulering af apoptosomplatformen . I alle disse modeller er apoptosomets primære funktion at samle et multimerisk kompleks mellem Apaf-1 og pc-9 CARDs for at lette aktiveringen af pc-9 ved at øge den lokale koncentration af zymogenet . Desuden tyder data om en manipuleret pc-9, der er en konstitutiv dimer i opløsning, på, at CARD’en og dens linker kan hæmme de katalytiske domæner . Derfor kan dannelsen af en CARD-heterodimer på apoptosomet ophæve denne hæmning, men denne idé skal dog stadig testes.

Mens dimerisering kan spille en nøglerolle i aktivering, er det fortsat uforklaret, hvordan dette sker på apoptosomet, og faktisk har nyere data antydet muligheden af en mere kompliceret aktiveringsmekanisme, der involverer både homodimerisering af pc-9-molekyler og heterodimerdannelse af et enkelt pc-9-katalytisk domæne med NBD af Apaf-1 . Det er interessant, at en inaktiv konformation af Apaf-1-monomeren ikke udelukker pc-9-binding via CARD-CARD-interaktioner, som det fremgår af båndforskydningseksperimenter . Således kan pc-9/Apaf-1 heterodimere rekrutteres til det samlende apoptosom som en del af dets aktivering (Fig. 3). Det er fortsat et åbent spørgsmål, om samling af Apaf-1 i tilstedeværelse af pc-9 styres af yderligere interaktioner mellem CARD’er i den spirende skive.

En første krystalstruktur afslørede et stabilt 1:1-kompleks mellem Apaf-1’s og pc-9’s CARD-domæner med en komplementær grænseflade (kendt som Type I), som er uundværlig for pc-9-aktivering . Det blev imidlertid senere vist, at dette stabile 1:1-kompleks ikke var tilstrækkeligt til at aktivere pc-9 . I stedet danner Apaf-1 og pc-9 CARD’erne oligomeriske komplekser af højere orden, der primært stabiliseres af to ud af tre mulige grænseflader (kendt som Type I, II og III), som også findes i andre dødsdomænekomplekser . En sammenligning af de interaktioner, der er involveret i CARD-CARD-disken i CED-4-, Dark- og Apaf-1-apoptosomerne, fremhæver en vis bevarelse af type II- og III-grænseflader, med type I CARD-interaktioner, der kun findes i det humane apoptosom . En nyere krystalstruktur med en opløsning på 2,1 Å afslørede et heterotrimerisk kompleks bestående af to Apaf-1 CARD’er med et pc-9 CARD indlejret imellem . Type II-interaktioner, der involverer rester i pc-9 (Arg36/ Arg65) og Apaf-1 (Glu78) CARD’er, viste sig at være kritiske for pc-9-aktivering sammen med tidligere beskrevne type I-interaktioner . Desuden kan en enkelt rest (Glu41 i Apaf-1 CARD’et) danne et bifurkationssamspil med et pc-9 CARD i et minimalt type III-interface . Yderligere interaktioner med Lys58 og Lys62 på Apaf-1 CARD blev også vist at være nødvendige for pc-9-aktivering og kan bidrage til at placere Apaf-1 CARDs på platformen . Således giver dannelsen af et heterotrimerisk CARD-kompleks et middel til at binde flere pc-9-katalytiske domæner til apoptosomplatformen .

To strukturer med næsten atomar opløsning af det aktive Apaf-1-apoptosom har afsløret den overordnede arkitektur af Apaf-1- og pc-9 CARD-skivearrangementet skaber en vippet skive, der sidder i en over det centrale nav (fig. 2 og 3) . Symmetriforskellen mellem disken og platformen resulterer i en acentrisk placering af CARD-disken set ovenfra (fig. 3) . Disken kan beskrives som en spiral af Apaf-1- og pc-9 CARD-par med fire Apaf-1 CARD’er, der danner et nederste “lag”, mens der er tre eller fire pc-9 CARD’er på den øverste overflade (fig. 2b-d). Desuden bevæger Apaf-1 CARD’erne sig længere væk fra overfladen af det centrale nav, idet de spiralformet opad i en venstrehåndet retning, og de har således forskellige linkerkonformationer og forskellige interaktioner med deres beslægtede NBD’er i det centrale nav. Apaf-1- og pc-9 CARD-parrene interagerer gennem type II-grænseflader og slutter sig til hinanden lateralt omkring spiralen primært gennem type I-interaktioner. Det er bemærkelsesværdigt, at kun fire af de syv Apaf-1 CARD’er interagerer med pc-9 CARD’er i disken . Dette skyldes, at de resterende tre Apaf-1 CARD-molekyler ikke umiddelbart passer ind i spiralens underenhedsbindingsmønster og ikke kan fortsætte spiralen, fordi deres CARD-NBD-linkere er for korte . Apaf-1 CARDs fra tilstødende underenheder i apoptosomet er placeret ved en søm (mellem position 1a og 7a), hvor spiralen holder op med at strække sig vertikalt (Fig. 2c, d) . Dannelse af Apaf-1/pc-9 CARD-skive er nødvendig for aktivering af apoptosomet, og de katalytiske pc-9-domæner er fleksibelt bundet til CARD’erne gennem en linker (fig. 2a) . I en struktur blev en disk med fire Apaf-1 CARDs og tre pc-9 CARDs visualiseret, med svag tæthed, der indikerer, at et fjerde pc-9 CARD kunne binde til toppen af den spiralformede spiral ved en lavere belægning . I en anden struktur indeholdt den fremherskende konfiguration af disken 8 CARD’er med konformationen af CARD’erne i spiralen, som var meget ens mellem de to uafhængigt af hinanden løste strukturer (se overlay, fig. 2d). Variationer i pH og saltkoncentration kan forklare den forskellige belægning på den ottende position. Apoptosom samling fremmer således rekruttering og lokal koncentration af pc-9 CARDs, hvilket muliggør dannelse af en ny spiralformet oligomer med 7 eller 8 CARDs.

En nylig analyse (ved MALS og SAXS) viste, at CARD-kompleksdannelse er koncentrationsafhængig, og at lige store mængder Apaf-1 og pc-9 CARDs associeres som par gennem den stærkere Type I grænseflade, med et dominerende 3:3 kompleks dannet ved høj koncentration i opløsning . Dette CARD-kompleks blev krystalliseret, og strukturen blev bestemt ved 3,0 Å opløsning for at afsløre en venstrehåndet spiral af tre Apaf-1/pc-9 CARD-par med en konformation svarende til den, der er observeret i apoptosomet, men med nogle forskelle (PDB 5WVC; Fig. 2e) . Miljøet i krystallen er imidlertid helt anderledes end det miljø, der er mødt på det samlende apoptosom, delvis på grund af gitterkontakter og manglen på en kerneopbygningsoverflade med begrænsninger pålagt af CARD-NBD-linkere. Dette kan være forklaringen på de observerede forskelle mellem de spiralformede CARD-strukturer. Dette omfatter tilføjelsen af et eller to ekstra CARD’er til den skivelignende spiral i holo-apoptosomet og fire Apaf-1 CARD’er, der danner bunden af skiven, i stedet for tre som fundet i opløsning og i krystallen. Efter optimal tilpasning af den 8 CARD-skive med 6 CARD-spiralen fra krystalstrukturen er der en god overensstemmelse mellem CARD’erne på positionerne 2p, 3a og 4p med en vis divergens i den sidste halvdel af 6 CARD-spiralen (fig. 2f, g). Navnlig er Apaf-1 CARD’et i position 7a fejlplaceret vertikalt til en mellemliggende position i mangel af Apaf-1 CARD’et i position 1a (fig. 2g). Interaktioner mellem platformen og CARD-skiven er således afgørende for at danne kimen til de større 7- og 8 CARD-spiraler, der findes på apoptosomet.

Under samling af skiven kan kimdannelsen af spiralen ske på forskellige måder, herunder dannelse af en CARD-heterotrimer bestående af to Apaf-1 CARD’er og et pc-9 CARD, med et Apaf-1 CARD placeret ved spiralens basis (ved position 1a). Efterfølgende tilføjelse af to Apaf-1/pc-9 CARD-par, der interagerer gennem deres type I-grænseflader, kan derefter ske med en endelig afdækning af spiralen med et pc-9 CARD ved position 8p i nogle tilfælde. Andre permutationer er imidlertid mulige i betragtning af Apaf-1 CARD-NBD-linkerens fleksible karakter, således at tre Apaf-1/pc-9 CARD “type I”-par kan dannes sekventielt fra det centrale nav med tilføjelse af et Apaf-1 CARD ved spiralens basis (ved position 1a) i de tidlige faser af samlingen . Det er vigtigt, at samlingen af disken kan være kooperativ for at opretholde den korrekte afstand mellem de fire Apaf-1 CARDs på apoptosomet, som danner spiralens basis .

For det aktive apoptosom er der en væsentlig forskel på det centrale nav, når man sammenligner de offentliggjorte strukturer (fig. 3 og 4) . Kort sagt, tæthed identificeret som et katalytisk domæne af pc-9 (p20/p10) er placeret på det centrale nav i et nyligt 3D-kort, og dette træk blev fundet at være til stede i omkring 50% af komplekserne . Desuden blev en lignende tæthed visualiseret i et tidligere kort med lavere opløsning af holo-apoptosomet, som tillod en rimelig, om end foreløbig docking af p20/p10-underenhederne ; derfor er den observerede funktion reproducerbar. Denne nye tæthed er imidlertid kun blevet visualiseret ved lav opløsning, hvilket kan afspejle en vis fleksibilitet i fastgørelsen af p20/p10-underenhederne til det centrale knudepunkt. I et kort med næsten atomar opløsning, som blev bestemt af Yigong Shis gruppe , blev en yderligere sikkelformet tæthed opløst ved ~ 7 Å opløsning på det centrale nav, ved siden af CARD-skiven. Denne tæthed indeholder tydeligvis et ekstra pc-9 CARD i midten, som interagerer med to Apaf-1 CARD’er placeret på hver side på en måde, der ligner den, der er observeret i to krystalstrukturer . Denne heterotrimeriske konfiguration kunne dog kun opløses i ~ 10% af partiklerne . Det ser således ud til, at de eksperimentelle betingelser under prøveforberedelse og gitterfrysning kan påvirke, hvordan pc-9 interagerer med potentielle bindingssteder på det centrale nav, herunder dannelsen af en disklignende spiral med et variabelt antal pc-9 CARDs og i brugen af bindingssteder, der er placeret ved siden af den acentriske disk. Når de to nyere asymmetriske strukturer af holo-apoptosomet er justeret på baggrund af deres CARD-skiver, er de nye tæthedstoppe på det centrale nav placeret på helt forskellige steder (fig. 4). Mens det katalytiske pc-9-domæne (p20/p10) kan være placeret på to positioner (med den mest sandsynlige vist i fig. 4c) , er den tre CARD-tæthed roteret og har en anden profil set fra siden (ikke vist), sammenlignet med den for det katalytiske pc-9-domæne (fig. 4b, d). Mønstret af Apaf-1 CARD-NBD linker-tæthederne giver mulighed for en præcis kortlægning af alle relevante CARD-NBD-linkere i holo-apoptosomet med tre CARD’er med seks ordnede Apaf-1 CARD’er (fig. 4d) . Det er af afgørende betydning, at linkerlængden (~ 25-30 Å) og de relative positioner af linkerne kan udelukke, at et tre CARD-modul bindes til enten position 1 eller 2 på det centrale nav. Det ser således ud til, at der er flere steder på den centrale hub, som kan udnyttes på forskellige måder til at binde et pc-9 CARD eller et katalytisk domæne.

Procaspase-9 er blevet anslået til at binde til apoptosomet med forhold mellem 2-5 zymogener pr. 7 Apaf-1 molekyler , så det ser ud til, at det nøjagtige antal pc-9 molekyler bundet til apoptosomet kan variere afhængigt af forholdene under samlingen, hvilket kan afspejle den dynamiske karakter af denne proteolytiske maskine. I forlængelse heraf synes det klart, at et sjette eller syvende pc-9 CARD ikke er bundet af deres Apaf-1-modstykker i forhold til de steder, der allerede er dokumenteret på apoptosomet, hvilket kan afspejle enten en sterisk begrænsning eller nødvendigheden af et større oligomer for at stabilisere de bundne pc-9 CARDs. Det er vigtigt, at nogle katalytiske pc-9-domæner ikke ses i de nuværende cryo-EM tæthedskort på grund af deres fleksible fastgørelse gennem lange CARD-p20-linkere, hvilket gør det vanskeligt at afkode og forstå de præcise aktiveringsmekanismer, samtidig med at det fremhæver et behov for yderligere enkeltmolekyleundersøgelser.

Apoptosomets primære funktion er at aktivere pc-9, så det kan udføre apoptose. Mens strukturelle undersøgelser har givet indsigt i rekruttering og krav til pc-9-aktivering, har en række biokemiske assays nu vist, at både proximitetsinduceret dimerisering og allosterisk regulering af monomer pc-9 er afgørende for at regulere apoptosoms funktion og kan også styre varigheden af apoptosoms aktivitet. For det første øger rekruttering af pc-9 af apoptosomet dets lokale koncentration for at muliggøre homodimerisering, hvilket øger dets affinitet for komplekset . Interessant nok har en pc-9, der ikke kan spaltes, en større tilbøjelighed til homodimerisering og udviser en øget proteaseaktivitet (caspase-3-spaltning) i apoptosomet, end det er tilfældet med spaltet caspase-9 . Som følge heraf reducerer spaltning af den katalytiske domænes p20/p10-linker mellem underenhederne pc-9’s affinitet for apoptosomet, og når den er blevet behandlet, frigøres caspase-9 og binder ikke apoptosomet igen. Det er vigtigt, at disse undersøgelser har vist, at pc-9 homodimerisering er den nøglebegivenhed, der er nødvendig for aktivering, og at apoptosomet virker for at lette denne begivenhed . Dette er i overensstemmelse med biokemiske undersøgelser af andre CARD-caspaser, såsom caspase-2 og Dronc, hvor den indledende aktivering kræver dimerisering snarere end spaltning af zymogenet . Stabilisering af pc-9-binding til apoptosomet kræver ikke kun CARD-CARD-interaktioner, men også interaktioner mellem den lille pc-9-underenhed (p10) via dens GCFNF404-motiv for at danne homo- og heterodimere . Hvad der ikke er klart på dette tidspunkt, er, hvordan pc-9 homodimer dannelse påvirker stabiliteten af CARD-CARD skiven, da katalytiske domænedimerer synes at være ret fleksible, da de kan frigøres fra holo-apoptosomet ved site-directed thrombinolyse og ikke er opløst i cryo-EM kort raffineret uden symmetri . GCFNF-motivet i pc-9 interagerer også med et Apaf-1 NOD for at danne pc-9/Apaf-1 heterodimere, der effektivt kløver caspase-3 . Disse data tyder på, at et katalytisk domæne fra pc-9, som interagerer direkte med apoptosomet, kan være aktivt. Dette formodede aktive sted for caspase-3-spaltning kan svare til den nye tæthed, der er observeret på den centrale hub, og som er blevet fortolket som et p20/p10-molekyle, og der er behov for yderligere undersøgelser af dette punkt. Tilsammen tyder disse resultater på, at pc-9 kan have to forskellige aktive konformationer i apoptosomet, med en eller muligvis to homodimere bundet til CARD-skiven og en pc-9/Apaf-1-heterodimer bundet til den centrale hub . Når holo-apoptosomer med et tre CARD-modul bundet til den centrale hub medregnes, er der mindst seks permutationer mulige for disponeringen af tre til fem katalytiske pc-9-domæner (fig. 5). Antallet af mulige aktive katalytiske pc-9-domæner (som homodimere og heterodimere) vil således variere afhængigt af antallet af pc-9-molekyler, der rekrutteres til apoptosomet, idet de udfylder mulige bindingssteder, der formidles af Apaf-1 CARD’er.

Endeligt fjerner fuldstændig spaltning af pc-9 med caspase-3 den inter-subunit linker og genopretter fuld caspase-9 aktivitet, hvilket indikerer, at caspase-3 også har en proteolytisk feedback på pc-9, der kan forstærke det apoptotiske signal . En lignende mekanisme er blevet foreslået for caspase-2 . Disse biokemiske undersøgelser har endvidere præsenteret en molekylær timer-model, hvor hastigheden af caspase-9-dissociation fra apoptosomet bestemmes af en indledende spaltning af p20-p10-linkeren, som reducerer dens apoptosombindingsaffinitet . En fuldstændig dissociation af kløvet caspase-9 fra holo-apoptosomet ville imidlertid kræve frigørelse af dets CARD fra disk- eller tre CARD-modulet. Der kan således være et hierarki for frigivelse af aktive caspase-9-molekyler, som afhænger af det lokale miljø for deres CARD’er. CARD-skivens udformning, hvor alle pc-9 CARDs er placeret på den øverste overflade, kan også lette frigivelsen af caspase-9.