Opdagelse, aktivitet og karakterisering af en AA10 lytisk polysaccharidoxygenase fra skibsormens symbiont Teredinibacter turnerae

Ekspression og enzymatisk karakterisering af AA10 LPMO fra T. turnerae

Gamma-proteobakterien T. turnerae er den eneste endosymbiont, der findes i skibsormens gæller, som det er lykkedes at isolere, dyrke og få kortlagt sit genom. Gennem automatiseret annotation og manuelle BLAST-søgninger af det forudsagte T. turnerae-proteom identificerede vi et gen (NCBI-referencesekvens: WP_019602454.1), der koder for en AA10 LPMO (herefter TtAA10A). Den forudsagte proteinsekvens indeholder et N-terminalt signalpeptid, LPMO-domænet og et serinrigt linkerområde efterfulgt af et kulhydratbindingsmodul (CBM) 10-domæne (fig. 1a). AA10’er er fundet med tilføjede CBM2-, CBM3-, CBM5-, CBM10-, CBM12-, CBM18- og CBM73-domæner (Bernard Henrissat personlig kommunikation) og er kendt for at være aktive på cellulose eller chitin. CBM10-domæner menes at være cellulosebindende og kan således give cellulosegenkendelse, som sandsynligvis ikke er forbundet med en katalytisk begivenhed . Selv om den er forskellig fra de CBM’er, der almindeligvis findes knyttet til AA10-proteiner , giver dens tilstedeværelse i domænestrukturen af TtAA10A-genet en indikation af, at dette protein måske primært er aktivt på glukosebaserede polysaccharider.

Efter flere forsøg på at udtrykke genet med forskellige affinitets- og opløselighedstags og forskellige sekretionssignaler blev der til sidst opnået tilstrækkeligt protein til analyse gennem produktion af et C-terminalt strep-tagget LPMO-katalytisk domæne (fra His25 til Gly228) i E. coli (fig. 1b). Det oprensede taggede protein blev belastet med overskydende kobber, afsaltet gennem størrelseseksklusionskromatografi, analyseret for renhed gennem SDS-PAGE (Fig. 1c) og massespektrometri-baseret protein-ID (ikke vist) og anvendt til efterfølgende eksperimenter.

Rekombinant TtAA10A (kun katalytiske domæner, 25-228) viser kendetegnene for en korrekt foldet AA10. Termisk shift-analyse (Thermofluor) af renset, Cu-belastet TtAA10A viser en smeltetemperatur (Tm) på 50,4 °C. Stripping af kobber med 10 mM EDTA sænker Tm til 42,5 °C, hvilket tyder på en proteinstabiliserende effekt af metalcofaktoren, som rapporteret i tidligere litteratur for andre LPMO’er (f.eks. fig. 1d). Vi bemærkede også en variabilitet i proteinpræparaterne, idet nogle præparater indeholdt et enkelt Cu-atom (aktivt center), mens andre indeholdt to Cu-atomer, som beskrevet nedenfor.

Aktivitetsanalyser, på både enkelt- og dobbelt Cu-centerprøver, blev udført på en række kommercielle polysaccharidsubstrater (Avicel, β-chitin fra blækspruttepen, α-chitin fra rejeskaller, cellohexaose, majsstivelse, pachyman, xylan fra bøgetræ, glucomannan, xyloglucan, lichenan, galactan, galactomannan og mannan) i tilstedeværelse af den reducerende co-faktor, gallinsyre. Prøverne blev analyseret efter 24 timer med MALDI-TOF MS, og reaktionsprodukternes topmasser blev sammenlignet med tidligere offentliggjorte data, hvilket afslørede et blandet C1-C4-oxidationsmønster, udelukkende på cellulose og afhængigt af tilstedeværelsen af elektrondonoren (fig. 2a, b). Der blev ikke påvist produkter i nogen af de negative kontroller (Additional file 1: Figur S1). MALDI-TOF MS-analyse af råekstrakt fra aktivitetsassays udført med Cu-belastet TtAA10A i tilstedeværelse af 10 mM EDTA kunne ikke påvise frigivelse af produkter (data ikke vist), hvilket indikerer, at kobber som forventet er afgørende for aktivitet.

Synergieeksperimenter blev udført ved saminkubation af TtAA10A og kommercielle glykosidhydrolaser (GH6 og GH9) i tilstedeværelse af Avicel og galsyre, og de resulterende mono- og oligosaccharider blev kvantificeret ved hjælp af højtydende anionbytningskromatografi (HPAEC). Mens reaktioner, der enten indeholder LPMO eller GH alene, frigjorde ubetydelige mængder af frie sukkerstoffer, viste saminkubationsreaktioner en stærk synergistisk effekt, der blev yderligere forstærket af tilstedeværelsen af elektrondonoren (Fig. 2c, d, Additional file 2: Figur S2). Det er værd at bemærke, at begge kommercielle GH’er (GH6 og GH9), der blev testet under disse eksperimenter, tilhører familier, der blev identificeret som værende blandt de mest rigelige i skibsormes fordøjelsesproteom , hvilket styrker den biologiske relevans af ovennævnte aktivitetsassays i forbindelse med træfordøjelsen i skibsormemiljøet.

Elektron paramagnetisk resonansspektroskopi

Vores første bevis for, at nogle proteinpræparater indeholdt to Cu-steder, kom fra EPR-analyser. X-band CW-EPR-spektret i frossen opløsning (165 K) af Cu-mættet TtAA10A (Fig. 3) udviste to sæt hyperfintoppe i den parallelle region af spektret, hvilket indikerer tilstedeværelsen af to forskellige kobberkoordinationsgeometrier, der enten skyldes forskellige koordinationsmiljøer inden for et enkelt sted (f.eks. forskelle i protoneringstilstande hos liganderne) eller et særskilt andet kobberbindingssted. En nøjagtig simulering af det parallelle område af spektret kunne faktisk opnås med to forskellige arter, som hver gav et andet sæt spin Hamilton-parametre, gz = 2,267 og |Az| = 425 MHz (art 1) og gz = 2,314 og |Az| = 465 MHz (art 2), tabel 1, med et forhold mellem art 1 og 2 på ca. 3:2. gz-værdien for art 2 er høj sammenlignet med, hvad man kunne forvente for den typiske AA10 LPMO-kobberkoordinering i det aktive sted (spektroskopi af LPMO’er, der for nylig er gennemgået i Ref. ), på grundlag af hvilken vi tildeler art 1 til en kobber bundet til den kanoniske histidinspænds aktive sted. Dens spin Hamilton-værdier er typiske for en aksial Cu-koordinationsgeometri, som indeholder en blanding af N- og O-donerende ligander . (Bemærk, at art 2 ikke kan stamme fra en fri kobberart i opløsning, da alle små molekylære arter fjernes under proteinpræparationen; derfor stammer alle kobbersignaler i EPR’en fra proteinbundet kobber.)

For at afgøre, om de to signaler stammede fra et enkelt kobberbindingssted med forskellige koordinationsgeometrier eller fra to forskellige kobbersteder, blev der udført et X-band CW-EPR-titreringseksperiment. Proteinet blev forbehandlet med EDTA (10 × proteinkoncentrationen) for at fjerne kobber og derefter bufferudskiftes for at fjerne EDTA. Denne kobberfrie proteinprøve blev testet og viste som forventet intet kobberbaseret signal. Tilsætning af 0,2 ækvivalenter kobber (sammenlignet med proteinkoncentrationen) viste et enkelt signal i det parallelle område, som blev tildelt kobber(II)-ionen i det aktive sted for histidinspiralen (art 1). Yderligere tilsætning af kobber øgede dette histidin-spænde-kobber-signal med samtidig vækst af signalet for art 2, der allerede var tydeligt efter 0,4 ækvivalenter kobber (Additional file 3: Figur S3). Disse titreringseksperimenter blev udført ved en fast pH-værdi og viser, at de to arter i EPR-spektret af kobbermættet TtAA10A repræsenterer to forskellige Cu-bindingssteder med lidt forskellige kobberbindingsaffiniteter, hvor art 1 er det sted med højere affinitet. Desuden blev prøven af TtAA10A med 0,4 ækvivalenter Cu efterladt ved 4 °C i 48 timer, og dens EPR-spektrum blev undersøgt igen. Denne prøve viste ingen forskel i forholdet mellem kobberarter, hvilket viser, at de forskellige bindingssteder ikke opstod på grund af store forskelle i kobberbindingens kinetik.

Mærkbart nok blev der i flere af de præparater, som vi fremstillede, isoleret en prøve af TtAA10A, som kun udviste et enkelt kobbersignal i EPR-spektret. Årsagerne til denne forskel i kobberstoiometri i det isolerede protein er uklare, da disse prøver tilsyneladende blev fremstillet under identiske betingelser som dem, der gav TtAA10A med to forskellige Cu-signaler i X-band EPR-spektret (art 1 og art 2). Vi var ikke i stand til at påvise nogen forskelle i aktivitet for disse enkeltvis kobberbesatte præparater i forhold til tidligere prøver, men vi kunne drage fordel af disse prøver til at måle både X-band og Q-band CW-EPR-spektre for TtAA10A’s aktive Cu-center (Fig. 4) med kun histidinsporet besat, som vurderet ved henvisning til tidligere spektrer. Denne prøve gjorde det derfor muligt for os at foretage en samtidig tilpasning af både X-band- og Q-band-spektre for at opnå mere nøjagtige spin Hamiltonian-parametre for kobberionen i histidinspændenes aktive sted (art 1). Disse værdier er angivet i tabel 2. Tilsætning af PASC til TtAA10A forårsagede ingen ændring af EPR-spektre (data ikke vist).

3D-struktur af TtAA10A

For at få yderligere indsigt i det molekylære grundlag for TtAA10A’s biokemiske egenskaber og for at undersøge denne, potentielt usædvanlige, dobbelte Cu-struktur, bestemte vi krystalstrukturen for det rekombinant udtrykte protein med en opløsning på 1,4 Å (Additional file 4: Tabel S1). Den overordnede struktur afslørede en immunoglobulinlignende kernefold dekoreret med loops og et helikalt bundt, som typisk observeret for enzymer fra denne familie (Fig. 5). Faktisk afslører strukturelle sammenligninger ved hjælp af DALI-serveren de nærmeste strukturelle match med Cellvibrio japonicus AA10A (PDB ID 5fjq) og Serratia marcescens CBP21 (PDB ID 2bem) med RMSD’er på henholdsvis 2,4 Å og 2,3 Å over 180 og 170 Cα-positioner, hvilket kun repræsenterer 30 % identitet på sekvensniveau. I betragtning af den høje aktivitet af TtAA10A på cellulose kan det være noget overraskende, at de to nærmeste strukturelle match til dette enzym er chitinaktive AA10’er. Den tredje nærmeste strukturelle match var imidlertid AA10 fra Streptomyces coelicolor (ScAA10, PDB ID 4oy7 ), som er en cellulose-specifik AA10, der giver en RMSD på 2,5 Å over 160 Cα-atomer. TtAA10A og ScAA10 deler kun 26% sekvensidentitet, selv om de er aktive på det samme substrat, hvilket yderligere understreger vanskeligheden ved at relatere LPMO-substratspecificitet baseret på sekvens og overordnet struktur alene (yderligere diskuteret i forbindelse med AA9 i Ref. ).

Som for alle hidtil undersøgte LPMO’er (som defineret ved deres aktivitet) er det aktive sted for TtAA10A dannet af “histidin-spænde”-motivet, der er placeret i midten af en næsten flad overflade (fig. 5a, b). En enkelt kobberion blev modelleret på denne position, der er koordineret i en typisk T-formet geometri af aminoterminus og sidekæden af His 1 og sidekæden imidazol af His 107. I de aksiale positioner omkring kobberionen på det aktive sted har TtAA10A Phe 195 og Gly 105. Disse positioner er ofte besat af henholdsvis en phenylalanin/tyrosin- og en alaninsidekæde i andre AA10’er. Sidstnævnte er blevet impliceret i skabelsen af et sterisk miljø, som driver dannelsen af den forvrængede koordinationsgeometri på det aktive sted, der er observeret i chitin-specifikke AA10’er i deres Cu(II)-oxidationstilstand. Her gør udskiftningen af Ala med Gly det muligt for kobberet på det aktive sted at antage en lidt mere aksial koordinationsgeometri, der er tættere på den, der er typisk for AA9’er og celluloseaktive AA10’er og i overensstemmelse med spin Hamilton-parametrene for art 1 i vores tidligere beskrevne EPR-analyse, Fig. 4. LPMO-krystalstrukturer er ofte forfulgt af fotoreduktion som følge af strålingsskader, således at hvilegeometrien af det aktive sted ikke kan observeres direkte i krystalstrukturer (eksempler omfatter ). Analyse af den sfære, der omgiver kobberionen i TtAA10A, afslører kun en svag tæthed for et vandmolekyle 2,6 Å fra kobberet og en stærkere tæthed for et andet vandmolekyle 3,2 Å væk, der er hydrogenbundet til Glu 53. Disse vandmolekyler er for langt væk fra kobberet til at kunne betragtes som direkte koordinerende. Det ser derfor ud til, at kobberet i dette enzym også har undergået fotoreduktion til Cu(I)-oxidationstilstanden.

Vores struktur afslører placeringen af det andet kobberbindingssted, der blev observeret i EPR-spektre. Dette sted ligger 14,4 Å (Cu…Cu) fra histidinspænds kobberionen i en stor negativt ladet plet på proteinets overflade (Fig. 5a, b; Additional file 5: Figur S4). Denne anden kobberion er direkte koordineret af His 165, Glu 5, Asp 101, et vandmolekyle og His 207*, som leveres af Strep-tag’et fra et tilstødende molekyle i krystallen. På grund af observationen af denne interaktion kontrollerede vi proteinets oligomeriske tilstand i opløsning ved hjælp af SEC-MALLS (Additional file 6: Figur S5). Dette bekræftede, at proteinet er monomer, hvilket tyder på, at kobber-His207*-interaktionen er et krystalartefakt (om end et, der kan antyde en potentiel protein-protein-interaktion). Ikke desto mindre tyder strukturen sammen med EPR-dataene på, at dette andet sted er besat i opløsning, hvor His 207* sandsynligvis er erstattet af et vandmolekyle. Multiple sequence alignment af de 500 bedste TtAA10A-ortologer identificeret gennem BlastP-søgninger viser, at mens en sur rest i position 5 ikke er ualmindelig blandt AA10’er, er resterne 101 og 165 stort set kun bevaret inden for LPMO’er fra bakterier, der er nært beslægtede med Teredinibacter.

Der har været betydelig debat om mulige positioner, hvor elektrondonorer, både små molekylære og proteinholdige, kan binde til LPMO’er for at muliggøre katalyse, når enzymet er bundet til den faste substratoverflade (se for eksempel ). Faktisk viser en undersøgelse af TtAA10A-strukturen for potentielle ladningsoverførselsveje ved hjælp af programmet EHPath, at der findes en klar og hurtig hole-hopping-vej med en gennemsnitlig opholdstid for huller på kun 20 ms mellem histidin 1 og tyrosin 3 (10 Å afstand). Tyrosin 3 støder op til (5,3 Å) det andet kobbersted og giver således en effektiv ladningsoverførselsvej mellem de to kobbersteder . I betragtning af den potentielle ladningsoverførselsvej mellem de to kobbersteder undersøgte vi derfor, om det andet metalsted (i vores tilfælde besat af kobber, selv om vi ikke kunne fortrænge Cu med Fe-, Ni, Zn- og Mn-salte) udgør et bindingssted for en proteinagtig redoxpartner (bindingen af et andet protein til dette sted antydes af Strep-tag-associeringen med et nabomolekyle i det krystallinske gitter), og vi forsøgte at trække proteiner ned fra T. turnerae-sekretomet, der kan interagere stabilt med TtAA10A, ved hjælp af en affinitetskolonne (StrepTrap HP) med immobiliseret TtAA10A. Disse forsøg (data ikke vist) førte ikke til isolering af nogen kandidatproteinbaserede aktivatorer for TtAA10A, men det kan ikke udelukkes, at et aktiverende enzym kan binde forbigående i denne region for at muliggøre elektronoverførsel til LPMO og dermed igangsættelse af katalysen. Det skal dog bemærkes, at vi under strukturforfiningen også identificerede et natriumbindingssted på proteinets overflade (Additional file 7: Figur S6). Hvorvidt disse ekstra bindingssteder er et resultat af den øgede ladning, som dette protein kan have for at være stabilt i det saltvandsmiljø, som T. turnerae opholder sig i, er stadig et åbent spørgsmål. Ikke desto mindre kan disse overfladeegenskaber ved TtAA10A være af interesse for enzymingeniører, hvis LPMO’er skal stabiliseres eller tilpasses til specifikke forhold for at blive anvendt i industrielle bioreaktorer.