PEG-udfældning: Et kraftfuldt værktøj til rensning af monoklonale antistoffer

Metoden til opsamling af pellets viste sig at have en betydelig indflydelse på renheden af det genopløste produkt. Fældningstrinnet er let skalerbart og passer til en fuldt ud disponibel downstream-proces.

Percivia LLC

Der arbejdes på at finde alternativer til pakkede bed-kromatografi for at reducere tiden og omkostningerne ved behandling af produktstrømme med højtitere. Selv om mange bestræbelser fokuserer på membranadsorbere, der direkte erstatter kolonner med samme eller lignende kemier, er nogle ældre teknologier begyndt at vinde terræn inden for fremstilling af rekombinante proteiner. Et attraktivt alternativ til kromatografi er udfældning, som har været anvendt i plasmaproteinindustrien i mange år.1 En simpel metode til udfældning indebærer titrering af procesvæsken til det isoelektriske punkt for det protein, der skal udfældes.2 Lyotropiske salte, såsom ammoniumsulfat, har også en lang tradition for anvendelse i udfældningsprocesser.3 Kortkædede fedtsyrer, såsom caprylsyre, er velkendte for deres evne til at udfælde DNA og værtscelleproteiner (HCP’er).4 Polyioniske arter er også nyttige udfældningsmidler til at fange et produkt af interesse eller fjerne forurenende proteiner.5,6

Polyethylenglycol (PEG) er blevet anvendt til udfældning af produkter og urenheder.7,8 Det kan også kombineres med isoelektrisk udfældning for at forbedre effektiviteten af separationen.9,10 Efter udfældning kan centrifugering eller filtrering anvendes til at udføre fast-væske-separation.11 Selv om centrifugering er en veletableret metode til at opnå denne separation, kan det være problematisk at vaske produktpellen for at fjerne urenheder, og den er ikke egnet til en proces til engangsbrug. Filtrering – normal- eller tangentialstrømsfiltrering – kræver mere udvikling, men vask af pellet er enklere, og den kan let tilpasses til en proces til engangsbrug.

I det foreliggende arbejde blev der udviklet et produktudfældningstrin ved hjælp af PEG til at genvinde et monoklonalt antistof (MAb) fra klarede PER.C6 cellekulturmedier. Der blev identificeret passende fældningsbetingelser ved hjælp af fuldt faktorielt eksperimentelt design. To filtreringstrin blev evalueret med henblik på opsamling og vask af det udfældede produkt, og den bedste metode blev opskaleret 10 gange. Den samlede fældningsproces resulterede i et udbytte på ca. 90 % og en HCP-reduktion på 1 LRV uden nogen signifikant stigning i aggregatniveauet af det genopløste MAb. Endelig blev virkningen af fældningstrinnet på det efterfølgende kationbytningstrin (CEX) undersøgt.

Materialer og metoder Reagenser

USP-kvalitetssalte, Tween 20, saltsyre, eddikesyre og natriumhydroxid blev købt hos JT Baker (Phillipsburg, NJ). PEG var af reagenskvalitet og blev købt hos JT Baker eller EMD Chemicals (Gibbstown, NJ). Alle buffere blev fremstillet under anvendelse af vand af MilliQ-kvalitet (Millipore, Billerica, MA) og blev filtreret ved 0,22-µm-filtrering før brug.

Feedstock

En human MAb (IgG1, pI = 8,3, 150 kDa) blev fremstillet hos Percivia, LLC ved hjælp af en PER.C6-cellinje. PER.C6-celler er humane embryonale retinalceller, der er immortaliseret ved hjælp af adenovirus E1-genet, som beskrevet i det amerikanske patent 5,994,128.12 Cellerne blev dyrket i en standard fed-batch-proces eller XD-processen, der begge anvender kemisk definerede medier.13,14 Fed-batch-medierne blev klaret ved sedimentation og dybdefiltrering, og XD-medierne blev klaret ved hjælp af ECS-metoden (Enhanced Cell Settling) efterfulgt af dybdefiltrering.15 Under ECS blev der anvendt silica-PEI-harpiks til at forbedre celleaflejringen og også reducere DNA og HCP.

Optimering af udfældningsbetingelser

De betingelser, der blev anvendt til udfældning af MAb – PEG-molekylvægt, PEG-koncentration og pH – blev optimeret ved hjælp af fuldt faktorielle forsøgsdesigns ved hjælp af Minitab-software (State College, PA). pH-værdien af det klarede XD-medie blev justeret til det ønskede niveau med 2-M Tris i et 15-mL konisk rør. PEG blev tilsat som en 40 % (w/w)-stamopløsning til den ønskede slutkoncentration. Røret blev derefter centrifugeret ved 1 000 g, og supernatanten blev dekanteret. Endelig blev pelleten opløst igen i fosfatbufferet saltvand (PBS).

Pelletoptagelse ved dybdefiltrering eller mikrofiltrering

Dybdefiltrering blev udført med forskellige kvaliteter af filtermedier. Millistak+HC D0HC, C0HC og X0HC blev købt fra Millipore Corp. (Billerica, MA), og ZetaPlus 60SP02A blev købt hos Cuno (Meriden, CT). Udfældningen blev udført ved hjælp af en 40 % (w/w) stamopløsning af PEG-3350, og det udfældede medie blev fyldt med en tilførselsstrøm på 50 L/m2 /h, indtil alt materialet var fyldt, eller transmembrantrykket (TMP) var 15 psid. Filtrene blev derefter vasket med 20-30 L/m2 af 20 mM Tris pH 8,5 + 14,4 % (w/w) PEG-3350. Efter vask blev 80 L/m2 resolubiliseringsbuffer passeret gennem filtrene ved 100 L/m2 /h, og permeatet blev recirkuleret gennem anordningen ved 600 L/m2 /h, indtil A280-værdien i permeatpuljen var stabil, hvilket indikerer fuldstændig opløsning af MAb. Til sidst blev ethvert tilbageholdt produkt genvundet med en 20 L/m2 bufferspuling og luftudblæsning af filtermodulet. I nogle forsøg blev filtermediet efterfølgende vasket med 85-mM acetat, pH 5,3, efterfulgt af 1-M NaCl. Tryk- og flowdata blev indsamlet ved hjælp af et specialudviklet system fra ARC Technology Services (Nashua, NH).

Mikrofiltrering blev udført med en 0,22-µm-hulfibermembran fra GE Healthcare Life Sciences (Piscataway, NJ). PEG-3350 blev tilsat som en 40 % (w/w)-stamopløsning til forsøget i lille skala og i pulverform til opskaleringsarbejdet. Foderstrømmen var 710 L/m2 /h, og retentatet og permeatet var ubegrænset. Udfældningen blev først koncentreret 10-14 gange og derefter vasket med tre diafiltreringsvolumener af 20 mM Tris pH 8,5 plus 14,4 % (w/w) PEG-3350. Endelig blev udfældningen genopløst i 85 mM natriumacetat pH 5,3 eller 20 mM Tris plus 50 mM NaCl pH 7,5. Tryk-, flow- og konduktivitetsdata blev indsamlet ved hjælp af et Slice 200-bænkesystem (Sartorius, Gottingen, Tyskland) til testning i lille skala og et SciPro-system (SciLog, Middleton, WI) til opskaleringseksperimentet.

Kationbytningskromatografi

Toyopearl GigaCap S-650 blev indkøbt fra Tosoh Bioscience (Montgomeryville, PA) i Toyoscreen 5-mL-formatet. Denne harpiks er tidligere blevet demonstreret som et højkapacitetsindfangningstrin for MAbs.16 Kolonnen blev equilibreret med 74-mM natriumacetat pH 5,3 og belastet til 90-95 mg-MAb/mL harpiks ved hjælp af enten klaret medie eller klaret og PEG-behandlet materiale, hver justeret til samme pH og ledningsevne som equilibreringsbufferen. Kolonnen blev derefter vasket med equilibreringsbuffer, og antistoffet blev elueret med 50 mM natriumacetat pH 5,3 plus 90 mM NaCl.

Analytiske teknikker

Koncentrationen af MAb i medieholdige prøver blev bestemt ved hjælp af analytisk Protein A HPLC (Applied Biosystems, Foster City, CA). Aggregatniveauerne blev målt ved størrelseseksklusionskromatografi (SEC) ved hjælp af en TSKgel G3000SWXL-kolonne fra Tosoh Bioscience (Montgomeryville, PA), med topdetektion ved UV-absorbans ved 280 nm. HCP-niveauerne blev kvantificeret ved hjælp af en PER.C6-specifik ELISA fra Cygnus Technologies (Southport, NC). SDS-PAGE blev udført med NuPAGE 4-12 % Bis-Tris-geler, og farvning blev udført med SimplyBlue SafeStain, begge fra Invitrogen (Carlsbad, CA).

Resultater og diskussion Fældningsbetingelser

For begge molekylvægte af PEG, 3.350 og 6.000 Da, var PEG-koncentrationen den dominerende faktor for genfindelsen og renheden af det genopløste MAb. Fældning med PEG-3350 resulterede i den højeste genfinding (figur 1). Den højere genvinding skete imidlertid på bekostning af en højere HCP-belastning i det genopløste MAb. I tilfælde af aggregeret MAb var niveauerne ikke signifikant forskellige fra udgangsmaterialet, men det skal bemærkes, at det særlige MAb, der er anvendt i dette arbejde, ikke er tilbøjeligt til at danne aggregater. Forbedringen af HCP-reduktionen ved brug af PEG-6000 blev opvejet af en reduktion i produktudbyttet. Den endelige betingelse, der blev valgt, var 14 % (w/v) PEG-3350 (svarende til 14,4 % w/w) og pH 8,5.

Figur 1

Pelletopfangning ved dybdefiltrering

I det første forsøg blev ECS-klargjorte XD-medier udfældet, og pellen blev opfanget ved dybdefiltrering med X0HC-medier. Der blev ikke observeret nogen væsentlig stigning i transmembrantrykket (TMP) under påfyldning af 361 g-MAb/m2 (data ikke vist). Efter vask blev resolubilisering af den immobiliserede pellet foretaget med 85 mM acetat pH 5,3. Selv efter recirkulering i 2 timer var antistoffet ikke helt genopløst, så der blev tilsat 0,1 % v/v Tween 20 til resolubiliseringsbufferen. Efter yderligere 30 minutters resolubilisering var MAb’et fuldt opløst.

Tabel 1. Udbytte og fjernelse af urenheder for PEG-fældningsoperationen ved hjælp af dybdefiltrering med X0HC for at genvinde produktet

Massebalancedata er opsummeret i tabel 1. HCP-reduktionen var lavere end i det tidligere forsøg (figur 1), hvor der kun var 5.000 ppm HCP i den endelige pool sammenlignet med 8.300 ppm i dette forsøg. Nogle dybdefiltre er imidlertid kendt for at have hydrofobiske og anionbyttende (AEX) adsorptive egenskaber.17 Det udfældede medie blev belastet ved en relativt høj pH (8,5) og lav ledningsevne (<10 mS/cm), hvilket kan have induceret binding af sure proteiner på en AEX-matrice. Desuden er det blevet vist, at proteinbindingskapaciteten af ionbyttermatricer øges i tilstedeværelse af PEG.18,19 Derfor er det sandsynligt, at nogle af de HCP’er, der forblev i opløsningen efter udfældning, bandt til dybdefiltermediet og eluerede ind i produktet under resolubiliseringen. Denne hypotese understøttes også af forskellen i HCP-indholdet i udfældningssupernatanten og dybdefiltergennemstrømningen (9.900 mod 240 mg), hvilket tyder på, at dybdefilteret fjerner HCP fra opløsningen. Efter immobilisering af antistoffet på dybdefilteret blev det genopløst ved en betydeligt lavere pH-værdi (5,3), hvilket resulterede i eluering af bundet HCP og reducerede renheden af det endelige produkt. Dette fænomen kan afbødes ved at anvende mindre adsorptive dybdefiltermedier, såsom Millistak+HC D0HC/C0HC og ZetaPlus SP-filtre som 60SP02A, eller ved at genopløse produktet i en buffer med lavt saltindhold og højere pH-værdi, såsom 20-mM Tris pH 7,5.

Figur 2

Disse strategier blev afprøvet ved at fylde udfældede fed-batch-medier på D0HC-, C0HC-, X0HC- og 60SP02A-filtre. Alle filtre blev vasket på samme måde med PEG/Tris-bufferen, men resolubiliseringen blev udført med 20 mM Tris pH 7,5 plus Tween 20 for Millipore-filtrene og 85 mM acetat pH 5,3 plus Tween 20 for Cuno-filtrene. Millipore-filtrene blev også strippet med en buffer med lav pH-værdi (85 mM acetat pH 5,3) og højt saltindhold (1 M NaCl), efter at produktet var blevet genvundet, for at afgøre, om eventuelle bundne HCP’er kunne elueres. Figur 2 viser, at der var betydelig tilsmudsning af alle testede filtre. Da fed-batch-mediet ikke blev klaret ved ECS-metoden, som har vist sig at reducere DNA-niveauet i XD-høst betydeligt, kan der være mere DNA til stede, som udfældes i høje PEG-koncentrationer.20 Det højere DNA-indhold i udfældningen kan have reduceret filterkapaciteten, men dette er ikke blevet undersøgt. Tabel 2 viser, at hvert af forsøgene resulterede i en bedre HCP-reduktion (84-88 % mod 46 %), og selv om start HCP-belastningen var højere (49.000 ppm mod 13.000 ppm), havde de genopløste MAb-pools generelt et lavere HCP-indhold (6.000-7.800 ppm mod 8.300 ppm). Brugen af filtre med lav adsorptionsgrad og genopløsning i en buffer med højere pH-værdi synes at løse problemet med HCP’er, der elueres fra dybdefiltermediet. SDS-PAGE af strimmelfraktionerne viste, at både HCP’er og produkt var bundet til filtrene – herunder de mindre adsorptive D0HC- og C0HC-filtre – og bekræftede, at X0HC-medierne var mere adsorptive end D0HC- og C0HC-medierne (figur 3).

Tabel 2. Udbytte og fjernelse af urenheder for PEG-fældningsprocessen ved hjælp af dybdefiltrering med forskellige filtermedier til genindvinding af produktet

Pellet Capture by Microfiltration

Men selv om HCP-belastningen af det genopløste MAb blev reduceret ved at anvende en buffer med en højere pH og mindre adsorptive dybdefiltermedier, var dybdefiltrenes kapacitet lav for fed-batch-medier (<400 g-MAb/m2 ). Mikrofiltrering (tangential flow filtration, MF TFF) blev afprøvet med det formål at forbedre kapaciteten med den ekstra fordel at kunne anvende en hvilken som helst buffer til resolubilisering på grund af den lave bindingskarakteristik af den hule fiber. Den hydrauliske ydeevne af MF TFF-koncentrationen og vask af udfældning af fed-batch-udfældning er vist i figur 4. Permeatstrømmen var ca. 100 L/m2 /h, og TMP var mellem 1,0 og 2,5 psid under hele operationen. Massebelastningen på 475 g-MAb/m2 var bedre end den, der blev opnået i nogen af dybdefiltreringsprocesserne. Produktgenvinding og HCP-reduktion var begge omkring 90 %, hvilket var lidt bedre end det, der blev opnået ved dybdefiltrering (tabel 3).

Figur 3

Resolubiliseringen var meget enklere og hurtigere end for dybdefiltreringen; i stedet for at recirkulere buffer gennem anordningen blev bufferen pumpet gennem indersiden af lumenerne ind i retentatbeholderen med permeatet lukket og fik lov til at blande sig i ca. 60 min. Dette var tilstrækkeligt til at opløse antistoffet igen, og der var ikke behov for hjælpestoffer. På grund af vanskelighederne med at opløse ved dybdefiltrering blev produktet genopløst ved eller tæt på koncentrationen i fødemediet. Den endelige pool fra MF TFF-processen var næsten to gange mere koncentreret end udgangsmaterialet.

Figur 4

Da retentatet og permeatet var åbne for atmosfærisk tryk, var der behov for minimal instrumentering: en tværstrømspumpe, en tryksensor og en overførselspumpe til diafiltreringen. Kombinationen af høj kapacitet, høj genvinding og HCP-clearance samt driftsmæssig enkelhed gør MF TFF til en foretrukken mulighed for opsamling af pellets sammenlignet med dybdefiltrering. Fældnings- og MF TFF-trinnet blev opskaleret 10 gange til en 0,12 m2 hulfiberanordning, og præstationerne var sammenlignelige med dem i lille skala (tabel 4).

Tabel 3. Udbytte og fjernelse af urenheder for PEG-fældningsprocessen ved hjælp af mikrofiltrering til genvinding af produktet i bench scale

Kationbytningskromatografi

Kationbytningskromatografi med høj kapacitet (CEX) blev evalueret med foderstoffer, der var forbehandlet med eller uden PEG-fældning. Fældningstrinnet havde ingen væsentlig indvirkning på trinudbyttet eller den procentvise reduktion af HCP’er, men det eluat, der fremkom fra det udfældede belastningsmateriale, indeholdt syv gange mindre HCP (tabel 5).

Tabel 4. Udbytte og fjernelse af urenheder for PEG-fældningsoperationen ved hjælp af mikrofiltrering til genindvinding af produktet i pilotskala

Konklusioner

Fældning har længe været anvendt i plasmaproteinindustrien til oprensning af proteiner i stor målestok. Teknikken er her blevet tilpasset til den indledende MAb-rensning fra klarede fed-batch- og XD-medier på en skalerbar måde. Der er udviklet to filtreringstrin til engangsbrug til opsamling og vask af det udfældede produkt, hvilket eliminerer behovet for centrifugering. Det blev vist, at udfældningsoperationen ikke påvirkede udbyttet af CEX-indfangningstrinnet negativt, og at den reducerede HCP-indholdet i eluatet med en faktor syv.

Tabel 5. Udbytte og HCP-fjernelse for GigaCap S-650 fyldt med udfældet (+PEG) og ikke-udfældet (âPEG) antistof

Den evne til at reducere urenhedsbyrden så langt opstrøms i rensningstrinnet er nøglen til at afkortning af downstream-processen eller til at erstatte traditionel kromatografi med andre engangsteknologier. Lavere urenhedsbyrder kan forbedre belastningskapaciteten af flow-through-membranadsorbere og eventuelt virusfiltre, som generelt er meget dyre elementer i en proces.

En yderligere fordel er muligheden for at opløse antistoffet igen i en buffer, der letter den efterfølgende enhedsoperation. F.eks. kræver cellekulturmedier typisk omfattende titrering og fortynding eller et UF-DF-trin for at forberede sig til indfangningskromatografi med en kationbytter. Her kan det udfældede antistof opløses i equilibreringsbuffer i høj koncentration, hvilket forkorter behandlingstiden. Dette kan være vigtigt for produkter, der ikke tåler langvarig eksponering for lave pH/konduktivitetsforhold. I tilfældet med dette særlige antistof kræver det klarede medie en mere end dobbelt fortynding for at blive indlæst på en CEX-kolonne, hvorimod det genopløste MAb kunne indlæses direkte ved næsten to gange koncentrationen af det ujusterede medie. Dette er mindst en firedobbelt reduktion af belastningsvolumenet, hvilket kan resultere i betydelige tidsbesparelser for moderne CEX-harpikser med høj kapacitet.

Anerkendelser

Forfatterne vil gerne takke Percivia protein- og analysevidenskab for assaystøtte i dette arbejde og Percivia opstrøms procesudviklingsgruppe for levering af cellekulturmedierne.

Mærkebemærkning

PER.C6 er et registreret varemærke tilhørende Crucell Holland BV Corporation; XD er et registreret varemærke tilhørende DSM NV; og ECS er et registreret varemærke tilhørende DSM NV. Alle andre varemærker er varemærker tilhørende deres respektive ejere.

MICHAEL KUCZEWSKI er videnskabsmand I, EMILY SCHIRMER, ph.d., er videnskabsmand II, BLANCA LAIN, ph.d., er seniorforsker, og GREGORY ZARBIS-PAPASTOITSIS, ph.d., er senior director, alle i downstream procesudvikling, Percivia LLC, Cambridge, MA, 617. 301.8821, [email protected]@percivia.com

1. Cohn EJ, Strong LE, Hughes WL, Mulford DJ, Ashworth JN, Melin M, et al. Præparering og egenskaber af serum- og plasmaproteiner. IV. Et system til adskillelse i fraktioner af protein- og lipoproteinkomponenterne i biologiske væv og væsker. J Amer Chem Soc. 1946;68(3):459-75.

2. Van der Wielen L, Hofland G, Ottens M, Gulobovic M, Witkam G-J. Fremstilling af proteinbaserede strukturer ved hjælp af en flygtig syre. I: 224th National Meeting of the American Chemical Society. Boston, MA; 2002.

3. Habeeb A, Francis R. Fremstilling af humant immunoglobulin ved ammoniumsulfatudfældning. Vox Sanguinis. 1976;31:423-34.

4. Wang J, Diehl T, Aguiar D, Dai X-P, Arunakumari A. Udfældning af procesafledte urenheder i ikke-Protein A-rensningsordninger for antistoffer. BioPharm Int. 2009 Oct suppl, Downstream Processing 2010: Embracing Innovation;4-10.

5. McDonald P, Victa C, Carter-Franklin JN, Fahrner R. Selektiv antistofudfældning ved hjælp af polyelektrolytter: En ny tilgang til oprensning af monoklonale antistoffer. Biotechnol Bioeng. 2009;102(4):1141-51.

6. Moya W, Jaber J, Moya W, opfindere; Millipore Corp, erhverver. Oprensning af proteiner. USA-patent US WO/2008/079280. 2006.

7. Polson A, opfinder; South African Inventions Development Corporation, erhverver. Fraktionering af blandinger af proteinholdige stoffer ved hjælp af polyethylenglycol. USA-patent US 3415804. 1968.

8. Giese G. Polyethylenglycoludfældning af monoklonale antistoffer og virkningen på kolonnekromatografi. I: G: BioProcess Int. Raleigh, NC; 2009.

9. Thrash S, Otto J, Deits T. Effect of divalent ions on protein precipitation with polyethylene glycol: mechanism of action and applications. Ekspression og rensning af proteiner. 1991;2(1):83-9.

10. Ramanan S, Stenson R, Ramanan S, opfindere; Amgen, erhverver. Metode til isolering af antistoffer ved udfældning. USA-patent US 2008/0214795 A1. 2008 2/13/08.

11. Venkiteshwaran A, Heider P, Teysseyre L, Belfort G. Selective precipitation-assisted recovery of immunoglobulins from bovine serum using controlled-fouling crossflow membran microfiltration. Biotechnol Bioeng. 2008;101(5):957-66.

12. Fallaux FJ, Hoeben RC, Eb AJvd, Bout A, Valerio D, Fallaux FJ, Hoeben RC, opfindere; IntroGene B.V., erhverver. Pakningssystemer til humant rekombinant adenovirus til brug i genterapi. USA-patent US 5994128. 1997.

13. Golden K, Bragg C, Chon J. XD-processen: udvikling af en proces med høj titer for PER.C6-celler. I: 21st Meeting of the European Society of Animal Cell Technology (21. møde i det europæiske selskab for dyrecelleteknologi). Dublin, Irland; 2009.

14. Chon J. Fremskridt i platformen for fed-catch- og XD-produktionsprocesser ved hjælp af den humane PER.C6-cellelinje. Wilbio Waterside Conference; 2009 Apr 20-22; South San Francisco, CA.

15. Schirmer EB, Kuczewski M, Golden K, Lain B, Bragg C, Chon J, et al. Primær afklaring af ekstremt tætte cellekulturhøstninger ved forbedret celleaflejring. Bioprocess Int. 2010;8(1):32-9.

16. Lain B, Cacciuttolo MA, Zarbis-Papastoitsis G. Development of a High-Capacity MAb Capture Step Based on Cation-Exchange Chromatography (Udvikling af et MAb Capture Trin med høj kapacitet baseret på kationbytningskromatografi). Bioprocess Int. 2009;7(5):26-34.

17. Yigzaw Y, Piper R, Tran M, Shukla AA. Udnyttelse af dybdefiltrenes adsorptive egenskaber med henblik på fjernelse af værtscelleprotein under rensning af monoklonale antistoffer. Biotechnol Prog. 2006;22:288-96.

18. Milby KH, Ho SV, Henis JMS. Ionbytningskromatografi af proteiner: virkningen af neutrale polymerer i den mobile fase. J Chromatogr. 1989;482:133-44.

19. Gagnon P, Godfrey B, Ladd D. Metode til opnåelse af unikke selektiviteter i ionbytningskromatografi ved tilsætning af organiske polymerer til den mobile fase. J Chromatogr A. 1996;743:51-5.

20. Paithankar KR, Prasad KS. Udfældning af DNA ved hjælp af polyethylenglycol og ethanol. Nucleic Acids Research.1991;19(6):1346.