PLOS ONE

Diskussion

De fleste kemoterapeutiske lægemidler er specifikt designet til at forstyrre DNA-syntese, cellulær metabolisme og celledeling. På grund af denne virkemåde forventes disse lægemidler at forårsage flere typer mutationer . Kemoterapeutiske lægemidlers mutagenicitet for normale celler er et af de alvorligste problemer inden for kemoterapi på grund af muligheden for at fremkalde sekundære maligniteter og unormale reproduktionsresultater som Down-, Klinefelter- og Turner-syndromer. Det er derfor vigtigt at bestemme den mutagene virkning af kemoterapeutiske lægemidler på normale celler. Mikronukleustesten er blevet anvendt i vid udstrækning til at måle ikke-reparerede skader på genomet, og en øget MN-frekvens forudsiger risikoen for kræft hos mennesker . Da MN kan skyldes kromosombrud (clastogenicitet) eller forsinkede kromosomer (aneugenicitet), har påvisningen af MN potentiale til at blive brugt som en screening for numerisk kromosomal aberrationsinduktion, hvis assays, der gør det muligt at identificere hele kromosomer inden for MN, såsom FISH-assayet, er inkluderet.

Den clastogene aktivitet af epirubicin under mitose in vivo blev rapporteret ved knoglemarvs-MN-testen . På nuværende tidspunkt er oprindelsen af den epirubicin-inducerede MN endnu ikke blevet bestemt. Derfor blev den nuværende undersøgelse designet til at undersøge epirubicins evne til at inducere aneuploiditet i somatiske og germinale celler hos hanmus. For at bestemme metodens effektivitet blev to modelmutagener, colchicin og mitomycin C, der er kendt for at have henholdsvis aneugeniske og klastogene virkninger, anvendt som positive kontroller. De observerede resultater af MNPCE og fordelingen af signaler pr. MN i kontrollen og de to positive mutagener i den aktuelle undersøgelse stemmer godt overens med de offentliggjorte data , . Disse data bekræftede følsomheden af den anvendte eksperimentelle protokol til påvisning af genotoksiske virkninger.

Resultaterne af MN-testen har vist, at epirubicin frembringer dosisafhængige stigninger i MN-dannelse i museknoglermarv in vivo (Fig. 1) og en stigning i centromerisk-negative og centromerisk-positive farvede MN, hvilket indikerer induktion af både klastogenicitet og aneugenicitet (Fig. 2). Både det klastogene og det aneugeniske potentiale af epirubicin i somatiske celler kan give anledning til udvikling af sekundære tumorer. Resultaterne af klastogeniciteten bekræfter resultaterne af tidligere in vivo-undersøgelser, hvor der blev observeret en stigning i MN-dannelse og strukturelle kromosomale aberrationer i somatiske celler hos mus over et lignende dosisinterval efter epirubicinbehandling . Resultaterne af disse undersøgelser stemmer også overens med den tidligere rapporterede mikronukleusinduktion ved epirubicin i murine cancerceller in vitro , i erytrocytterne i inkuberede hønseæg og i den humane lymfoblastoide TK6-cellinje . Desuden er der også tidligere rapporteret om induktion af strukturelle og numeriske kromosomale aberrationer hos kræftpatienter, der modtager epirubicinholdig kemoterapi . Tidligere undersøgelser har også vist, at epirubicin inducerer strukturelle kromosomale aberrationer i dyrkede HeLa-celler , både strukturelle og numeriske kromosomale aberrationer og søsterkromatidbytninger i en kinesisk hamstercellelinje og kromosomale aberrationer i perifere blodlymfocytkulturer fra kvinder med brystkræft, der er behandlet med en epirubicinholdig behandling in vitro .

Studier på mennesker har vist, at visse kemoterapieregimer øger hyppigheden af aneuploidi i kimceller , hvilket tyder på, at sådanne patienter kan være i højere risiko for unormale reproduktionsresultater, især i den reproduktive alder. Derfor er det af generel interesse at mindske risikoen for aneuploidieproduktion, at påvise kimcelleaneugens og at forstå de kausale mekanismer. I den aktuelle undersøgelse blev aneuploidi bestemt i kimceller ved hjælp af sperm-FISH-assayet med DNA-sonder, der er specifikke for musekromosomer 8, X og Y, hver mærket med en anden farve. For at bestemme metodernes pålidelighed blev colchicin, der vides at være overvejende aneugenisk, anvendt som positivt kontrolstof, og resultaterne af den positive og negative kontrol var i samme størrelsesorden som resultaterne af tidligere undersøgelser , -. Disse data bekræftede den eksperimentelle protokols følsomhed med hensyn til påvisning af aneuploidogene virkninger af de testede forbindelser.

Epirubicin er mest aktivt i S- og G2-faserne i cellecyklus; det har dog en vis påviselig aktivitet i alle faser af cellecyklusen . Det er ofte blevet rapporteret, at kemikalier med aneugeniske egenskaber kan ændre celledelingsforløbet i både meiotiske og mitotiske celler . I den aktuelle undersøgelse blev udviklingstiden fra meiotiske delinger i spermatocytter til epididymale sædceller vurderet ved hjælp af BrdU-inkorporeringsassayet. Resultaterne viser klart, at epirubicin forlængede varigheden af meiotiske delinger i muses spermatocytter i 48 timer (fig. 3). Disse observationer bekræfter derfor tidligere resultater, at epirubicin-induceret hæmning af topoisomerase II-funktionen i forskellige faser af cellecyklusen bremser cellecyklusprogressionen og får cellerne til at standse i G2/M-fasen . Et sådant G2/M-stop kan skyldes induktion af G2-checkpoint-maskineriet, som gør det muligt at reparere beskadiget DNA, inden cellerne går videre til næste cellecyklusfase .

In vivo-oplysningerne om epirubicins virkninger på non-disjunktion under meiose er begrænsede, men visse andre anthracykliner, såsom doxorubicin og dets derivat idarubicin, forhindrer kromosomal adskillelse og inducerer betydelige stigninger i frekvenserne af disomiske og diploide sædceller . Desuden viste en in vitro-undersøgelse, at behandling af kinesiske hamsterkulturer med epirubicin inducerede numeriske aberrationer i form af hypodiploiditet og hyperdiploiditet . Desuden viste flowcytometrisk og histologisk analyse af muses spermatogenese en stigning i variationskoefficienten i DNA-histogrammet som et mål for aneuploiditet og en stigning i antallet af diploide spermatomer efter behandling med epirubicin . I overensstemmelse med ovennævnte rapporter viste det foreliggende forsøg, at eksponering for epirubicin forårsagede betydelige dosisafhængige stigninger i hyppigheden af disomiske og diploide sædceller, og at induktionen af aneuploiditet var lineært dosisafhængig mellem 0 og 12 mg/kg epirubicin (fig. 4). Disse in vivo-observationer er også i overensstemmelse med en tidligere in vitro-rapport om humane lymfocytter dyrket fra raske personer og kræftpatienter, hvor eksponering for doxorubicin forårsagede en stigning i trisomierne af kromosom 7 og 17 . Ganapathi et al. rapporterede desuden, at humane leukæmiceller HL-60 celler, der bærer monosomi 8 som den eneste karyotypiske ændring, erhvervede 7q21-markører efter eksponering for doxorubicin. Desuden viste cytogenetiske fund trisomi 8 hos patienter, der modtog systemisk kemoterapi med anthracyclin . Monosomi 7, 7q-, og ubalanceret translokation, herunder kromosom 7, blev observeret hos patienter, der modtog kemoterapi med anthracyclin . Desuden er strukturelle kromosomale aberrationer af kromosom 1, 9 og 16 blevet relateret til kemoterapeutiske lægemidler, der indeholder anthracyclin .

Af andre klasser af topoisomerase II-hæmmere er etoposid tidligere blevet undersøgt i muses spermatocytter , . Resultaterne af disse undersøgelser viser, at etoposid virker som et genotoksisk middel og inducerer aneuploidier i primært meiotiske kønsceller efter behandling af pachytene celler . På den anden side fandt Kallio og Lähdetie, at følsomheden over for etoposid hos mus var størst under diploten-diakinese af primære spermatocytter, reduceret under sene pachytene stadier og lav under preleptoten stadier; et meget anderledes mønster end med DNA-alkylerende kemikalier. Disse forfattere foreslog, at etoposid forårsagede en manglende opløsning af rekombinerede kromosomparme, sandsynligvis forbundet med cellecyklusstop og udløsning af den apoptotiske vej. I deres detaljerede cytogenetiske undersøgelser rapporterede Marchetti et al., at pachytene var det mest følsomme stadium af spermatogenesen for induktion af strukturelle kromosomaberrationer og aneuploidie. Da dataene fra Schmid et al. og Kallio og Lähdetie kunne påvise, at etoposid forlængede den meiotiske cellecyklus, synes det muligt, at de virkninger, som Marchetti et al. så i første spaltningsdivisioner i 24,5 dages parringsgruppen, faktisk kan være blevet induceret på et senere stadium, dvs. under meiotisk diakinese, MMI eller MMII i stedet for pachytene, som forfatterne foreslog.

I den aktuelle undersøgelse planlagde vi sperm-FISH-undersøgelse for at afgøre, om subakut behandling med lave doser af topoisomerase II-hæmmeren epirubicin ville have en effekt, fordi tidligere profasestadier ville blive inkluderet i epirubicin-behandlingen. Der blev injiceret individuelle doser på 0,25, 0,5 og 1 mg/kg epirubicin på 12 på hinanden følgende dage, og der blev udtaget sædprøver 23 dage efter den sidste behandling med epirubicin. En samlet dosis på 12 mg/kg epirubicin anvendt i hele meiosens profase øgede signifikant disomiske og diploide sædfrekvenser, mens en samlet dosis på 3 og 6 mg/kg doxorubicin var negativ (fig. 5). Derimod gav en enkelt dosis på 6 mg/kg epirubicin, der blev påført spermatocytter under MMI/MMII, et positivt resultat (Fig. 4). Disse data tyder på, at tidligere profasestadier bidrager relativt mindre til epirubicin-induceret aneuploiditet i mandlige kønsceller.

I den foreliggende undersøgelse blev det konstateret, at epirubicin forårsagede mærkbare stigninger af autodiploide sædceller (XX88 og YY88). Efter behandling med epirubicin var autodiploide sædceller som følge af stop af MMII hyppigere end diploide sædceller som følge af stop under MMI (XY88). Således var den anden meiotiske deling mere følsom over for epirubicinbehandling end den første meiotiske deling. Konklusionen om, at anden meiotiske deling var mere følsom over for epirubicinbehandling end første meiotiske deling, understøttes også af de observerede hyppigheder af disomiske kønskromosomer. Sædceller med signaler med XX8- eller YY8-signaler var hyppigere end sædceller med signaler med XY8-signaler. Disse observationer bekræfter, at sæd-FISH-assayet for disomi eller diploiditet er i stand til at påvise virkninger induceret under begge meiotiske delinger og til at sammenligne følsomheden af begge meiotiske delinger, som tidligere rapporteret , .

I det nuværende sæd-FISH-assay blev det fundet, at den laveste positive dosis til at forårsage disomiske eller diploide sædceller var 6 mg/kg epirubicin. MN-undersøgelser af knoglemarv i mus viste imidlertid, at eksponering for 3 mg/kg epirubicin gav en signifikant stigning i MNPCE. Denne observation tyder på, at MN i knoglemarven induceres ved lavere doser end disomier eller diploidier i sædceller. Knoglemarven er derfor det mere følsomme væv. Imidlertid måler analyserne forskellige slutpunkter. Kromosometab og kromosombrud måles i MN-testen, mens ikke-diplodiering påvises i sæd-FISH-assayet. De foreliggende data bekræfter derfor det generelle paradigme for risikovurdering, hvorefter et positivt resultat af MN-testen i knoglemarv er en indikator for et forbindelses genotoksiske potentiale i kønsceller. Kvantificering af aneuploidi i kønsceller er imidlertid vigtig med henblik på risikovurdering.

DNA-topoisomerasehæmmere har en klar tendens til at forårsage dobbeltstrengede DNA-brud, som primært resulterer i dannelse af centromer-negative MN . Tilsvarende tyder påvisningen af, at epirubicin er en effektiv topoisomerase II-inhibitor, på, at epirubicin fremkalder sine klastogene virkninger gennem denne mekanisme. Epirubicinmetabolitter kan også aktivere cellerne til at øge den intracellulære produktion af reaktive oxygenarter, hvoraf de stabile og diffunderbare former kan beskadige kerne-DNA . Hvis de cellulære reparationsmekanismer er overbelastede, kan primær DNA-skade føre til strukturelle eller numeriske kromosomale aberrationer og i sidste ende forårsage tumorer . Denne antagelse understøttes af, at personer, der udviklede en anden malign neoplasme efter behandling for en første malign neoplasme, havde en lavere evne til at reparere DNA-dobbeltstrengsbrud end personer, der ikke udviklede en anden malign neoplasme, målt ved γH2AX-intensitet . Induktionen af centromer-positive MN ved epirubicin tyder på, at der kan være en anden mekanisme, hvorigennem epirubicin inducerer sin genotoksiske virkning. Denne observation understreger vigtigheden af at anvende FISH-modifikationen af MN-analysen til at bestemme oprindelsen af de inducerede MN. Den potentielle mekanisme, hvormed epirubicin kan udøve sin aneugeniske virkning, er gennem hæmning af topoisomerase II, hvilket kan resultere i fejlsegregering af kromosomer under celledeling. Dette sker, fordi DNA-topoisomerase II er nødvendig for en korrekt adskillelse af søsterkromatider under celledelinger, idet både manglende adskillelse og brud forekommer i dens fravær , . Epirubicin kan således være i stand til at hæmme topoisomerase II’s to nøgleroller; dets evne til korrekt adskillelse af nyreplicerede kromosomer samt dets funktion i forbindelse med re-ligning af forbigående dobbeltstrengede DNA-brud.

Sammenfattende blev det ved hjælp af FISH-assayet med en centromerisk DNA-sonde for erythrocyt MN vist, at epirubicin ikke kun er klastogen, men også aneugenisk i somatiske celler in vivo. Ved hjælp af BrdU-inkorporeringsassayet blev det vist, at den meiotiske forsinkelse forårsaget af epirubicin var ca. 48 timer. Med sæd-FISH-analysen blev det vist, at epirubicin inducerer aneuploidier under meiose, der resulterer i disomiske sædceller, samt fuldstændig meiotisk stop, der skaber diploide sædceller. Forekomsten af autodiploide (XX88, YY88) og disomiske (XX8 eller YY8) sædceller tyder på, at den anden meiotiske deling er mere følsom over for epirubicin end den første meiotiske deling. Resultaterne tyder også på, at tidligere profasestadier bidrager relativt mindre til epirubicininduceret aneuploiditet. Både epirubicins klastogene og aneugeniske potentiale kan give anledning til udvikling af sekundære tumorer og unormale reproduktionsresultater hos kræftpatienter og medicinsk personale, der udsættes for lægemiddelregimer, der omfatter epirubicin. Selv om epirubicin har mindre systemisk og kardiel toksicitet end doxorubicin og andre anthracykliner med et tilsvarende spektrum af antitumorvirkning , har det aneuploidogene og cytotoksiske virkninger i ikke-tumorceller. Denne aneuploidogene virkning af lægemidlet kan være ansvarlig for forekomsten af unormale reproduktionsresultater og sekundære tumorer, som bemærkes hos nogle kræftpatienter engang efter en vellykket behandling af deres primære kræftformer med epirubicinholdig kemoterapi.