Sammenhæng mellem HPV-genotyper og eksterne anogenitale vorter: en tværsnitsundersøgelse

BY admin
|

Studieopbygning og deltagere

Der blev gennemført en tværsnitsundersøgelse, der anvender en ikke-probabilistisk stikprøve. Patienter, der deltager i dermatologiske klinikker på Farwania Health District Area, blev rekrutteret i undersøgelsen konsekutivt fra november 2016 til maj 2017. Immunokompetente patienter med tidligere klinisk diagnose af eksterne anogenitale vorter planlagt til kryoterapi eller laserbehandling blev bedt om at underskrive samtykkeformularen efter en mundtlig forklaring fra dermatologen, der opfordrede dem til at deltage. På tidspunktet for prøvetagningen blev vorteprøverne indsamlet i universelt transportmedie (HealthLink Inc., Copan Italia S.p.A., Italien) og opbevaret ved – 80 °C. Der blev opnået etisk godkendelse fra Health Sciences Center Ethical Committee (nummer: VDR/EC/2310) og fra sundhedsministeriet.

Demografiske og kliniske oplysninger blev taget fra hver patient, herunder: alder (år), køn (mand, kvinde), nationalitet (kuwaitisk, ikke-kuwaitisk), antal vorter (en, to til fire og mindst fem), varighed af tilstedeværelsen af vorter (< en måned, en til seks måneder, syv til 12 måneder og mere end 12 måneder), størrelse af hver vorte (i centimeter) (< en, en, mellem en og to, mere end to), partnere har vorter (ja, nej), og om vorter har været genstand for tidligere behandling (ja, nej). Ingen af deltagerne modtog HPV-vaccination, da HPV-vaccination endnu ikke er blevet gennemført i Kuwait, selv om gennemførelsen heraf i øjeblikket drøftes i sundhedsministeriet.

DNA-udtrækning og kontroller

De modtagne vævsprøver blev opbevaret ved – 80 °C. På grund af det store antal modtagne prøver blev alle vorter pr. patient hakket sammen og blev underkastet én DNA-isolering. Vævet blev hakket med en steril saks og pincet på en petriskål, og ca. 25 mg væv blev vejet. Vævet blev vasket i fosfatbufferet saltvand (PBS) og overført til Eppendorf-rør på 1,5 ml. Genomisk DNA blev ekstraheret fra vævsprøverne ved hjælp af et QIAmp DNA Mini-kit (Qiagen, USA) i henhold til producentens anvisninger.

HPV type 2, HPV type 1 og HPV type 16-vektorer (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) blev anvendt som kontrol i PCR-forsøgene.

Real-time PCR

Den realtids-PCR-analyse blev udført for at screene for HPV-DNA i kønsvorterne. Fem mikroliter (5-μl) af det ekstraherede DNA blev kombineret med 12,5-μl 2X Syber Green master mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) indeholdende ROX som en passiv reference og 10 pmol fremadrettede og omvendte primere (10-uM, beskrevet nedenfor). Alle sæt primere blev syntetiseret på bestilling af Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA. Blandingen blev suppleret til 25-μl volumen med nucleasefrit vand (Ambion, Austin, TX, USA). For at reducere antallet af falske positive eller negative resultater blev prøverne analyseret i to eksemplarer på en reaktionsplade med 96 optiske brønde (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Positive og negative kontroller blev inkluderet i hver amplifikationsserie. For at kvantificere HPV i prøverne blev der foretaget en fem- til 10-foldig seriel fortynding af det kendte positive kontrol-DNA sammen med prøverne. Realtids-PCR-amplifikationen blev udført i ABI 7500 realtids-PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

Den realtids-PCR-analyse blev udført på tre forskellige plader. Den første plade blev brugt til at bestemme integriteten af mål-DNA’et ved hjælp af β-globin PCR-assay ved at amplificere et målfragment på 268 bp, som tidligere beskrevet af Lum og Le Marchand i 1998 . Nukleotidsekvensen af β-globin-primerne er som følger: β-globin fremadrettet PCR-primer: 5′-TGGGTTTTTCTGATAGGGCACTGACT-3′. β-globin reverse PCR-primer: 5′-AACAGAGCATCATCAGGAGGAGTGGACAGAT-3′. PCR-amplifikationen blev indledt ved 95 °C i ti minutter og afsluttet med 45 amplifikationscyklusser (denaturering ved 95 °C i 15 sekunder, annealing ved 55 °C i 45 sekunder og extension ved 65 °C i et minut).

Den anden plade blev anvendt til screening for tilstedeværelse af HPV-infektion ved hjælp af MY11/GP6-primere fra HPV L1 ORF . Nukleotidsekvenserne af MY11/GP6-primerne er som følger: MY11 fremadrettet primer: 5′- GCM CAG CAG GGW CAC AAY AAY AAT GG -3′ og GP6 omvendt primer: 5′- GAAAAATAAATAAACTGTAAATCATATATTC-3′. Den forventede størrelse af det amplificerede fragment er 185 bp. PCR-amplifikationen blev indledt ved 95 °C i ti minutter og afsluttet med 45 amplifikationscyklusser (denaturering ved 95 °C i 15 s, annealing ved 45 °C i 45 s og forlængelse ved 65 °C i et minut).

Den tredje plade blev brugt til at screene for tilstedeværelsen af HPV-infektion ved hjælp af HVP2/B5-printere fra HPV L1 ORF . Nukleotidsekvenserne af HVP2/B5-primerne er som følger: HVP2 fremadrettet primer: 5′- TCN MGN GGN GGN CAN CCN YTN GG -3′; B5 omvendt primer: 5′- AYN CCR TTR TTR TTR TGN TGN CCY TG -3′. Den forventede størrelse af det amplificerede fragment er 650 bp. PCR-amplifikationen blev indledt ved 95 °C i ti minutter og afsluttet med 45 amplifikationscyklusser (denaturering ved 95 °C i 15 sekunder, annealing ved 50 °C i 45 sekunder og forlængelse ved 65 °C i et minut).

Fluorescensspektrer blev optaget under elongationsfasen i hver PCR-cyklus. Sequence Detection Software (SDS v1.7) fra ABI 7500 real-time PCR blev anvendt til at generere amplifikationskurven for hver reaktion. Der blev genereret en dissociationskurve efter hver reaktion for at skelne mellem specifikke og uspecifikke amplikoner. På grundlag af amplifikationskurven blev alle prøver med HPV-amplifikation fra en hvilken som helst cyklus og op til cyklusnummer 40 (med en cut-off-grænse på 0,2) udvalgt til analyse. Kun prøver med en dissociationskurve mellem 70 °C og 80 °C og med en derivatværdi mellem 0,100-0,500 blev betragtet som HPV-DNA-positive.

Sanger-sekventering

HPV-DNA i vorter blev amplificeret ved nested PCR forud for sekventering ved hjælp af AmpliTaq Gold Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) HVP2/B5-primere blev anvendt i den første PCR og CN1F/CN1R, CN2F/CN2R, CN3F/CN3R og C4F/C4R-primere i den anden PCR. Den første PCR-amplifikation blev indledt ved 95 °C i ti minutter og afsluttet med 35 amplifikationscyklusser (denaturering ved 95 °C i 15 sekunder, annealing ved 50 °C i 45 sekunder og forlængelse ved 68 °C i et minut). Den anden PCR-amplifikation blev udført med 3 μl af det første PCR-produkt og under de samme cykliske betingelser. De HPV-genotyper med bredt spektrum, der forventes at kunne påvises fra hudvorter ved hjælp af HVP2/B5- og CN1F/CN1R-, CN2F/CN2R-, CN3F/CN3R- og C4F/C4R-printere, omfatter HPV-typer fra alfa-genera (HPV 2, 3, 7, 10, 27, 28, 29, 40, 43, 57, 77, 91 og 94), gamma (HPV 4, 65, 95, 48, 50, 60 og 88), mu (HPV 1 og 63) og nu (HPV 41) .

PCR-produkterne blev renset ved hjælp af et PCR-rensningssæt (NucleoSpin Extract II PCR Purification Kit, Macherey-Nagel GmbH & Co.KG, Düren, Tyskland) i overensstemmelse med producentens anvisninger. De blev derefter underkastet Sanger-sekventeringsreaktion ved hjælp af BigDye terminator v3.1 cycle sequencing mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) og de nested PCR-primere, der er beskrevet ovenfor. Der blev foretaget PCR-oprensning efter sekventering for at fjerne ubundne fluorescerende farvestofdeoxyterminatorer ved hjælp af BigDye XTerminator™-oprensningssæt (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Prøverne blev denatureret i 2 minutter ved 95 °C og straks afkølet på is og indlæst i en ABI 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Prøverne blev elektroforeset på et 50 cm kapillærarray med POP 6-polymer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) som separationsmedium.

Prøverne blev analyseret ved hjælp af Sequencing Analysis software v 3.7 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). HPV-sekvenstilpasningen blev udført med sekvenser præsenteret i GenBank-databasen ved hjælp af BLASTn-software (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) og Los Alamos Data National Laboratory Theoretical Biology and Biophysics HPV-databasen (https://pave.niaid.nih.gov/).

Når de opnåede sekvenser var af dårlig kvalitet på grund af lavt udbytte af PCR-produktet, blev PCR-produkterne klonet ind i pGEM-T Easy Vector (Promega, Madison, WI) efter oprensning med Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System-kittet (Promega), og sekventering af indsatse blev udført ved hjælp af M13 fremadrettede og omvendte primere.

Statistisk analyse

Data om den kliniske diagnose, demografiske data og virologisk analyse blev opgjort i tabeller og analyseret ved hjælp af den statistiske SPSS-software “Statistical Package for Social Sciences, SPSS version 25.0” (IBM Corp, Armonk, NY, USA). Der blev beregnet beskrivende statistikker: hyppigheder/procenter, mål for centrum og spredning. Til test af lighed af middelværdier blev t-test med to stikprøver anvendt for alle kontinuerte variabler, når der var tale om normalitet, ellers blev Mann Whitney U-test anvendt. Til sammenligning af middelværdierne for tre grupper blev der anvendt enten variansanalyse eller Kruskal-Wallis-test, afhængigt af om antagelserne var opfyldt. Pearson chi square-test for uafhængighed eller Fisher exact-test blev anvendt til at teste sammenhænge mellem to kategoriske variabler, når forudsætningerne var opfyldt. For at modellere et binært resultat med et sæt kovariater blev der anvendt logistisk regression, og rå og justerede odds ratio’er og deres 95 % konfidensintervaller blev estimeret. Alle test var tohalede, og en P-værdi på mindre end 5 % blev anset for statistisk signifikant.