Sammenlignende undersøgelse af virkningen af baicalin og dets naturlige analoger på neuroner med ilt- og glukoseunderskud, der involverer den medfødte immunreaktion af TLR2/TNF𝛼

Abstract

Dette arbejde er at studere baicalin og dets tre analoger, baicalin, wogonosid og wogonin, på den beskyttende virkning af neuron fra ilt-glukosemangel (OGD) og toll-like receptor 2 (TLR2) ekspression i OGD-skader. Resultaterne viste, at baicalin og dets tre analoger beskyttede neuroner mod OGD-skader og nedregulerede proteinniveauet af TLR2. D-Glucopyranosiduronsyre på sted 7 i strukturen spillede en central rolle for cytotoksiciteten af disse flavonoidanaloger. Methoxylgruppen på kulstof 8 i strukturen havde forbindelse med TLR2-proteinekspression samt antiinflammation. Desuden påviste vi caspase3 og antioxidationsevne for at undersøge virkningen af fire analoger på celleapoptose og den samlede antioxidationskompetence i OGD-modellen.

1. Introduktion

Scutellariae radix, en kinesisk medicin, har forskellige farmakologiske virkninger såsom antibakterielle, antivirus, antiinflammation, antioxidation og anti-slagtilstand i klinikken . Dens aktive ingrediens er en slags flavoner, der består af baicalin, baicalein, baicalein, wogonin og wogonisid kortvarigt (Figur 1) . Det er rapporteret, at Scutellariae radix beskytter neuroner mod skade ved iskæmi og reperfusion . Baicalin, den vigtigste komponent i flavonerne, blev bekræftet med neuroprotektion af skaderne ved iskæmi og reperfusion og virkningen på det centrale nervesystem . For nylig blev baicalein undersøgt med en lovende effekt af neuroaktion på flere steder . Der foreligger imidlertid ingen rapport om virkningen af baicalin og TLR2-ekspression på neuroner. Nogle få undersøgelser rapporterede, at wogonin og wogonosid virkede på neuroner . Baicalin og baicalein blev undersøgt som en antioxidant; i nogle få modeller var baicalein endog stærkere end baicalin til at reducere flere frie redialer . Ved sammenligning af dem mindskede baicalein og baicalin signifikant den cellulære skade induceret af hydrogenperoxid, men wogonin og wogonosid virkede mere svagt . Det antydes, at der må være andre mekanismer for wogonin og wogonosid på neuroprotektion.

Figur 1

Kemiske strukturer af baicalin og dets naturlige analoger, baicalein, wogonosid og wogonin.

Da den antiinflammatoriske virkning af baicalin og baicalein blev bekræftet, blev undersøgelserne om det medfødte immunrespons undersøgt i cerebral iskæmi-reperfusion og præsenterede delvis årsagen til, at den antiinflammatoriske virkning af baicalin og baicalein var en af de vigtigste analyser til beskyttelse af hjernen mod iskæmi-reperfusionsskader . Adskillige receptorer blev angivet som de vigtigste mål for iskæmisk reperfusionsskade i gliaen, såsom toll like receptorer (TLR’er) og NOD’er (nucleotide-binding oligomeriseringsdomæne) . Vores tidligere forsøg viste, at baicalin dæmpede ekspressionen af NOD2 og TNFα i neuroner med iskæmi og reperfusionsskade in vivo og in vitro . Wogonosid blev rapporteret med hæmning af lipopolysaccharid-induceret angiogenese via toll-like receptor 4 (TLR4)-signaltransduktion . TLR2 er imidlertid ikke blevet undersøgt af baicalin og dets naturlige analoger.

Baseret på de tidligere nævnte oplysninger undersøgte vi reguleringsadfærden af baicalin og dets analoger gennem en slags neuroncelle PC12 for at udforske de mulige mål for baicalin og dets analoger i medfødte immunreaktioner under ilt- og glukosemangel (OGD) og relationerne mellem den kemiske struktur og virkningen blandt baicalin og dets naturlige analoger. Da TLR2 er en af de første receptorer i den medfødte immunitet, og den inflammatoriske aktivering samt TNFα kan hæmmes af baicalin i lungeceller , blev proteinekspressionen af TLR2 og TNFα testet for at finde ud af baicalins og dets analogers rolle i disse nerveskademodeller. I mellemtiden er caspase3 et velkendt indeks for apoptose, og flere undersøgelser rapporterede, at et par flavoner kunne inducere apoptose af inflammatoriske celler , så vi detekterede ekspressionen af caspase3-protein. Derudover blev effekten af de fire analoger på den samlede antioxidationsevne af celler i OGD-modellen også påvist i dette papir, hvilket yderligere sammenlignede den samlede kompetence af disse flavoner .

2. Materialer og metoder

2.1. Kemikalier og materialer

Baicalin (renhed var 98%) blev præsenteret af Dr. Lujun Zhang, Laboratory of Pharmaceutical Sciences, Tsinghua University. Wogonosid (renhed 98 %) blev præsenteret af Dr. Xiuwei Yang, School of Pharmaceutical Science, Peking University. Baicalein og wogonin, alle med en renhed på 98 % (batchnummer 111595-200604 og 111514-200403), blev indkøbt fra China National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products. Der blev anvendt deioniseret vand under hele forsøget. Andre organiske opløsningsmidler og reagenser var af analytisk reagenskvalitet. PBS-buffer med pH 7,4 blev fremstillet i vores laboratorium. PC12-celler blev stillet til rådighed af Cell Bank of the Institute of Fundamental Medicine, Chinese Academy of Medical Science (Beijing, Kina). Fetal bovin serum (FBS) og RPMI 1640-medium blev købt fra GIBCO. Anti-TLR2/TNFα/caspase3/β-actin-antistoffer blev købt fra Santa Cruz Company (USA). Det sekundære antistof blev købt fra Zhongshan Company (Beijing, Kina). Detektionssættet til påvisning af den samlede antioxidationsevne (T-AOC) blev købt fra Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Kina).

2.2. Celledyrkning

PC12-celler blev justeret til ca. 1 × 106 celler/mL med 2 mL inokuleret i hver brønd i 6-hulsplader (Costar) i RPMI 1640 suppleret med 10 % føtal bovin serum (FBS) og 5 % hesteserum og penicillin/streptomycin (100 U/mL hver). Cellerne blev dyrket i et befugtet inkubator (5 % CO2) (Sanyo, Japan) ved 37 °C og fik lov til at hæfte i mindst 48 timer.

2.3. Cytotoksicitetsanalyser in vitro

De sikre doser af baicalin og dets tre analoger til cellerne blev evalueret ved MTT (methylthiazol tetrazolium) assay in vitro. Efter 24 timers inkubering af celler i 96-well-plader blev baicalin og dets analoger tilsat med en dosering fra 10 mg/mL til 0,001 mg/mL. 24 timer efter tilsætningen af forbindelserne blev kulturmediet i 96-hulspladerne inkuberet med MTT (5 mg/mL, 200 μL pr. brønd) ved 37 °C i 4 timer. Derefter blev mediet omhyggeligt opsuget, og 200 μL dimethylsulfoxid (DMSO) pr. brønd blev tilsat for at opløse de blå formazanprodukter. Absorbansværdierne ved 490 nm blev målt ved hjælp af en mikropladelæser (Model 550，Bio-Rad，USA). Resultaterne af absorbansen af testbrøndene blev udtrykt som levende celler. Den 50 % cytotoksicitetskoncentration (CC50) blev beregnet .

2,4. Celler til ilt-glukosemangel

For ilt-glukosemangel (OGD) erstattede vi vækstmediet med glukosefrit kulturmedium (2 mL pr. brønd) og satte pladerne i en inkubator (YCP-30Q, Changsha, Kina) fuld af 95% N2/5% CO2 ved 37°C i 120 min. Derefter blev cellerne returneret til det normale fodringsmedium og inkuberet under normale forhold ved 37 °C (Sanyo, Japan) i den specifikke tid for senere eksperimenter. Kontrolcellekulturer, der ikke var frataget ilt og glukose, blev inkuberet under normale forhold i mediet med glukose.

For forbindelsernes beskyttende virkning mod OGD-skader blev cellelivsassayet udført som tidligere beskrevet. Efter 24 timers inkubation af cellerne i 96-well-plader blev baicalin og dets analoger tilsat med doser fra 10 mg/mL til 0,001 mg/mL. 24 timer senere efter tilsætning af forbindelserne blev kulturmediet i 96-hulspladerne inkuberet med MTT (5 mg/mL, 200 μL pr. brønd) ved 37 °C i 4 timer. Mediet blev omhyggeligt opsuget, og 200 μL DMSO pr. brønd blev tilsat for at opløse de blå formazanprodukter. Absorbansværdierne ved 490 nm blev målt ved hjælp af en mikropladelæser. Resultaterne af absorbansen af testbrøndene blev udtrykt som levende celler. Den 50% effektive koncentration (EC50) blev beregnet . Kombineret med forbindelsernes cytotoksicitet (CC50) blev sikkerhedsindeksene (SIs) beregnet ved EC50/CC50 .

For TLR2/TNFα- og caspase3-undersøgelsen blev den minimale sikkerhedskoncentration af baicalin og dets analoger bestilt som 10 μg/mL. Disse forbindelser (10 μg/mL) blev tilsat, når kulturmediet blev udskiftet med glucoseopløsning, og cellerne blev dyrket under normale forhold. Cellerne blev udtaget til proteinforsøg på det specifikke reperfusionstidspunkt (0,5, 1, 3 og 6 timer), efter at baicalin og dets analoger var blevet tilsat. I kontrol blev der anvendt medium som medium, og cellerne blev opsamlet ved reperfusionstidspunktet på 6 timer.

2.5. Forberedelse af prøver

To grupper uden lægemidler blev anvendt som kontrol. Den ene gruppe af cellerne blev udsået i mediet med normalt vækstmedium under hele forsøgsprocessen uden ilt-glukose-berøvelse. Den anden gruppe blev udsået i mediet med ilt-glukosemangel som modelkontrol. På hvert tidspunkt blev celleprøven fremstillet på samme måde som i den foregående beskrivelse. Mediet blev trukket ud fra hver brønd, og cellerne blev vasket tre gange med kold PBS (pH 7,4) og brugt med 100 μL RIPA til at samle totalprotein til Western blotting.

2.6. Western Blot

Western Blot-analyse for proteinekspression af β-actin, TLR2, TNFα og Caspase3 blev refereret i med minimodificering som følger: indlæste prøver i gelen (10%), blev kørt indtil markøren (købt fra Fermentas Republic of Lithuania) og gik til slutningen af gelen. Overførslen skulle være halvtør i 60 min. ved 12 volt og 280 mA. Derefter blev membranen blokeret med 10 % mælk i PBST (1 × PBS + 0,1 % Tween20) i 60 min under langsom rystning ved stuetemperatur. Membranen blev anbragt i 1 mL PBST med antistof i en 1 : 1000-forstørrelse, inkuberet i 60 min ved stuetemperatur på rysteren og vasket 3 gange med PBST efter inkubationen af det primære antistof. Derefter blev membranen inkuberet i 60 min i PBST med det sekundære antistof i koncentrationen 1 : 3000 i PBST. Membranen blev vasket 3 gange med PBST ved sidst.

2,7. Påvisning af total antioxidationsevne

Princippet i dette forsøg var at påvise farveændringen efter reduktionen af Fe3+ til Fe2+ ved hjælp af de reducerende komponenter i prøverne. De reducerende komponenter kan omfatte enzymer og ikke-enzymatiske molekyler såsom lipidopløseligt antioxidant E-vitamin og vandopløselige antioxidanter C-vitamin, bilirubin og urinsyre. Derefter blev den optiske tæthed målt ved 520 nm med en mikropladelæser . Celleprøven blev fremstillet på samme måde som tidligere beskrevet og udtaget på det specifikke reperfusionstidspunkt (6 timer), efter at baicalin og dets analoger var blevet tilsat. Mediet blev trukket ud fra hver brønd, og cellerne blev vasket tre gange med kold PBS (pH 7,4). Disse celler i pladen blev opløst med PBS (1 mL pr. brønd) ved gentagen nedfrysning og optøning. Supernatanten blev opsamlet til T-AOC-test efter centrifugering ved 12 000 rpm/min.

2.8. Dataanalyse

Alle værdier blev udtrykt som gennemsnit ± S.D. Data blev statistisk analyseret ved ANOVA. Newman-Keuls-sammenligninger blev anvendt til at bestemme kilden til signifikante forskelle, hvor det var relevant. P-værdier under 0,05 blev betragtet som statistisk signifikante. Softwaren CALC 2.0 (The China Association of Pharmacology) blev anvendt til CC50- og EC50-beregning.

3. Resultater

3.1. Cellevækstprofil

Cellerne blev udsået i pladerne med mediet med 10 % FBS i 48 timer. De ville ikke blive brugt til eksperimenterne, før de voksede godt og hæftede sig tæt til hinanden i fladen i multiwell-pladerne.

3.2. MTT-test af cytotoksicitet

For at undersøge cytotoksiciteten og bestemme de sikre doser af baicalin og dets analoger blev MTT-assayet udført på PC12-celler in vitro. Baseret på eksperimenterne var 10 μg/mL baicalin og wogonosid den højeste sikkerhedskoncentration på normale PC12-celler, og 1 μg/mL baicalein og wogonin var den højeste sikkerhedskoncentration på normale PC12-celler (figur 2).

(a)

(b)

(a)
(b)

Figur 2

Cytotoksicitet af baicalin, wogonosid, baicalein og wogonin i normale PC12-celler (MTT-assay). Efter 24 timers inkubation af cellerne i 96-well-plader blev kemikalierne tilsat med en dosering fra 10 mg/mL til 0,001 mg/mL. *𝑃<0,05 i forhold til normal kontrol. Data blev præsenteret som gennemsnit ± S.D. fra syv uafhængige eksperimenter.

I PC12-celler behandlet med ilt-glukosemangel overlevede kun mindre end 40 % celler i forhold til normal kontrol (𝑃<0,05). Sammenlignet med modelkontrol var den mindste effektive koncentration (MEC) af baicalin og wogonin 10 μg/mL, mens MEC af både wogonosid og baicalein var den samme på 1 μg/mL. Den maksimale effektive koncentration (MAXEC) af baicalin og woronin var den samme på 1 mg/mL, hvilket indebærer den samme sikkerhed for dem. MAXEC for wogonosid var 1 mg/mL, men MAXEC for baicalein var kun på 10 μg/mL. Det blev antydet, at baicalein var mere cytotoksisk end wogonosid. Alle disse forbindelser blev ikke vist på den koncentrationsafhængige måde tydeligt (figur 3).

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Den CC50 af baicalin (188,4 μg/mL eller 0,422 mmol/L) viste store forskelle fra de tre andre forbindelser. Baicalein viste mere celletoksicitet med CC50 8,9 μg/mL (svarende til 0,0329 mmol/L). Wogonin og wogonosid udviste toksicitet svarende til CC50 henholdsvis 10,6 μg/mL (svarende til 0,0373 mmol/L) og 13,7 μg/mL (svarende til 0,0298 mmol/L). Baicalein var imidlertid mere effektiv til beskyttelse af cellerne mod OGD-skader. Den mindste effektive dosis af baicalein var 1 μg/mL (svarende til 0,0037 mmol/L). EC50 for baicalin var 1,2 μg/mL (svarende til 0,0027 mmol/L), og EC50 for wogonin og wogonosid var 4.3 μg/mL (svarende til 0,0151 mmol/L) og 7,4 μg/mL (svarende til 0,0161 mmol/L). Ved sammenligning mellem toksicitet og virkning var sikkerhedsindeksene for de fire forbindelser henholdsvis 156 (baicalin), 8,89 (baicalein), 2,47 (wogonin) og 1,85 (wogonosid) (tabel 1).

3.3. Effekt på udtrykkene af TLR2, TNFα og Caspase3

I forbindelse med OGD-skader blev proteinerne TLR2 og TNFα i cellerne udtrykt tydeligt, hvilket betyder, at OGD stimulerede den medfødte immunreaktion og forårsagede inflammation. Caspase3-proteinet i OGD-modellen blev opreguleret i nogen grad, men der var ingen signifikant statistisk værdi (figur 4). Baicalin dæmpede proteinekspressionen af TLR2 og TNFα 3 timer efter administrationen. Når baicalin virkede i 0,5 h, viste ekspressionen af TLR2 statistisk signifikans uanset sammenlignet med den normale eller sammenlignet med modellen (𝑃<0,05), og TLR2-ekspressionen af 1 h steg (sammenlignet med den normale, 𝑃<0,05); dens ekspression af 3 h eller 6 h viste imidlertid ingen åbenlys forskel sammenlignet med den normale (sammenlignet med modellen, 𝑃<0,05). Udtrykket af TNFα af 0,5 h var stadig højere end kontrollen (𝑃<0,05), og dets udtryk af 1 h, 3 h og 6 h blev tydeligt nedreguleret, hvilket viste signifikant forskel i forhold til modelniveauet (𝑃<0,05). Baicalin påvirkede tilsyneladende ikke ekspressionen af protein caspase3, hvilket blev vist i figur 4(a).

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Figur 4

Virkningen af de fire analoger på proteinudtrykkene af TLR2, TNFα og caspase3 i PC12-celler med ilt-glukose-deprivation (OGD). Proteinniveauet blev målt ved Western blot. Model betyder behandling med ilt-glukosedeprivation. 0,5, 1, 3 og 6 timer betyder tiden for reperfusionsprocessen efter OGD. (a) står for baicalin-effekt; (b) står for wogonosid-effekt; (c) står for baicalein-effekt; (d) står for wogonin-effekt. Baicalin, wogonosid og wogonin blev anvendt i en koncentration på 10 μg/mL, og baicalein blev anvendt i en koncentration på 1 μg/mL. *𝑃<0,05 i forhold til normal kontrol. #𝑃<0,05 i forhold til modelgruppen. Data blev præsenteret som gennemsnit ± SD fra tre uafhængige eksperimenter.

Efter tilsætning af wogonosid (10 μg/mL) blev TLR2 og TNFα tilsyneladende nedreguleret. Ekspressionen af TLR2 var meget lavere end i modellen, endda end det normale niveau (𝑃<0,05). I overensstemmelse hermed blev ekspressionen af TNFα tilsyneladende hæmmet af wogonosid fra 0,5 timer efter administrationen til tidspunktet 6 timer (𝑃<0,05). Wogonosid viste heller ikke nogen tydelig virkning på ekspressionen af caspase3 (Figur 4(b)).

Efter baicaleinadministration blev TLR2 stadig opreguleret signifikant 0,5 h og 1 h efter tilsætning af baicalein (𝑃<0,05), og det faldt ned til det normale ved 3 h og 6 h. Sammenlignet med modellen blev TNFα opreguleret ved 0,5 h og faldt gradvist senere. Ligesom TLR2 blev det udtrykt ned til det normale ved 3 h og 6 h (figur 4(c)).

I wogoningruppen faldt de to faktorer tilsyneladende. TLR2 faldt til det normale niveau efter 0,5 h efter tilsætning af wogonin (sammenlignet med modellen, 𝑃<0,05), og den forblev på et lavere niveau i løbet af forsøgsforløbet. På tidspunkterne 0,5 h og 1 h blev TNFα udtrykt mere end det normale (𝑃<0,05), men mindre end modellen (𝑃<0,05), og på 3 h og 6 h kom det tæt på det normale niveau ligesom TLR2-ekspressionen (figur 4(d)).

I lighed med baicalin- og wogonosidgrupperne viste ekspressionen af caspase3 ingen signifikant ændring i baicalein- og wogonin-grupperne (figur 4(c) og 4(d)).

3.4. Analyse af total antioxidationskompetence (T-AOC)

Ved hjælp af T-AOC-sættet fandt vi, at antioxidationskompetencen hos de normale celler var ca. 2,5 U/mg, og en af de celler, der blev behandlet med ilt-glukosemangel, var langt under 0,5 U/mg. I baicalingruppen var detektionsværdien 1,8 U/mL, hvilket viser en signifikant forskel, uanset om man sammenligner med de normale eller sammenligner med OGD-modellen. I wogonosid-, baicalein- og wogoningrupperne var værdierne henholdsvis 1,6, 0,8 og 0,6 U/mg, hvilket alle viste en signifikant forskel sammenlignet med den normale eller modellen (figur 5).

Figur 5

Effekt af baicalin og dets tre analoger på den samlede antioxidationskompetence hos PC12-celler behandlet med ilt-glukose-deprivation. Model betyder behandling med ilt-glukosemangel. Baicalin, wogonosid og wogonin blev anvendt i en koncentration på 10 μg/mL, baicalein blev anvendt i en koncentration på 1 μg/mL. **𝑃<0,01 i forhold til normal kontrol. ##𝑃<0,01 i forhold til modelgruppen. $$𝑃<0,01 versus baicalin- og wogonosidgrupper. Data blev præsenteret som gennemsnit ± S.D. fra otte uafhængige eksperimenter.

4. Diskussioner

Baicalin er en glykosyleret forbindelse afledt af baicalein, og den har en funktionel gruppe af D-glucopyranosiduronsyre på sted 7 i baicalein (figur 1), således at den vil udvise mere biologisk funktion. Baicalins grundstruktur består af benzopyran med tre hydroxylgrupper på sted 5, 6 og 7 og en phenylgruppe på den anden side af benzopyranen (sted 2). Baicalin har også en enolstruktur på benzopyranringen for at opretholde konjugationen. De to forskelle mellem baicalin og wogonin ligger i methoxylgruppen på kulstof 8 i wogonin og hydroxylgruppen på kulstof 6 i baicalein. De tre hydroxylgrupper i baicalin kan være årsag til de mere hydrofile egenskaber. Desuden er wogonosid en glykosyleret form af wogonin med D-glucopyranosiduronsyre på kulstof 7. Alle fire forbindelser har det samme kulstofskelet med en benzopyranstruktur og også en hydroxylgruppe på kulstof 5; baicalein og baicalin har hydroxylgrupper på kulstof 6, mens wogonin og wogonosid ikke har det; baicalein og wogonin har hydroxylgrupper på kulstof 7, mens wogonosid og baicalin begge er glykosylerede på hydroxylgruppen på sted 7; endelig har wogonin og wogonosid methoxylgrupper på kulstof 8, men baicalein og baicalin har ikke de funktionelle grupper .

Med hensyn til resultatet af cytotoksicitet og neuroprotektion var D-glucopyranosiduronsyre på sted 7 vigtig for at reducere cytotoksicitet, hvor baicalin var mindre cytotoksisk end baicalein og wogonosid var mindre cytotoksisk end wogonin. Methoxylgruppen på kulstof 8 og hydroxylgruppen på kulstof 6 var den vigtigste faktor, der påvirkede den neuroprotektive virkning, hvorved EC50 af baicalin og baicalein var mindre end den af wogonosid og wogonin (figur 1 og tabel 1), efter at de blev administreret.

I denne undersøgelse fandt vi, at TLR2 blev stærkt udtrykt under ilt- og glukosemangel (OGD) skade i PC12-celler, hvilket antydede, at receptoren blev aktiveret i de beskadigede neuroner (figur 4). TLR2 var blevet identificeret som en nøglemediator af immunresponser og inflammatoriske reaktioner, og den medierede proinflammatoriske reaktioner gennem aktivering af TNFα . Receptoren var signifikant opreguleret sammenlignet med det normale niveau, hvilket indikerer, at den sluttede sig til neuronskader induceret af OGD.

Ved litteraturen af forskning er TLR2 i det centrale nervesystem (CNS) indset som den direkte kilde til det skadelige signal og et vigtigt potentielt terapeutisk mål . I vores resultater faldt udtrykkene af TLR2 og TNFα tilsyneladende et par timer efter, at vi tilføjede forbindelserne. I den samme profil blev udtrykkene af TLR2 og TNFα med wogonin og wogonosid mere hæmmet end dem med baicalin og baicalein. Hæmningen af ekspressionen begyndte fra 0,5 timer efter indgivelse af wogonin og wogonosid; hæmningen af TLR2- og TNFα-ekspressionen viste sig imidlertid senere 3 timer efter indgivelse af baicalin og baicalein. Derfor blev det indset, at wogonin og wogonosid havde præference med TLR2. Kombineret med deres kemiske strukturer indebar alle resultaterne, at methoxylgruppen på kulstof 8 i strukturen er farmakoforhypotesen for virkningen af TLR2-hæmning, der relaterer sig til betændelseshæmning.

Med betingelse af overundertrykkelsen på TLR2 og TNFα af disse analoger påviste vi caspase3 for at bekræfte, om der eksisterede apoptose med tilsætning af analogerne. Sammenlignet med det normale steg ekspressionen af caspase3-protein i OGD-modellen faktisk i nogen grad, men viste ingen statistisk forskel. Ved indgivelse af de fire analoger viste niveauet af caspase3-protein ingen åbenlys ændring, selv om det viste en tendens til at falde på 6 timers tidspunkt og nær den normale kontrol (sammenligning med den normale eller modellen, 𝑃>0,05). Ovenstående resultater tydede på, at de skadede PC12-celler i OGD-modellen ikke havde nogen åbenlys apoptose, og de fire analoger kunne heller ikke inducere apoptose i de skadede PC12-celler. Ifølge litteraturen dæmpede baicalin global cerebral iskæmi-reperfusionsskade hos gerbiler via antioxidative og antiapoptotiske veje , og baicalein og wogonin kunne begge inducere apoptose i humane bugspytkirtelkræftceller og HL-60 leukæmiceller . Derfor skal vores resultater af apoptose ved disse forbindelser undersøges yderligere.

Med hensyn til T-AOC-detektion fandt vi, at den samlede antioxidationskapacitetssekvens var baicalin og wogonosid > baicalein og wogonin, hvilket indikerer, at en glykosyleret form på sted 2 af baicalin og wogonosid spillede en nøglerolle i den samlede antioxidation.

Samlet set præsenterede baicalin og dets tre analoger omfattende beskyttelse af neuronceller mod OGD-skader og hæmning af TLR2-ekspression og TNFα (faktoren i nedstrømmen), hvilket tyder på muligheden for, at disse forbindelser anvendes i slagtilfældebehandling ved at målrette TLR2, en af de vigtigste mekanismer for hjerneskaderne. Der er et struktur-aktivitetsforhold mellem dem med sikkerhed, effektivitet og specificitet i forbindelse med lægemiddelretning af TLR2. Dette er første gang, at baicalin og dets naturlige analoger undersøges på molekylære mål for TLR2 og TNFα samt T-AOC. Alt det vil have fordel i at belyse og udvikle dem til de nye lægemidler.

Autors bidrag

De to første forfattere bidrog ligeligt.

Akkreditering

Forfatteren takker alle medlemmer i deres laboratorium. Undersøgelsen blev delvist støttet af National Natural Science Foundation of China (30801523, 81073092), National S&T Major Special Project for New Drug R&D of China (2012ZX09103-201-041, 2012ZX09102-201-008 og 2011ZX09101-002-11), og Special Foundation for Laboratory of Tsinghua University (LF 20103579).