Teknologi til forgrenet DNA (bDNA)

BY admin
|

Indledning

Assayet til forgrenet DNA (bDNA) er et unikt og effektivt værktøj til pålidelig kvantificering af nukleinsyremolekyler. bDNA-assayet er grundlæggende forskelligt fra målforstærkningsmetoder som f.eks. PCR, idet det direkte måler nukleinsyremolekyler på fysiologiske niveauer ved at forstærke reporter-signalet i stedet for at replikere målsekvenser som detektionsmiddel, og dermed undgås de fejl, der er forbundet med ekstraktion og forstærkning af målsekvenser. bDNA-assayet anvender lineær signalforstærkning ved hjælp af syntetiske oligonukleotidprober og bDNA-molekyler og kan nøjagtigt og præcist måle mellem ca. 500 og 10 000 000 molekyler. Nye fremskridt inden for bDNA-teknologien omfatter tilføjelse af forforstærkermolekyler og inkorporering af nye nukleotider, isoC og isoG, i oligonukleotidprobesekvenser for yderligere at øge signalet og reducere støj forårsaget af uspecifik hybridisering af bDNA-assaykomponenter. Disse forbedringer har udvidet den kvantitative detektionsgrænse for bDNA-assayet til så lavt som 50 molekyler.

Historie om bDNA-teknologi

Det er velegnet til rutinemæssig brug i kliniske eller forskningsmæssige omgivelser, og bDNA-assayet er blevet anvendt med succes inden for en række områder, herunder prognose og overvågning af patienter med virussygdomme. Som et pålideligt middel til direkte kvantificering af viral belastning i kliniske prøver er der udviklet bDNA-assays til måling af DNA fra hepatitis B-virus, RNA fra hepatitis C-virus, RNA fra humant immundefektvirus type 1 og DNA fra cytomegalovirus. Med den skræddersyede udformning af oligonukleotidprober rækker de potentielle anvendelser af bDNA-assayet langt ud over viral nukleinsyrekvantificering. Ved at skabe oligonukleotidprober til specifikke sekvenser af målnukleinsyremolekyler er bDNA-assayet blevet tilpasset til en lang række forskellige anvendelser. Forskere har f.eks. designet sonder til bDNA-assayet til måling af cellulære mRNA-niveauer. Dette har vist sig at være en frugtbar metode til en række forskningsanvendelser, herunder overvågning af ændringer i cytokin-mRNA-niveauer i raske og immunsvækkede patientpopulationer, undersøgelse af insulinsplejningsmønstre og evaluering af stressgeninduktion med henblik på molekylær toksikologiske anvendelser. På grund af dens alsidighed, brugervenlighed og høje ydeevne er bDNA-assayet hurtigt ved at blive den foretrukne metode til nukleinsyrekvantificering

Outline

BDNA-assayet anvender et mikropladeformat med 96 brønde og er baseret på en række specifikke hybridiseringsreaktioner og kemiluminescensdetektion af hybridiserede sonder. På overfladen af hver enkelt mikrobøtte er der anbragt “fangst”-sonder, som indeholder en specifik nukleotidsekvens. Disse indfangningssonder binder sig til en delmængde af “målsonder”, som er bundet til specifikke nukleotidsekvenser i målnukleinsyremolekylet. Denne serie af hybridiseringer forankrer målnukleinsyremolekylet til mikrovællens overflade. Detektion af målnukleinsyren og forstærkning af signalet sker gennem en anden serie af hybridiseringer.

En anden undergruppe af målsonder binder målnukleinsyremolekylet til bDNA-forstærkermolekyler. Med tilføjelse af forforstærkermolekyler, der giver et yderligere lag af forstærkning mellem målproberne og bDNA-forstærkermolekylerne, kan der opnås endnu større signalforstærkning. Hvert bDNA-forstærkermolekyle er designet til at indeholde 15 arme, som hver indeholder tre bindingssteder for alkalisk fosfatase-konjugerede “mærkesonder”. Der dannes et kemiluminescenssignal ved indføring af et dioxetansubstrat, som aktiveres af den alkaliske fosfatase. Dette signal kan let kvantificeres ved at tælle antallet af fotoner, der udsendes i et luminometer. bDNA-assayet er i sagens natur kvantitativt, da antallet af fotoner, der udsendes, er direkte relateret til mængden af målnukleinsyre i prøven.

Materialer

Udstyr – Chiron-pladevarmer udstyret med 8×12-mikroskopholder – Chiron-pladeaflæsningsluminometer

Reagenser til dag 1

  • Oligonukleotid-modificerede mikroskåle
  • Lysefortyndingsmiddel
  • Lysereagens (proteinase K)
  • Målsonder til indfangning
  • Målsonder til mærkning
  • Spekvenser
  • Standarder og kontroller (valgfrit)

Reagenser til dag 2

Procedure

Dag 1

  1. Fremstil arbejdsreagens til prøven ved at kombinere:
  • 6 mllysefortynder
  • 600 ml lysereagens
  • 32 ml 500 fm/ml målprober til indfangning (20 fm/200 ml endelig)
  • 96 ml500 fm/ml målprober til mærkning (60 fm/200 ml endelig)

Note: De faktiske koncentrationer af målproberne vil variere afhængigt af målnukleinsyremolekylet.

  1. For plasma- eller serumprøver skal 150 ml prøvearbejdsreagens og 50 ml serum eller plasma pipetteres i to oligonukleotidmodificerede mikrotønder i to eksemplarer. For celle- eller vævsprøver fremstilles og ekstraheres RNA-pellets i Specimen Working Reagent som beskrevet, og 200 m af hvert RNA-ekstrakt pipetteres i to oligonukleotid-modificerede mikrobrønde.
  2. Hvis det ønskes, kan der medtages positive og negative kontroller af hensyn til specificiteten. Kontrollerne skal behandles på samme måde som beskrevet for prøverne i trin 2 (ovenfor) og køres i to eksemplarer.
  3. Hvis det ønskes, kan der medtages standarder til absolut kvantificering. Pipetter 150 ml prøvearbejdsreagens og 50 ml af det relevante standardkurvemedlem i duplikat oligonukleotidmodificerede mikrovæsker.
  4. Segl mikrovæskerne med Mylarfilm, og inkuber mikrovæskerne natten over ved 53 °C i Chiron-pladevarmeren. (Bemærk: Temperaturen vil afhænge af den definerede optimale temperatur for det specifikke assay.)

Dag 2

  1. Tag pladen ud af Chiron-pladevarmeren, og lad den stå 10 min. ved stuetemperatur. Mens pladen køler af, fremstilles forstærkeropløsningen ved at fortynde forstærkerkoncentratet til 200 fm/ml i etiketfortynder. Den endelige koncentration skal være 10 fm/50 ml.
  2. Vask mikrobrøndene to gange med Wash A, og pipetter derefter 50 ml fortyndet forstærker i hver brønd. Inkuber mikrobrøndene i 30 min. ved 53 °C i Chiron-pladevarmeren.
  3. Tag pladen ud af Chiron-pladevarmeren, og lad den stå 10 min. ved stuetemperatur. Mens pladen køler af, forberedes Label Working Solution ved at fortynde labelsonden med 500 fm/ml i labelfortyndingsmiddel. Den endelige koncentration skal være 20 fm/50 ml.
  4. Vask mikrobrøndene to gange med Wash A, og pipetter derefter 50 ml af Label Working Solution i hver brønd. Inkuber mikrobrøndene i 15 min. ved 53 °C i Chiron-pladevarmeren.
  5. Tag pladen ud af Chiron-pladevarmeren, og lad den stå 10 min. ved stuetemperatur. I dette tidsrum fremstilles substratopløsningen bestående af 99,7 % v/v LumiphosPlus og 0,3 % v/v 10 % SDS (f.eks.: 3 ml LumiphosPlus, 9 ml 10 % SDS).
  6. Vask mikrobrøndene to gange med vask A og derefter tre gange med vask B. Tilsæt 50 ml af substratopløsningen til hver brønd.
  7. Måler kemiluminescensen i det pladeaflæsende luminometer. (Dette omfatter inkubation af mikrobrøndene i 30 minutter ved 37 °C før måling for at opnå steady-state kinetik).

Fejlfinding

  • Oligonukleotid-modificerede brønde skal håndteres med forsigtighed. Brøndstrimler må ikke brydes fra hinanden i segmenter. Forsegl brøndene forsvarligt med en frisk pladetætningsmiddel for at forhindre fordampning under inkubationerne. Når pladeforseglingen fjernes efter inkubationer, skal man være forsigtig med ikke at trække brøndene ud af mikrovællestøtten.
  • Alle prøver, standarder og kontroller bør analyseres i to eksemplarer for at opnå optimal kvantificering. Lipæmiske eller uklare prøver skal udelades, da disse kan give ufyldestgørende resultater.
  • For at opnå optimale resultater skal alle reagenser bringes til den temperatur, der er angivet i assayproceduren, før de anvendes. Tilsæt reagens til mikrobrøndene ved at berøre pipettespidsen til væggen nær midten af brønden, over overfladen af væsken i brønden.

Anvendelse

Viral kvantificering eller viralbelastningstest er blevet en del af rutinemæssig behandling af patienter, der er inficeret med HIV-1 eller hepatitis C-virus (HCV). Der findes i øjeblikket flere molekylære teknologier, der er tilgængelige til brug i kliniske laboratorier. Af disse er det kun de forgrenede DNA-analyser (bDNA), der er FDA-godkendt til testning af HIV-1- og HCV-viralbelastning. Denne signalforstærkningsteknologi er bygget på en række hybridiseringsreaktioner, der i høj grad kan automatiseres fuldt ud og dermed mindsker den arbejdsindsats, der er nødvendig for at udføre denne type analyse.

Molekylærdiagnostiske analyser, der anvender bDNA-teknologi til påvisning af nukleinsyre-målmolekyler, er følsomme, specifikke og pålidelige værktøjer til diagnosticering af virus- og bakterieinfektioner og til overvågning af sygdomsudviklingen i løbet af behandlingen. bDNA-tests har udviklet sig fra udviklingsstadier i forskningslaboratoriet til kvantitative analyser, der er godkendt af US Food and Drug Administration, og som har værdifulde kliniske anvendelser. bDNA-analyser er mindre arbejdskrævende end mange molekylærbaserede procedurer, fordi de er meget velegnede til total automatisering. Ved brug af bDNA er det ikke nødvendigt at amplificere en målsekvens, og derfor er der mindre sandsynlighed for krydskontaminering mellem gentagne prøver på grund af for mange amplikoner eller overførsler i bDNA-analyser. Da bDNA er en signalforstærkningsteknologi, kan assayet desuden kvantificere med mindre end 0,5 log- eller 3-dobbelt variabilitet inden for hele det dynamiske område.

bDNA-teknologien har vist sig alsidig, fordi der er udviklet metoder til påvisning af infektion med en lang række mikroorganismer, herunder parasitten Trypanosoma

brucei, cytomegalovirus, antibiotikafølsomme og antibiotikaresistente Staphylococcus-bakterier, human papillomavirus og hepatitis B-virus. I den seneste tid har man imidlertid fokuseret på udvikling af bDNA-analyser til kvantificering af HIV-1- og hepatitis C-virus (HCV) RNA, hvilket har ført til rutinemæssig anvendelse af bDNA-metoder i det kliniske molekylærdiagnostiske laboratorium. Ved beskrivelsen af udviklingen af bDNA-metoderne lægges der i denne gennemgang vægt på bDNA-analyser for HIV-1 og HCV.

Første generation af HIV-1 bDNA-analyser

Der blev udviklet nøjagtige, reproducerbare bDNA-analyser af første generation til påvisning af HIV-1 RNA og HCV RNA i plasma fra mennesker (Quantiplex HIV-1 eller HCV RNA 1.0 assay, Bayer, Tarrytown, NY).9-11 I en af de første rapporter om Quantiplex bDNA-assayet blev der ikke observeret nogen reaktivitet ved brug af plasmaprøver fra seronegative donorer ved brug af første generation

bDNA-assayet, hvilket indikerer en fremragende specificitet.9 Der blev observeret positive resultater i bDNA-assayet i 83 % af prøverne fra 348 patienter, der var seropositive for HIV-1.9 Det dynamiske område for kvantificering ved hjælp af Quantiplex HIV-1 RNA 1.0-assayet strakte sig fra 104 (nedre detektionsgrænse) til mere end 106 HIV RNA-kopier/mL.9,11 Ændringer i viral belastning på 2-3 gange var statistisk signifikante ved hjælp af bDNA-testen, hvilket indikerer, at Quantiplex HIV-1 RNA 1.0-assayet var meget nøjagtigt og reproducerbart.11 Til sammenligning var det nødvendigt med ændringer i viral belastning på mindst 3,7-5,8 gange, før resultaterne var statistisk signifikante ved hjælp af de tidligste versioner af RT-PCR-assayet.11 Derfor blev bDNA den foretrukne metode i de fleste kliniske forsøg til evaluering af testning af viral belastning og den kliniske effektivitet af nye HIV-1 reverse transkriptase- og proteasehæmmere.

Følsomheden af bDNA-detektionsmetoden blev forbedret i anden generation af HIV-1-assayet (Quantiplex HIV-1 RNA 2.0 assay, Bayer) ved at ændre udformningen af mål- og indfangningssonderne og ved at tilføje præamplificeringsoligonukleotider. Den forbedrede udformning af mål- og indfangningssonderne gjorde det muligt at øge hybridiseringens stringens og dermed mindske baggrundsanalysen. Forforstærkere øger signalintensiteten dramatisk, fordi hvert forforstærkermolekyle har flere regioner til hybridisering med mange bDNA-molekyler. Desuden har hvert bDNA-molekyle flere gentagne sekvenser til hybridisering af AP-mærkede sonder. Signaloutputtet under anvendelse af Quantiplex HIV-1 RNA 2.0-assayet viste linearitet fra ca. 500 kopier/mL til 1,6 × 106 kopier/mL (det angivne dynamiske område var 500 til 8 × 105 kopier/mL). Følsomheden af andengenerationens HIV-1 bDNA-assay blev forøget med 20 gange i forhold til førstegenerationens assay (den nedre detektionsgrænse var henholdsvis 500 kopier/mL og 10 × 104 kopier/mL). I en omfattende analyse af præcisionen blev de første testresultater og resultaterne af en ny test i Quantiplex HIV-1 RNA 2.0-assayet sammenlignet. Det blev konstateret, at HIV-1 RNA 2.0-assayet var meget reproducerbart.14 Af 174 prøver med virusbelastninger på mere end 5.000 kopier/mL havde 96 % forskelle på mindre end 0,3 log10 i kopiantal mellem de oprindelige resultater og genanalyseresultaterne. Af 69 prøver med viral belastning mellem 500 og 5.000 kopier/mL havde 86 % mindre end 0,3 log10 forskelle mellem de første og de nye testresultater. Blandt 5.339 patienter, der blev testet i kliniske rutineprøver i et 1-årsinterval, blev der imidlertid observeret virusbelastninger på mindre end 500 kopier/mL i 41,6 % af prøverne.

Der var derfor behov for en bDNA-analyse med højere følsomhed (dvs. en lavere detektionsgrænse på <500 kopier/mL) for en betydelig del af patienterne.

Det blev sammenlignet mellem Quantiplex HIV-1 RNA 2.0-assayets og en RT-PCR-test (Amplicor HIV-1 Monitor 1.0 assay, Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) ved hjælp af fortyndinger af standardprøver, der havde et kendt antal HIV-1-viruskopier. Når fortyndinger af de samme standarder blev testet i de to assays, var antallet af HIV-1-kopier generelt højere ved RT-PCR-assayet end ved bDNA-assayet. F.eks. var intervallerne for RNA-kopieringstal 900 til 7,68 × 105 kopier/mL i bDNA-testen og 3 360 til 1,88 × 106 kopier/mL i RT-PCR-analysen. Begge assays var lineære i de angivne dynamiske områder.

Sammenligning af hiv-1-kopienummerets hældning i forhold til signaludgangens regressionslinjer tyder på, at bDNA-testen havde mindre proportional systematisk fejl. Variabiliteten mellem kørsler under anvendelse af en standardprøve med 1.650 HIV-1 kopier/mL var lavere i bDNA-testen end i RT-PCR-assayet; variationskoefficienterne for bDNA- og RT-PCR-assayet var henholdsvis 24,3 % og 34,3 %, hvilket indikerer, at bDNA-assayet var lidt mere præcist ved dette HIV-1 RNA-kopiantal. Sammenlignet med anvendelsen af standarden på 1 650 kopier/mL var variationskoefficienterne mellem kørslerne højere for en prøve med 165 HIV-1 RNA-kopier/mL (44,0 % og 42,0 %).7% for henholdsvis bDNA- og RT-PCR-analyserne). Analyseresultaterne var ens, når samme antal HIV-1-kopier blev sammenlignet på tværs af HIV-subtyperne A til F ved hjælp af bDNA-testen. Ved denne version af RT-PCR blev subtyperne A, E og F imidlertid påvist mindre effektivt end B-, C- og D-subtyperne. Forskellene mellem andengenerations bDNA-testen og Amplicor Monitor RT-PCR-testen til hiv-1-kvantificering viste, at der var behov for konsistens i testmetoden for hver enkelt patient under hele diagnosen og behandlingen.

HCV bDNA-assays

Samtidig med at Bayer fortsatte med at udvikle en forbedret tredje generations hiv-1 bDNA-test, erkendte Bayer behovet for at udvikle en HCV-viralbelastningstest med en begyndende klinisk anvendelighed svarende til den for hiv-1-testning. Til påvisning af HCV havde første generation af bDNA-assayet (Quantiplex HCV RNA 1.0 assay, Bayer) et dynamisk kvantificeringsområde i human plasma fra 3,5 × 105 til 1,2 × 108 HCV RNA-kopier/mL. Genotype 1 til 6 blev påvist ved hjælp af dette assay, selv om følsomheden var lavere for genotype 2 og 3 (67 % påvisningsrate: positivt signal for 60 ud af 89 serumprøver, som vides at indeholde HCV-genotype 2 eller 3) sammenlignet med genotype 1 (97 % påvisningsrate: positivt signal for 67 ud af 69 serumprøver, som vides at indeholde HCV-genotype 1). En sammenligning af Quantiplex HCV RNA 1.0-assayet og en RT-PCR-test for HCV, der er udviklet af et forskningslaboratorium, viste større følsomhed i RT-PCR-testen, som havde en nedre detektionsgrænse på 2,5 × 104 HCV RNA-kopier/mL. HCV bDNA-testen havde imidlertid større reproducerbarhed og var mindre tidskrævende end den laboratorieudviklede HCV RT-PCR-test.

For at forbedre påvisningsgraden for HCV-genotyperne 2 og 3 blev der udviklet en andengenerationsassay (Quantiplex HCV RNA 2.0 assay, Bayer).15 Den vigtigste designændring i andengenerations HCV RNA-assayet var at anvende prober til sekvenser i HCV-genomet, der var mere stærkt bevaret på tværs af genotyperne. Disse bevarede regioner var 5′ utranslaterede sekvenser og sekvenser i HCV-genomets kernegen. Resultatet af ændringerne af mål- og opsamlingssonderne var en dramatisk reduktion af variationen i detektionsraten mellem HCV-genotyperne i andengenerationsassayet. Hver af de 6 HCV-genotyper havde en høj detektionsrate, og der var en markant forbedring i detektionen af HCV-genotyperne 2 og 3 (detektion af 93 % mod 67 % af de prøver, som vides at indeholde HCV-genotyperne 2 eller 3 i henholdsvis HCV 2.0- og HCV 1.0-assayet). Også følsomheden af andengenerations bDNA-assayet var en smule forbedret sammenlignet med HCV 1.0-assayet (de nedre grænser for kvantificering var 2,0 × 105 mod 3,5 × 105 ).

Tredje generations bDNA-assays for HIV-1 og HCV

I første- og andengenerations bDNA-assays begrænsede uspecifik hybridisering af oligonukleotidprober til ikke-målsekvenser assayets følsomhed. Den afgørende teknologiske forbedring i tredje generationens bDNA-assay (Quantiplex HIV-1 RNA 3.0-assay, Bayer) var at anvende ikke-naturlige baser, 5′-methyl-2′-deoxyisoguanosin (isoG) og 5′-methyl-2′-isodeoxycytidin (isoC), i syntesen af alle prober i bDNA-systemet, med undtagelse af “capture extenders”, der formidler indfangning af den virale målnukleinsyre til pladens overflade. Da oligonukleotider, der indeholder isoG og isoC, ikke findes i naturen, er uspecifik hybridisering væsentligt reduceret. Sonder, der er modificeret med de ikke-naturlige baser, danner således ikke stabile hybrider med indfangningssonden i fravær af mål-RNA. I den første beskrivelse af tredje generations assay var detektionsgrænsen for HIV-1 i plasmaprøver fra 11 patienter 50 kopier pr. mL, hvilket er en 10-dobbelt forbedring af detektionsgrænsen i forhold til anden generations assay. Under behandling med højaktiv antiretroviral terapi faldt HIV-1-viralbelastningen til under detektionsgrænsen for alle 11 patienter.

VERSANT HIV-1 RNA 3.0-assayet har et dynamisk område på 75 til 5 × 105 HIV RNA-kopier/mL. Version 3.0 er også blevet godkendt til en lavere detektionsgrænse svarende til 50 kopier/mL i flere andre lande. Da matchede prøver blev sammenlignet i andengenerations HIV-1 bDNA-assayet (Quantiplex version 2.0) og Amplicor Monitor 1.0 RT-PCR-assayet, blev der konsekvent opnået lavere antal HIV-1-kopier ved hjælp af bDNA-testen. Der blev imidlertid observeret en tæt kvantitativ korrelation i antallet af HIV-1 RNA-kopier mellem tredjegenerationsassayet (version 3.0) og Amplicor Monitor 1.5 RT-PCR-testen.18 Resultaterne for viral belastning i bDNA-assayet i version 3.0 og i Amplicor RT-PCR-testen var ca. 2 gange højere end i version 2.0-assayet. Kvantitativt ensartede resultater i version 3.0 bDNA-testen og RT-PCR-testen er vigtige i patientplejen på grund af den sandsynlige mulighed for, at der vil blive anvendt forskellige metoder til at teste prøver fra den samme patient i forbindelse med anti-HIV-behandlinger. Nylige data tyder på, at rebaselining for patienter, der er testet med et RT-PCR-assay, måske ikke er nødvendig.

I lighed med HIV-1 version 3.0 bDNA-assayet anvendte tredje generation bDNA-assayet for HCV også isoC- og isoG-substituerede oligonukleotider for at reducere uspecifik hybridisering. Anvendelsen af isoC- og isoG-substituerede oligonukleotider øgede følsomheden af assayet ca. 62 gange. Den nedre detektionsgrænse for HCV RNA 3.0-assayet var 3,2 × 103 kopier/mL sammenlignet med 2 × 105 kopier/mL i HCV RNA 2.0-assayet. Det dynamiske lineære kvantificeringsområde for HCV RNA 3.0-assayet strakte sig fra 3,2 × 103 kopier/mL (615 IU/mL) til 4 × 107 HCV RNA-kopier/mL (7,7 × 106 IU/mL). HCV RNA 3.0-assayet havde en høj specificitet (98,2 %) og var, i lighed med andengenerationsassayet, lige effektivt til kvantificering af HCV RNA på tværs af alle genotyper. Standardafvigelserne mellem og inden for en serie for gentagelsesprøver var henholdsvis 0,2 log10 og 0,14 log10, hvilket indikerer, at tredje generations assayet var meget reproducerbart.

Ud over udryddelse af HCV i serum er et vigtigt mål for anti-HCV-behandlinger at reducere HCV-niveauerne i leveren. Nytteværdien af HCV RNA 3.0-assayet til påvisning og kvantificering af HCV RNA i leverbiopsiprøver blev undersøgt hos 25 patienter, der var co-inficeret med HCV og HIV.20 Reproducerbarheden af tredje generation af HCV bDNA-assayet var ens mellem leverbiopsiprøver og serumprøver. Desuden var påvisning af HCV RNA i leverprøver fra patienter, der var inficeret med genotype 1, 3 og 4, ved hjælp af HCV RNA 3.0-assayet meget specifik og følsom. I denne undersøgelse af 25 patienter korrelerede høje niveauer af intrahepatisk

HCV før behandling med en lav frekvens af respons på anti-HCV-behandling. Intrahepatiske HCV-niveauer før behandling var højest hos patienter, der var inficeret med HCV-genotype 1. Resultaterne af denne undersøgelse viste, at vigtige markører for HCV-sygdomsprogression, HCV-niveauer i leveren og i serum, kan kvantificeres pålideligt ved bDNA-analyse under behandlingen. Metoderne til tredjegenerations bDNA-analyser omfatter prøveforberedelse, hybridisering og signaldetektion forHIV-1 RNA og HCV RNA. Alle 3 s eps udføres i mikrovællerne på System 340-platformen for HCV RNA 3.0-assayet, som ikke kræver et separat ekstraktionstrin. I version 3.0 af HIV-1 RNA-assayet er prøveforberedelsen forskellig fra HCV RNA-metoden og udføres uden for System 340-platformen. I en nylig undersøgelse blev der evalueret en tilpasning af version 3.0 af HIV-1 RNA-metoden, hvor prøvebehandlingen af HIV-1-prøven blev ændret for at muliggøre samtidig testning for HCV og HIV-1 på System 340-platformen. HIV-1-metoden blev ændret ved at udelade den 2-timers inkubation ved 63 °C til viral lysis. I stedet blev HIV-1- og HCV-lysis udført på System 340-platformen. HCV bDNA-testmetoderne var uændrede i det kombinerede assay. Specificiteten og kvantificeringen ved hjælp af den kombinerede bDNA-metode lå inden for specifikationerne for de individuelle HIV-1- og HCV-assays. Simultan testning for HIV-1 og HCV forbedrede arbejdsgangen i det kliniske laboratorium og resulterede i lavere omkostninger. Da påvisning og kvantificering af HIV-1 RNA og HCV RNA er afgørende for diagnosen og for evalueringen af respons på terapi, udgør muligheden for at udføre samtidig testning for begge vira et betydeligt fremskridt inden for molekylær diagnostik.