Validering af antistoffer
Antibody Validation
Det er ikke alle antistoffer, der er gyldige for alle forsøg og betingelser, de skal valideres til den specifikke anvendelse og art. I øjeblikket findes der ingen standardmetoder til “validering af antistoffer”, og dette kan i høj grad påvirke den eksperimentelle reproducerbarhed og pålidelighed. Tidsskrifter og bevillingsorganer har taget skridt til at afhjælpe denne mangel. Mange har nu krav om, at det udtrykkeligt skal angives, hvordan man vil validere et antistof til en specifik anvendelse. Desværre findes der ingen universelt accepterede kriterier for validering af antistoffer. Så det er op til den enkelte forsker at validere hvert enkelt antistof til den påtænkte anvendelse.
Grundlæggende validering
Standardmetoder til validering af antistoffer omfatter Western Blot, ELISA, flowcytometri og IHC. De fleste forskere er trygge ved disse gennemprøvede metoder. Valideringsprocessen kan være tidskrævende, fordi forskeren eller producenten skal validere antistoffet for hver enkelt anvendelse. Denne vanskelighed forværres af, at betingelserne for hvert enkelt assay er forskellige. Et western blot afhænger f.eks. af denaturering af proteiner. Så et western blot-valideret antistof kan fungere fint under denatureringsbetingelser, men kan muligvis ikke genkende antigener i deres native konformation (dvs. ELISA).1 På samme måde kan et antistof, der er valideret for native proteinaffinitet, ikke binde det samme antigen efter denaturering eller fiksering.
De ovennævnte metoder spiller en nødvendig rolle i valideringen af antistoffer. Vi kan dog ikke udelukkende stole på disse metoder, da de ikke repræsenterer de stadigt voksende anvendelser. Tillidsniveauet for de validerede antistoffer kan øges ved at inddrage andre valideringsteknikker.
Gamle teknikker, nye anvendelser
For at afhjælpe manglerne ved den grundlæggende validering af antistoffer samledes en gruppe forskere for nylig for at “foreslå et sæt standardretningslinjer for validering af antistoffer”.2 De foreslår, at forskerne ud over de grundlæggende metoder til validering af antistoffer begynder at læne sig op ad konceptuelle søjler. Disse omfatter genetiske strategier, uafhængige antistofstrategier og tagget proteinekspression.2
-
Genetiske strategier: CRISPR-Cas9 og mere
Genetiske strategier består af teknikker somCRISPR-Cas9, RNAi og siRNA-knockdown, der anvendes sammen med en proteindetektionsassay. Disse metoder påviser enhver uspecifik binding af det pågældende antistof efter at have slået det pågældende gen ud eller ned. Hvis antistoffet er specifikt, bør der ikke påvises noget eller et reduceret signal fra antistoffet i henholdsvis de knock-out- eller down-cellelinjer.
-
Independent Antibody Approach
Anvendelsen af uafhængige antistoffer er en anden metode, der kan påvise uspecifik binding. Ved metoden med uafhængige antistoffer anvendes to forskellige (uafhængige) antistoffer, der binder det samme antigen, men forskellige epitoper. Derfor bør de to antistoffer udvise det samme detektionsmønster og ingen off-target-binding.2 Denne teknik kræver flere prøver til testning for at kontrollere for variabel målproteinekspression, hvilket kan blive dyrt og tidskrævende.2 Desuden er valideringsmetoden afhængig af, at der er flere antistoffer til rådighed, som genkender forskellige epitoper på det samme målprotein. GenScript tilbyder epitopbinding iMonoExpress™ mAb-tjenester, som omfatter “uafhængige antistoffer” for proteinantigener.
-
Tagget proteinekspression
Analyse af detektion af taggede målproteiner kan også give en måde at måle antistoffernes uspecifikke binding på. Ved denne metode modificeres målproteinerne med enten et affinitetsmærke (dvs. FLAG) eller et fluorescerende protein (dvs. GFP). I lighed med metoden med uafhængige antistoffer sammenlignes detektionsmønsteret for det antistof, der skal valideres, derefter med det tag-specifikke antistofs detektionsmønster. Selv om det er ligetil, er et problem ved denne metode at sikre, at de mærkede proteiner udtrykkes i endogene niveauer, fordi “overekspression kan maskere påvisningen af bindingsbegivenheder uden for målet”.2
Rekombinante antistoffer som alternativ til monoklonale antistoffer?
En nylig opfordring til handling vedrørende validering af antistoffer foreslog, at forskere kun anvender rekombinante antistoffer i stedet for polyklonale eller endog monoklonale antistoffer. Monoklonale antistoffer fremstilles ved hjælp af hybridomcellelinjer. Desværre kan hybridomcellelinjer dø, miste deres antistofkodende gener eller ikke vokse, når de tages ud af frossen opbevaring.3 Desuden kan hybridomproducerede monoklonale antistoffer binde til mere end ét mål. Disse problemer kan derfor løses ved at bestemme sekvensen af det antistof, der er kodet af hybridomaet, og ved at fremstille antistoffet rekombinant. På grund af den definerede sekvens kan rekombinante antistoffer også give endnu et lag af validering i forhold til at anvende ovennævnte teknikker alene.3
Disse yderligere valideringsmetoder skal “give bevis for, at et antistof binder sit mål, og i de fleste tilfælde bør de også gøre det muligt at evaluere potentiel krydsreaktivitet under de testede betingelser”.2 Det vil dog sandsynligvis være nødvendigt at kombinere gamle og nye strategier for at validere et antistof korrekt.
Valg af den rette metode til validering af antistoffer
Med alle disse spørgsmål omkring antistoffer, hvordan vælger man så den rette metode?
Først skal man beslutte, i hvilket assay man vil bruge antistoffet. CRISPR-Cas9-metoden indebærer f.eks. ikke nogen modifikation af målproteinet og validerer, at antistoffet ikke har krydsreaktivitet med andre proteiner. Så du kan bruge denne teknik til at validere antistoffer til en lang række assays, herunder Western Blot, IHC, immunocytokemi (ICC), flowcytometri, ELISA, immunudfældning (IP), chromatinimmunudfældning (ChIP) og proteinassays i omvendt fase.2 På grund af vanskelighederne med at udtrykke et modificeret protein foreslås validering af et antistof ved hjælp af ekspression af mærket protein imidlertid kun for western blots, IHC, ICC og flowcytometri.
For det andet skal forskeren være opmærksom på prøvebegrænsningerne ved sådanne valideringsmetoder. Som eksempel kan både CRISPR-Cas9/KO- og mærkede proteinekspressionsteknikker ikke anvendes til validering af antistoffer i humane vævsprøver og kropsvæsker, såsom plasma og serum.2 Det skyldes, at man ikke kan udføre genetisk manipulation i mennesker, i modsætning til i cellelinjer.
Endeligt skal forskeren, uanset hvilket antistof og hvilken valideringsmetode antistofleverandøren anvender, udføre mindst én valideringsstrategi i deres særlige anvendelse eller prøvesammenhæng.2
Validering af hvert antistof til din specifikke anvendelse og art er nøglen til at opnå reproducerbare og pålidelige resultater. Oplysningerne vil være med til at vejlede dig i din beslutning om, hvilke metoder der er hensigtsmæssige at anvende i dit laboratorium. For yderligere hjælp med validering af antistoffer eller andre anvendelser, besøgGenScript Antibody Technical Resources.
Adapteret fra indhold skabt af BitesizeBio på vegne af GenScript.