A More Accurate Approach to Amyloid Detection and Subtyping: Combining in situ Congo Red Staining and Immunohistochemistry

Abstract

Amyloidose ist das Ergebnis verschiedener, unterschiedlich zugänglicher Krankheiten. Die Subtypisierung der Amyloidablagerungen ist wichtig, um die zugrundeliegende Erkrankung zu erkennen und schließlich richtig zu behandeln. Neben der klassischen Färbung mit Kongorot sind weitere Verfahren wie die immunhistochemische Färbung zur Klassifizierung erforderlich. Hier stellen wir einen genaueren Ansatz vor, bei dem eine Kongorot-/immunhistochemische Doppelfärbung verwendet wird, die in der Routinediagnostik leicht anwendbar ist. Es waren Modifikationen der Kongorot-Färbetechnik und der immunhistochemischen Verfahren erforderlich, um beide Färbeverfahren auf einem Objektträger zu kombinieren. Die Auswertung erfolgte mit konventioneller Licht- und Fluoreszenzmikroskopie. Durch Verkürzung der Färbezeit für Kongorot auf 10 s und durch Modifikation hinsichtlich der Blockierung endogener Peroxidase konnten genaue Ergebnisse für die Auswertung der Kongorot/Immunhistochemie-Doppelfärbung mit einem Fluoreszenzmikroskop erzielt werden. Schnitte von 2 μm anstelle von 4 μm Dicke waren für die Auswertung besser geeignet, da sie die Spezifität der Färbung erhöhten. Die Kombination von Kongorot und Immunhistochemie als In-situ-Doppelfärbung auf einem Objektträger ist ein praktikabler Ansatz für die Diagnose von Amyloidose. Sie ermöglicht die Fokussierung auf die fluoreszierenden Kongorot-positiven Bereiche bei der Auswertung der Immunhistochemie und vermeidet so die Ausgrenzung falsch-positiver Ergebnisse. Zusätzlich erhöht es das Signal-Rausch-Verhältnis der immunhistochemisch gefärbten Schnitte in der konventionellen Mikroskopie.

© 2016 S. Karger AG, Basel

Einführung

Amyloidose ist die morphologische Beschreibung der Ablagerung von falsch gefalteten Proteinen, die in vielen verschiedenen Gewebetypen vorkommen können. Die amyloidbildenden Proteine stammen aus einer Vielzahl von Quellen, von Tumoren wie Plasmazellneoplasmen oder medullären Schilddrüsenkarzinomen bis hin zu chronischen Infektionen, oder sie treten als Folge des Alterns auf. In seltenen Fällen ist die Amyloidose auf genetisch vererbte Proteinfehlfaltungsstörungen zurückzuführen. Die klinische Bedeutung der Amyloidose reicht von Zufallsfunden bei Autopsien bis hin zu lebensbedrohlichen Erkrankungen. Bei der Untersuchung von Gewebeproben ist es für Pathologen wichtig, die Wahrscheinlichkeit von Amyloidablagerungen im Auge zu behalten, da dies der erste Hinweis auf eine noch unbekannte schwere Grunderkrankung sein könnte. Obwohl es vielversprechende Ergebnisse bezüglich Therapien gibt, die auf die Amyloidablagerungen selbst abzielen, zielen Behandlungsansätze bei Amyloidose immer noch hauptsächlich auf die zugrundeliegende Erkrankung ab, und diese wiederum kann und muss in den meisten Fällen auf der Grundlage der Amyloid-Subtypisierung bestimmt werden.

Die klassische histochemische Färbung für Amyloid ist Kongorot, wie sie von Bennhold 1922 eingeführt wurde; die typische „apfelgrüne“ Doppelbrechung unter Verwendung der Polarisation wurde erstmals 1927 beschrieben. Um die Empfindlichkeit und Spezifität der Kongorot-Färbung zu erhöhen, wurden verschiedene Methoden angewandt, darunter die Auswertung von mit Kongorot gefärbten Schnitten mit Fluoreszenzlicht aufgrund der bekannten Fluoreszenzeigenschaften von Kongorot. Erst kürzlich wurden Ansätze mit einer digital verstärkten Hämatoxylin-Eosin-Polarisationstechnik für den Amyloid-Nachweis vorgeschlagen, die besonders hilfreich bei der Identifizierung von Amyloid in Fällen mit wenig verfügbarem Gewebe sind.

Der Goldstandard für die Subtypisierung von Amyloid ist die Immunhistochemie, einschließlich mehrerer gut etablierter Protokolle; es gibt jedoch einige Mängel, insbesondere in Anbetracht der geringeren Spezifität von Antikörpern gegen die amyloidogene leichte Kette lambda. Ein neuer Ansatz zur Subtypisierung besonders seltener Amyloidose-Varianten ist die Massenspektrometrie; leider wurde diese vielversprechende Methode aufgrund von Kosten- und Verfügbarkeitsproblemen bisher nicht in großem Umfang eingesetzt, wobei ein zusätzlicher Mangel darin besteht, dass sie in Fällen mit wenig verfügbarem Gewebe oder einer begrenzten Menge an abgelagertem Amyloid offensichtlich nur eingeschränkt anwendbar ist. Eine weitere neuere Errungenschaft ist die Verwendung der Immun-Elektronenmikroskopie von Bauchfett-Aspiraten zur Subtypisierung von Amyloid-Ablagerungen; dies ist jedoch eine anspruchsvolle Methode.

Einige frühere Studien haben sich auf die Kombination von Fluoreszenz und Immunhistochemie konzentriert. Hier präsentieren wir weitere Beweise für die Durchführbarkeit eines solchen Ansatzes und berichten über ein Protokoll, das sich leicht in die Routine übertragen lässt und es uns ermöglichte, die Subtypisierung von Amyloid in formalinfixierten und in Paraffin eingebetteten Geweben genau zu bestimmen. Die Kongorot/Immunhistochemie-Doppelfärbung ermöglicht die Fokussierung auf die Kongorot-positiven Bereiche bei der Auswertung der Immunhistochemie und erhöht das Signal-Rausch-Verhältnis der immunhistochemisch gefärbten Schnitte bei der konventionellen lichtmikroskopischen Auswertung, wodurch sowohl die Spezifität und Sensitivität des Verfahrens verbessert als auch die für die Diagnostik benötigte Gewebemenge reduziert wird.

Materialien und Methoden

Auswahl der Fälle

Zur Etablierung der neuen Technik wurden Proben mit nachgewiesener Amyloidose-Diagnose aus unserem Archiv verwendet. Sie sind in Tabelle 1 aufgeführt, einschließlich der Schritte, für die das jeweilige Gewebe verwendet wurde.

Kongorot-Färbungsansätze

Die Kongorot-Färbung wurde zunächst nach dem an unserem Institut etablierten Protokoll durchgeführt: Formalin-fixiertes und in Paraffin eingebettetes Gewebe wird in 6-μm-dicke Schnitte geschnitten, entparaffiniert und für 30 min mit Kongorot gefärbt – 2.5 g Kongorot (Merck Millipore, Darmstadt, Deutschland) und 1 g Kaliumhydroxid (Merck Millipore) werden in 500 ml 80 %igem Ethanol aufgelöst; anschließend werden die Schnitte mit Leitungswasser gespült, bevor sie 4 Minuten lang mit Hämatoxylin (Merck Millipore) gegengefärbt werden. In einem nächsten Schritt werden die Schnitte in 0,5%iger HCl/Ethanol-Lösung differenziert und erneut 10 min mit Leitungswasser gespült, bevor sie dehydriert und montiert werden.

Für unsere Studie wurde das Protokoll hinsichtlich der Kongorot-Färbezeit modifiziert, um zu sehen, welche Auswirkungen kürzere Färbezeiten auf die anschließende immunhistochemische Färbung haben könnten. Es wurden auch Schnitte mit einer Dicke von 2 und 4 μm getestet.

Immunhistochemische Färbung und Blockierung der endogenen Peroxidase

Die immunhistochemischen Färbebedingungen für die verschiedenen Amyloid-Subtypen sind in Tabelle 2 aufgeführt. Wie vom Hersteller vorgeschlagen, wurden zwei verschiedene Klone für den Nachweis der amyloidogenen leichten Ketten kappa bzw. lambda verwendet. Die Immunhistochemie wurde nach dem Kongorot-Färbeverfahren durchgeführt. Kurz gesagt wurden entparaffinierte und mit endogener Peroxidase blockierte Objektträger (siehe unten) 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in normalem Pferdeserum (für die AA-Amyloidfärbung) oder normalem Ziegenserum (für alle anderen Färbungen)/Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) (900 μl Serum/60 ml TBS) inkubiert (beide Seren von Vector Lab., Burlingame, Calif, USA) und dann über Nacht mit dem primären Antikörper bei 4°C inkubiert, gespült und mit biotinylierter Anti-Maus-IgG (für die Amyloid-AA-Färbung) oder biotinylierter Anti-Kaninchen-IgG (für alle anderen Färbeverfahren) Lösung (300 μl IgG/900 μl normales Pferde- oder Ziegenserum/60 ml TBS; beide IgG von Vector Lab.) für 30 min bei Raumtemperatur; anschließend wurden sie gespült und mit einem Avidin-Biotin-Peroxidase-Kit (Vectastain von Vector Lab.) für 30 min inkubiert und mit gebrauchsfertigem 3-Amino-9-Ethylcarbazol (AEC; von Dako, Glostrup, Dänemark) als Chromogen (10-20 min unter sofortiger optischer Kontrolle) und Meyers Hämatoxylin (von Medite, Dietikon, Schweiz) sichtbar gemacht. AEC wurde bevorzugt, da frühere Experimente ein besseres Signal-Rausch-Verhältnis für die AEC-Darstellung im Vergleich zur Diaminobenzidin-Darstellung zeigten. Da AEC wasser- und alkohollöslich ist, wurden die Objektträger vor dem Eindecken für 30 Minuten mit Medi-Mount (von Medite, Burgdorf, Deutschland) abgedeckt.

Da die übliche Behandlung zur Blockierung der endogenen Peroxidase von Geweben (3%ige H2O2-Lösung in 70%igem Ethanol) nach Abschluss der Kongorot-Färbung zum Verlust der Kongophilie führte, wurden weitere Methoden zur Blockierung der endogenen Peroxidase getestet, wie z. B.: Verschieben dieses Schrittes vor der Kongorotfärbung und Ersetzen von 70%igem Ethanol durch destilliertes Wasser.

Auswertung

Die doppelt gefärbten Kongorot/Immunhistochemie-Schnitte wurden zunächst mit einem konventionellen Lichtmikroskop ausgewertet, um abzuschätzen, ob das jeweilige immunhistochemische Chromogenprodukt im Vergleich zur diagnostischen Routinefärbung (ohne Kongorot-Vorfärbung) erwartungsgemäß, schlechter oder besser visualisiert wurde. Anschließend wurde ein Fluoreszenzmikroskop mit einem Rhodaminfilter (Zeiss Axioskop 40; Zeiss, Göttingen, Deutschland) verwendet, um die Fluoreszenz des Kongorot-Farbstoffs zu bewerten. Bereiche, die eine spezifisch intensive Fluoreszenz aufwiesen, wurden zusätzlich lichtmikroskopisch untersucht, um festzustellen, ob in diesen Bereichen auch Amyloidablagerungen durch Immunhistochemie nachgewiesen werden konnten.

Ergebnisse

Schritt 1: Modifikationen des Kongorot-Färbeprotokolls

Es wurden verschiedene Färbezeiten für den Kongorot-Farbstoff getestet. Dies war notwendig, da die Fähigkeit der Antikörper, Antigene zu binden, durch das Kongorot-Färbeverfahren verringert wurde und Kongorot in voller Intensität eine gleichzeitige Auswertung erschwerte, da für die Immunhistochemie ein rotes Chromogen (AEC) mit einer ähnlichen Farbe wie Kongorot verwendet wurde. Bei Anwendung der ursprünglichen Färbezeit von 30 Minuten konnte die Doppelbrechung für Amyloidablagerungen mit einem Polarisationsfilter in der konventionellen Lichtmikroskopie nachgewiesen werden. Bei einer Färbedauer von nur 5, 10 oder 20 s für Kongorot konnten bei Verwendung des Rhodaminfilters eines Fluoreszenzmikroskops immer positive Signale nachgewiesen werden, während bei der konventionellen Mikroskopie nur gelegentlich Kongophilie und Doppelbrechung mit dem Polarisationsfilter zu sehen waren (Abb. 1). Für die weitere Analyse wurde die Kongorot-Färbezeit vorzugsweise auf 10 s reduziert, um eine Überfärbung zu vermeiden; 10 s wurde aus Gründen der Praktikabilität (leichter einzuhalten im Vergleich zu 5 s) im Nasslabor gewählt.

Schritt 2: Modifikationen der immunhistochemischen Protokolle für die Kombination von Kongorot- und immunhistochemischer Färbung auf einem Objektträger

In einem ersten Schritt wurde die immunhistochemische Färbung an separaten Schnitten durchgeführt, um die Antigenität der für diese Studie verwendeten Gewebe zu bestätigen, die unter Verwendung der etablierten Routineprotokolle zufriedenstellende Färbeergebnisse zeigten (siehe Tabelle 2).

Bei der Kombination der Kongorot-Färbung (Kongorot-Färbezeit von 10 s) mit der immunhistochemischen Färbung derselben Schnitte wurde festgestellt, dass die Kongophilie nach Abschluss der immunhistochemischen Verfahren unter Verwendung der üblichen Behandlung zur Blockierung der endogenen Peroxidase von Geweben (3%ige H2O2-Lösung in 70%igem Ethanol) verschwand, da der Kongorot-Farbstoff ausgewaschen wurde. Daher wurde in einem dritten Schritt die Behandlung zur Blockierung der endogenen Peroxidase geändert. Die Blockierung der endogenen Peroxidase mit der herkömmlichen Methode, jedoch vor der Kongorot-Färbung, sowie der Ersatz des 70%igen Ethanols durch destilliertes Wasser bei der Blockierung der endogenen Peroxidase nach der Kongorot-Färbung führten zu zufriedenstellenden Ergebnissen, sowohl bei der Auswertung der Kongorot-Färbung als auch bei der immunhistochemischen Färbung. Um den üblichen Arbeitsablauf im Nasslabor so weit wie möglich beizubehalten, wurde die Methode, bei der Ethanol durch destilliertes Wasser ersetzt wird, weiter angewendet. Der Versuch, die Blockade der endogenen Peroxidase auszulassen, führte zu einer mäßigen Verringerung des Signal-Rausch-Verhältnisses bei der AEC-Visualisierung (unter der Annahme, dass die nicht blockierten endogenen Enzyme AEC verwerten und zum einen eine leichte Hintergrundfärbung verursachen und zum anderen dem ABC-Peroxidase-Komplex das Chromogen für eine ordnungsgemäße Visualisierung entziehen) und wurde daher nicht weiter genutzt. Die Qualität der immunhistochemischen Färbung nach der Vorfärbung mit Kongorot war die gleiche wie die der immunhistochemischen Färbung ohne vorherige Kongorotfärbung; daher kamen wir zu dem Schluss, dass die Durchführung der Immunhistochemie auf Schnitten, die 10 s lang mit Kongorot vorgefärbt wurden, nicht zu einem Verlust der Antigenität oder zu unspezifischen Färbeergebnissen führt.

Schritt 3: Modifikationen der Schnittdicken

Schließlich untersuchten wir die Rolle verschiedener Schnittdicken (2 und 4 μm). Im Allgemeinen war die Spezifität und Auswertbarkeit der immunhistochemischen Färbung (Signal-Rausch-Verhältnis) auf den dünneren Schnitten besser; außerdem gab es weniger Artefakte hinsichtlich der Ablösung von Gewebe von den Objektträgern während der Färbeverfahren. Alle Fälle zeigten die gleichen Ergebnisse wie bei der ersten diagnostischen Subtypisierung von Amyloidablagerungen.

Beispiele für die Implementierung des beschriebenen Ansatzes in die Routinediagnostik

Die Abbildungen 2 und 3 zeigen zwei Routinefälle, bei denen mit dem in dieser Studie vorgeschlagenen neuen Algorithmus eine Amyloid-Subtypisierung erreicht werden konnte; bei alleiniger Anwendung der konventionellen Technik wurden keine interpretierbaren Ergebnisse erzielt.

Diskussion

Hier wird ein kombiniertes Kongorot/Immunhistochemie-Doppelfärbeverfahren vorgestellt und validiert, das es ermöglicht, sich bei der Auswertung der Immunhistochemie auf die Kongorot-positiven Bereiche zu konzentrieren und damit die Spezifität der in situ-basierten Amyloid-Subtypisierung zu verbessern. Es hilft auch, Gewebe zu sparen, was ein Problem ist, da das Biopsiematerial aufgrund der veränderten diagnostischen Ansätze mit Feinnadelkernen und Biopsieformeln immer begrenzter wird.

Im Gegensatz zu anderen vorgeschlagenen neuen Bewertungstechniken, die sich auf eine anspruchsvolle digitalisierte Bildauswertung konzentrieren, kann unser Ansatz leicht in die Routinediagnostik integriert werden. Voraussetzungen sind lediglich eine modifizierte etablierte Kongorot-Färbung, eine vorhandene Amyloid-Immunhistochemie sowie ein Fluoreszenzmikroskop mit Rhodaminfilter. Idealerweise sollten Mikroskope verwendet werden, die sowohl für die Fluoreszenz- als auch für die konventionelle Lichtmikroskopie ausgerüstet sind, da dies den Nachweis der Amyloidablagerungen in denselben (fluoreszierenden) Bereichen, die bei der Auswertung der Immunhistochemie von Interesse sind, durch einen einfachen Wechsel der Lichtquelle und des Filters vereinfacht. Es könnten jedoch auch zwei verschiedene Mikroskope verwendet werden, wobei in schwierigen Fällen zur leichteren Auswertung ein Foto der jeweiligen Bereiche in Fluoreszenz- und Lichtmikroskopie gemacht werden könnte.

In Übereinstimmung mit früheren Studien konnten wir zeigen, dass Kongorot die Immunhistochemie nicht stört oder beeinträchtigt. Darüber hinaus konnten wir im Vergleich zu den in den meisten bisherigen Studien verwendeten Schnittdicken von 4-6 μm zeigen, dass die Verwendung dünnerer Schnitte von 2 μm, die für die Immunhistochemie vorteilhaft sind (besseres Signal-Rausch-Verhältnis, weniger Ablösungsartefakte), auch zu zufriedenstellenden Ergebnissen hinsichtlich der Kongorot-Färbung führen können, wenn sie mit einem Fluoreszenzmikroskop ausgelesen werden.

In jüngster Zeit wurden mehrere Arbeiten veröffentlicht, in denen die Verwendung der Fluoreszenz zur Beurteilung von Amyloidablagerungen propagiert und ihre Überlegenheit gegenüber der polarisierten Lichtmikroskopie nachgewiesen wurde, da sie sowohl spezifischer als auch empfindlicher ist. In dieser Studie haben wir diesen Ansatz in mehrfacher Hinsicht verfeinert und optimiert, indem wir an einem angepassten Protokoll hinsichtlich der Färbezeit, der Färbeverfahren und der Schnittdicke gearbeitet haben. Diese Änderungen ermöglichten schließlich die Durchführung einer In-situ-Doppelfärbung zum empfindlichen und spezifischen Nachweis von Amyloidablagerungen sowie zur Subtypisierung dieser Ablagerungen, was für die Unterscheidung der zugrundeliegenden Erkrankung, die zu Amyloidablagerungen führt, von entscheidender Bedeutung ist. Unser Ansatz der Doppelfärbung ermöglicht nicht nur den empfindlichen Nachweis von Amyloid durch Fluoreszenz und gleichzeitig die spezifische Kategorisierung genau dieser Ablagerungen, sondern auch die Einsparung von Material durch die Vermeidung von Serienschnitten, bei denen die manchmal winzigen Amyloidablagerungen bereits weggeschnitten wurden. Seit der Etablierung dieser Doppelfärbung haben wir diesen Ansatz bereits in mehreren Fällen angewendet, in denen eine endgültige Diagnose mit anderen Methoden nicht erreicht werden konnte. Die Abbildungen 2 und 3 illustrieren zwei dieser Fälle.

Es könnte jedoch noch Raum für weitere Perfektionierung geben. Da immunalkalische Phosphatase-basierte Nachweissysteme, die keine Blockierung der endogenen Peroxidase benötigen, derzeit nicht in unserem immunhistochemischen Arbeitsablauf verwendet werden, könnte der Ersatz von Immunoperoxidase-basierten Nachweissystemen durch erstere die Ergebnisse weiter verbessern und den Arbeitsablauf im Labor verschlanken.

Abschließend stellen wir einen optimierten und verfeinerten Ansatz für Kongorot/Immunhistochemie-Doppelfärbungen vor. Dieser Ansatz ist vorteilhaft in Bezug auf Spezifität, Kosten und Menge des benötigten Gewebes. Die Anforderungen sind minimal und sollten eine breite Anwendung ermöglichen.

Danksagung

Thomas Menter wird von der Nuovo-Soldati Krebsforschungsstiftung, Vaduz, Liechtenstein, unterstützt.

Statement of Ethics

Die Studie umfasst nur menschliches Archivmaterial aus dem Institut für Pathologie Basel und wurde von der Ethikkommission der Nordwest- und Zentralschweiz genehmigt (EKNZ 2014-252). Es waren keine Tiere beteiligt.

Disclosure Statement

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

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