ABTS

17.4 Phenole

Die Oxidation des klassischen Lac-Substrats ABTS durch die Laccase von Tetracystis aeria ist in Chlorophyceenalgen weit verbreitet. Zum Beispiel scheiden Arten der Moewusinia, einschließlich Chlamydomonas moewusii und T. aeria, vermeintlich „echte“ Lacs aus. Phenolische Substrate werden von diesen Enzymen optimal bei neutralem bis alkalischem pH-Wert oxidiert. Die Laccase von Tetracystis wandelt andere Verbindungen wie Bisphenol A, 17α-Ethinylestradiol, Nonylphenol und Triclosan in Gegenwart von ABTS als Redox-Mediator effizient um, während Anthracen, Veratrylalkohol und Adlerol unverändert bleiben. Mögliche, natürliche Funktionen der Enzyme, wie die Synthese komplexer Polymere oder Entgiftungsprozesse, könnten das Überleben der Algen in ungünstigen Umgebungen unterstützen. In kontaminierten Oberflächengewässern könnten Lac-produzierende Grünalgen zum Abbau von phenolischen Schadstoffen in der Umwelt beitragen.

Putatives Lac (CotA) aus Bacillus pumilus MK001, kloniert und exprimiert in E. coli geklont und exprimiert wurde, erwies sich als thermostabil mit einer Halbwertszeit von 60 Minuten bei 80°C und zeigt potenzielle Bindungsaffinitäten zu Ferulasäure, Kaffeesäure und Vanillin.

Phenole sind bekannte Inhibitoren für Cellulase und fermentative Mikroorganismen in Bioraffinerieprozessen. Durch die Zugabe von Lac werden die phenolischen Verbindungen entfernt, wodurch die Lag-Phase des fermentativen Mikroorganismus verkürzt wird. Die Anwendung von Lac vermindert jedoch die Glukosefreisetzung während der enzymatischen Hydrolyse. Der Ligninanteil und die Zusammensetzung der Phenole spielen eine Schlüsselrolle bei der Hemmung der Cellulase, wenn die enzymatische Hydrolyse mit der Lac-Entgiftung kombiniert wird.

Eine interessante Anwendung in der Umweltbiotechnologie ist die Immobilisierung von Lac, um phenolische Verunreinigungen durch Oxidation zu beseitigen. Nanopartikel aus pyrogener Kieselsäure haben ein interessantes Potenzial als Trägermaterial für die Lac-Immobilisierung mittels sorptionsgestützter Immobilisierung im Hinblick auf Anwendungen wie die Beseitigung von Mikroverunreinigungen in wässrigen Phasen. Die Immobilisierung von Lac aus einer Leviathan-Gattung, Coriolopsis polygonal, Cerrena unicolor, P. ostreatus und T. versicolor auf Nanopartikeln aus pyrogener Kieselsäure, einzeln oder in Kombination, führt zu einer erhöhten Aktivität in einem pH-Bereich zwischen 3 und 7. Die verschiedenen Lacs unterscheiden sich in ihren pH-Optima und ihrer Substrataffinität. Die Ausnutzung ihrer Unterschiede ermöglichte die Formulierung eines maßgeschneiderten Nanobiokatalysators, der ein breiteres Substratspektrum oxidieren kann als die gelösten oder separat immobilisierten Enzyme. Der Nanobiokatalysator hat das Potenzial zur biochemischen Oxidation bei der Beseitigung mehrerer Zielschadstoffe. Es wurde bestätigt, dass die durch Lac-Immobilisierung auf Siliziumdioxid-Nanopartikeln erhaltenen nicht-vokalen Nanobiokatalysatoren ein breites Substratspektrum für den Abbau von widerspenstigen Schadstoffen wie phenolischen EDCs (Bisphenol A) aufweisen.Dies unterstreicht das Potenzial von pyrogenen Siliziumdioxid-Nanopartikeln/Lacase-Kompositen für die fortgeschrittene biologische Abwasserbehandlung.

Lacs sind in der Lage, die Ein-Elektronen-Oxidation von phenolischen Verbindungen zu radikalischen Zwischenprodukten zu katalysieren, die sich anschließend über kovalente Bindungen miteinander verbinden können. Es wird angenommen, dass diese Reaktionen eine wichtige Rolle im Humifizierungsprozess und bei der Umwandlung von Schadstoffen mit Phenolfunktionen in der Umwelt spielen. Durch Integration von Metall-HA-Bindungsgleichgewichten und kinetischen Gleichungen wurde ein Reaktionsmodell entwickelt, das die Umwandlungsrate von Triclosan in Gegenwart von HA und zweiwertigen Metallionen wie Ca2+, Mg2+, Cd2+, Co2+, Mn2+, Ba2+ und Zn2+ vorhersagt.

Hydroxylierte polybromierte Diphenylether (OH-PBDEs) wurden in der marinen Biosphäre häufig als neu auftretende organische Schadstoffe gefunden. Die Produktion von OH-PBDEs ist wahrscheinlich das Ergebnis der Kopplung von Bromphenoxy-Radikalen, die bei der Lac-katalysierten Oxidation von 2,4-DBP oder 2,4,6-TBP entstehen. Die Umwandlung von Bromphenolen durch Lac ist pH-abhängig und wird auch durch die Enzymaktivität beeinflusst. In Anbetracht der Häufigkeit von 2,4-DBP und 2,4,6-TBP und der phylogenetischen Verteilung von Lac in der Umwelt könnte die Lac-katalysierte Umwandlung von Bromphenolen ein wichtiger Weg für die natürliche Biosynthese von OH-PBDEs sein.

Phanerochaete chrysosporium gehört zu einer Gruppe von ligninabbauenden Pilzen, die verschiedene oxidoreduktive Enzyme absondern, darunter Ligninperoxidase (LiP) und Manganperoxidase (MnP). Die Produktion von Lacs in diesem Pilz ist jedoch nicht vollständig nachgewiesen worden und bleibt umstritten. Die Koexpression des LacIIIb-Gens aus T. versicolor und des vpl2-Gens aus Pleurotus eryngii sowie der endogenen Gene mnp1 und lipH8 verbesserte die Koexpression von Peroxidasen und Laccasen um das bis zu Fünffache im Vergleich zu Wildtyp-Arten. Die transformierten Stämme haben ein breites Spektrum in der phenolischen/nicht phenolischen Biotransformation und einen hohen Prozentsatz in der synthetischen Farbstoffentfärbung im Vergleich zum elterlichen Stamm und sind eine einfache und effiziente Koexpression von Lacs und Peroxidasen in geeigneten Basidiomycetenarten.

In jüngster Zeit wurde Lac in der Nanobiotechnologie eingesetzt, die ein wachsendes Forschungsgebiet ist, und katalysiert Elektronentransferreaktionen ohne zusätzliche Cofaktoren.

Kohlenstoffnanopartikel sind vielversprechende Kandidaten für die Immobilisierung von Enzymen. Im Vergleich zu freiem Lac haben die immobilisierten Enzyme deutlich geringere Reaktionsgeschwindigkeiten. Die durch die Aggregation von Kohlenstoffnanopartikeln verursachte Diffusionsbeschränkung kann nicht ignoriert werden, da sie zu längeren Reaktionszeiten, geringerer Effizienz und hohen wirtschaftlichen Kosten führen kann. Darüber hinaus wird dieses Problem noch verschärft, wenn geringe Konzentrationen von Umweltschadstoffen vorhanden sind.

Bisphenol A (BPA) ist eine endokrin wirksame Chemikalie, die aufgrund ihrer breiten industriellen Verwendung in der Umwelt allgegenwärtig ist. Extrazelluläres Lac des weltweit am häufigsten angebauten Pilzes (Weißfäulepilz, P. ostreatus) baut BPA effizient ab. Die Exposition gegenüber BPA hat keine schädlichen Auswirkungen auf diesen essbaren Pilz.

Die Entfernung von BPA durch Lac in einem kontinuierlichen enzymatischen Membranreaktor, der in synthetischen und realen biologisch behandelten Abwässern in einer Reaktorkonfiguration auf der Grundlage eines Rührkesselreaktors, der mit einer Keramikmembran gekoppelt ist, bewertet wurde, zeigte eine fast vollständige Entfernung von BPA. Polymerisation und Abbau sind wahrscheinliche Mechanismen der BPA-Umwandlung durch Lac.

Organismen aus dem Stamm der Basidiomycota haben ein enormes Bioremediationspotenzial durch ihre Phenoloxidasen beim Abbau von Phenolen. Lac und Tyrosinase sind hauptsächlich in T. versicolor bzw. Agaricus bisporus zu finden. Es sind neue vielversprechende Wildtyp-Produzenten von Enzymen aufgetaucht, und es wurde auch eine Reihe von rekombinanten Stämmen konstruiert, die hauptsächlich auf Hefen oder Aspergillus-Stämmen als Wirte basieren. Die Konstrukte ermöglichen Anwendungen für den Abbau von Phenolen, Polyphenolen, Kresolen, Alkylphenolen, Naphtholen, Bisphenolen und halogenierten (Bis)phenolen. Biologische und physikalisch-chemische Methoden könnten kombiniert werden, um die Verfahren für den industriellen Einsatz tauglich zu machen.

Pflanzenperoxidasen haben ein großes Potenzial für die Dekontamination von phenolverschmutztem Abwasser. Der großtechnische Einsatz dieser Enzyme zur Phenolentgiftung erfordert billiges, reichlich vorhandenes und leicht zugängliches peroxidasehaltiges Material. Kartoffelpülpe, ein Abfallprodukt der Stärkeindustrie, enthält große Mengen aktiver Peroxidasen, und die Enzyme der Kartoffelpülpe behalten ihre Aktivität bei einem pH-Wert von 4-8 und sind über einen weiten Temperaturbereich stabil. Die Phenol-Entfernungseffizienz von Kartoffelpülpe liegt bei über 95 %.

Immobilisierte Lac auf nanoporösen Siliziumdioxidkügelchen bauen in kurzer Zeit (12 Stunden) mehr als 90 % des 2,4-Dinitrophenols ab. Der Immobilisierungsprozess verbessert die Aktivität und Nachhaltigkeit von Lac beim Abbau des Schadstoffs. Temperaturen über 50°C verringern die Enzymaktivität auf etwa 60 %. Der pH-Wert und die Mediatorenkonzentration konnten die Enzymaktivität jedoch nicht beeinflussen. Die Abbaukinetik entspricht einer Michaelis-Menten-Gleichung.

Wässrige Exsudate von Weidelgras (Lolium perenne) können BPA sowohl in Abwesenheit als auch in Anwesenheit von natürlichem organischem Material (NOM) abbauen. In Exsudaten mit NOM-Zusatz ist der Abbauprozess länger als ohne NOM. Die Peroxidase- und Lac-Aktivitäten in den Exsudaten deuten auf eine signifikante Beteiligung dieser Enzyme am BPA-Abbau hin.

Organofluorverbindungen sind zu wichtigen Bausteinen für ein breites Spektrum an fortschrittlichen Materialien, Polymeren, Agrochemikalien und Arzneimitteln geworden. Das Konzept für die Einführung der Trifluormethylgruppe in ungeschützte Phenole mit Hilfe eines Biokatalysators (Lac), tBuOOH und entweder dem Langlois-Reagenz oder dem Zinksulfinat von Baran wurde realisiert. Die Methode beruht auf der Rekombination zweier Radikalspezies, nämlich des direkt von Lac erzeugten Phenolradikal-Kations und des CF3-Radikals. Die Lac-katalysierte Trifluormethylierung verläuft unter milden Bedingungen und baut trifluormethylsubstituierte Phenole ab, die mit klassischen Methoden nicht zugänglich waren.

Der Lac-produzierende Süßwasser-Ascomycete Phoma sp. Stamm UHH 5-1-03 hat Potenzial für die praktische Entfernung von Mikroverunreinigungen. Bisphenol A (BPA), Carbamazepin (CBZ), 17α-Ethinylestradiol (EE2), Diclofenac (DF), Sulfamethoxazol (SMX), technisches Nonylphenol (t-NP) und Triclosan (TCS) sind Substrate mit folgender Rangfolge: EE2≫BPA>TCS>t-NP>DF>SMX>CBZ. Die erhaltenen Metaboliten weisen auf Hydroxylierungs-, Cyclisierungs- und Decarboxylierungsreaktionen sowie auf die für Lac-Reaktionen typische oxidative Kopplung hin. Die Beobachtungen deuten stark darauf hin, dass der extrazelluläre Lac von Phoma sp. weitgehend zur Biotransformation von Pilzen beiträgt.

Verstärkte Aufmerksamkeit wurde der Nanobiokatalyse geschenkt. Lac, das reversibel auf Cu(ΙΙ)- und Mn(ΙΙ)-chelatierten magnetischen Mikrokugeln immobilisiert wurde, konnte erfolgreich BPA aus Wasser entfernen. Im Vergleich zu freiem Lac ist die Wärme- und Lagerstabilität von immobilisiertem Lac deutlich verbessert. Unter optimalen Bedingungen wurden mehr als 85 % des BPA entfernt.

Die Verwendung von Enzymen in Lösung zur Wasseraufbereitung hat jedoch die Nachteile der Nicht-Wiederverwendbarkeit, der kurzen Lebensdauer der Enzyme und der hohen Kosten für den einmaligen Gebrauch. Chen et al. entwickelten eine neue Art von Biokatalysator, indem sie Pilz-Lac auf der Oberfläche von Hefezellen mit Techniken der synthetischen Biologie immobilisierten. Der Biokatalysator wird als Surface Display Lac (SDL) bezeichnet und kann mit hoher Stabilität wiederverwendet werden, da er nach acht wiederholten Batch-Reaktionen 74 % seiner ursprünglichen Aktivität beibehielt. Die Wirksamkeit von SDL und der Nachweis des Konzepts bei der Behandlung von Schadstoffen, die Anlass zu Besorgnis geben, wurden mit Bisphenol A und Sulfamethoxazol nachgewiesen.