ADAR

C Enzym-Substrat-Erkennung

Wenig ist darüber bekannt, wie ADARs mit ihren spezifischen Substraten interagieren und wie die RNA-Bindungsdomänen und die katalytische Domäne während der Editierreaktion zusammenarbeiten. Im Gegensatz zur C-zu-U-RNA-Editiermaschinerie, die ein primäres Sequenzmotiv in der Nähe der Editierstelle als kritische Determinante für die Substraterkennung einsetzt (Niswender, 1998), fehlt den ADAR-Enzymen jede offensichtliche intrinsische Sequenzspezifität. Tatsächlich deaminieren sowohl ADAR1 als auch ADAR2 fast beliebig bis zu 50-60% aller Adenosine in der Sequenz, wenn sie vollständig doppelsträngige RNA-Moleküle vorfinden (Nishikura, 2010). Das Vorhandensein von Schleifen, Fehlanpassungen und Ausbuchtungen innerhalb einer RNA-Substratstruktur erhöht jedoch die Standortselektivität, und wie bei einigen physiologischen ADAR-Targets zu sehen ist, scheint die komplizierte RNA-Faltung eines solchen Substrats den Zugang zur Bindung an die RNA und die produktive Katalyse oft auf ein einziges Adenosin zu beschränken (Nishikura, 2010). Daher könnte der größte Teil der Zielspezifität der A-zu-I-Editierung in der dreidimensionalen Faltung des Substrats liegen. Jüngste NMR-basierte Strukturstudien von ADAR-Protein-RNA-Bindungsdomänen im Komplex mit minimalen RNA-Substraten deuten jedoch darauf hin, dass einzelne dsRNA-Bindungsdomänen auch an sequenzspezifischen Kontakten beteiligt sein könnten, die zur Selektivität für bestimmte RNA-Ziele gegenüber anderen beitragen könnten (Stefl et al, 2006, 2011).

Eine weitere Eigenschaft von ADARs, die Auswirkungen auf die Substraterkennung und -interaktion haben könnte, ist die Erkenntnis, dass die ADAR-Proteine für eine produktive und hochaktive Desaminierung ein Dimer auf dem Substrat bilden (Jaikaran et al., 2002; Cho et al., 2003; Gallo et al., 2003; Poulsen et al., 2006). Potenziell können sich sowohl Homo- als auch Heterodimere zwischen ADAR-Proteinen bilden (Chilibeck et al., 2006) und stellen somit eine weitere Regulierungsebene dar, die sowohl die substratspezifische Erkennung als auch die RNA-Editing-Aktivität beeinflusst. Da bisher kein Editing-Ziel für ADAR3 bekannt ist und dieses Protein in Standard-Desaminase-Assays keine enzymatische Aktivität zeigt (Melcher et al., 1996a; Chen et al., 2000), wurde angenommen, dass seine Rolle durch Heterodimerisierung mit den anderen ADARs regulatorischer Natur ist.

Im Zusammenhang mit der Bildung von ADAR-Dimeren für die allgemeine Editing-Aktivität steht die Beobachtung, dass bestimmte RNA-Editing-Ereignisse, die innerhalb desselben Substrats stattfinden, eine positive oder negative Kopplung aufweisen. So zeigen zum Beispiel Adenosine, die direkt nebeneinander oder auf der gleichen Seite der RNA-Duplexstruktur (etwa 11 nt Abstand innerhalb der A-Form-RNA) liegen, häufig eine Kopplung beim Editing durch ADARs, wahrscheinlich aufgrund ihrer räumlichen Nähe zur katalytischen Stelle des Enzyms (Koeris et al., 2005; Enstero et al., 2009).

Trotz dieser Erkenntnisse ist es derzeit noch nicht möglich, eine RNA-Editierstelle auf der Grundlage der primären RNA-Sequenz vorherzusagen. Dies liegt vor allem an der komplexen Natur der RNA-Tertiärstrukturen und ihrem dynamischen Verhalten. Selbst wenn man davon ausgeht, dass dsRNA-Bindungsdomänen in der Lage sind, bestimmte primäre Sequenzmotive von anderen zu unterscheiden, können kleine Veränderungen in der umgebenden Primärsequenz oder Sekundär- und Tertiärstruktur die sequenzspezifischen Kontakte modulieren oder sogar außer Kraft setzen. Infolgedessen haben Versuche, Suchalgorithmen zu entwickeln, die mehrere molekulare Merkmale (einschließlich Basenpaarungswahrscheinlichkeit, Sequenzumgebung, Sequenzerhaltung) kombinieren, von denen bekannt ist, dass sie die Editierwahrscheinlichkeit oder -aktivität beeinflussen, um potenzielle Editierstellen vorherzusagen, zu langen Listen von Kandidatenpositionen in mRNAs geführt, aber nur wenige neuartige, ortselektive und hochgradige Modifikationsstellen wurden als echte In-vivo-Ziele validiert (Clutterbuck et al., 2005; Levanon et al., 2005; Gommans et al., 2008; Sie und Maas, 2009). Die Dichotomie zwischen der Entdeckung Tausender wahrscheinlicher Editierstellen auf der Grundlage molekularer Merkmale in prä-mRNAs und dem Mangel an hochrangigen Rekodierstellen lässt vermuten, dass entweder die Vorhersagealgorithmen unter einer hohen Falsch-Positiv-Rate leiden und die meisten dieser Kandidatenpositionen nicht von ADARs editiert werden, oder dass die experimentelle Entdeckung von RNA-Editierung das Problem ist und für viele echte Editierstellen die falschen Gewebe getestet werden (zelltypspezifische Editierung) oder dass sie zum falschen Zeitpunkt getestet werden (regulierte Editierung). Oder die In-vivo-Editierungsmengen der meisten Stellen sind so gering, dass die derzeitigen Nachweismethoden nicht empfindlich genug sind, um Editing nachzuweisen oder zu widerlegen.