Adenylylcyclase

• 1 Funktion
• 2 Einleitung
  • 2.1 Zyklisches Adenosinmonophosphat
  • 2.2 Pyrophosphat
• 3 Säugetier-Adenylylzyklase
  • 3.1 Typ II
    • 3.1.1 Struktur
    • 3.1.2 Überexpressionsstörungen
• 4 Rv1264 Adenylyl Cyclase
  • 4.1 Struktur
    • 4.1.1 C-terminale katalytische Domäne
      • 4.1.1.1 α1-Schalter
    • 4.1.2 N-terminale regulatorische Domäne
      • 4.1.2.1 αN10-Schalter
  • 4.2 Regulation durch pH-Wert
  • 4.3 Biologische Rolle
• 5 3D-Strukturen der Adenylylzyklase

Funktion

Adenylylzyklase (ADCY, EC-Nummer 4.6.1.1), auch bekannt als Adenylatzyklase, ist ein Enzym, das die Zyklisierung von in katalysiert. Dies geschieht in einem einzigen, konzertierten Schritt, bei dem der Sauerstoff an der 3′-Hydroxylgruppe von ATP das alpha-Phosphat nukleophil angreift und dabei eine Phosphodiesterbindung bildet und eine Pyrophosphatgruppe abspaltet. In den meisten aktiven Stellen gibt es einen sauren Rest in der Nähe der 3’OH-Gruppe, der für deren Deprotonierung sorgt, und basische Reste am β-Phosphor, um die Energie der Gruppe für die Abspaltung zu senken. Der Reaktant in der von der Adenylylzyklase katalysierten Reaktion ist ATP; ATP ist das in den meisten Zellen am häufigsten vorkommende Nukleotidtriphosphat mit typischen Konzentrationen von 1 bis 10 mM. Diese hohe intrazelluläre Konzentration ermöglicht einen schnellen Anstieg der cAMP-Konzentration als Reaktion auf ein bestimmtes Signal, was für viele Signaltransduktions- und Stoffwechselwege wichtig ist. Das Hauptprodukt dieser Reaktion ist cAMP, mit einem Nebenprodukt von PPi. Die zytoplasmatischen Bereiche von ADCY bestehen aus seinem N-Terminus, C1a, C1b, C2a und C2b. Die C1a und C2a bilden die katalytische Domäne. Der Schwerpunkt dieser Seite liegt auf der mikrobiellen Adenylylzyklase Rv1264, aber auch Adenylylzyklasen von Säugetieren werden weniger ausführlich behandelt.

Adenylylcyclase-assoziiertes Protein (CAP) reguliert das Aktin-Zytoskelett und die Zelladhäsion in allen Eukaryoten.

Zur Calmodulin-empfindlichen Adenylatzyklase siehe Anthrax-Ödemfaktor.

Einleitung

Es gibt zehn Isoenzyme von Adenylylzyklasen bei Säugetieren, Adenylylzyklase Typ I-X (ADCY I-X), und viele weitere bei anderen Organismen. Alle Säugetier-Adenylylzyklasen und die meisten anderen Adenylylzyklasen gehören zur Klasse III; die meisten sind integrale Membranproteine, und alle produzieren cAMP, dessen Fähigkeit als Reaktion auf bestimmte Bedingungen oder Liganden aktiviert oder inaktiviert werden kann. Alle membrangebundenen Adenylylzyklasen von Säugetieren werden durch Alpha-Untereinheiten von G-Proteinen aktiviert, reagieren aber unterschiedlich auf Liganden wie Magnesiumionen, Kalziumionen und Beta-Gamma-Untereinheiten von G-Proteinen. Eines der Säugetier-Isoenzyme und einige prokaryotische Formen der Adenylylcyclase reagieren auf Umweltbedingungen, vor allem auf den pH-Wert.

Zyklisches Adenosinmonophosphat

In Säugetieren wirkt cAMP als sekundärer Botenstoff, der unter anderem die Aktivität der Proteinkinase A (PKA) steuert. PKA wiederum hat recht unterschiedliche Aufgaben in den Zellen, die meisten davon sind mit dem Stoffwechsel verbunden, aber PKA spielt auch eine wichtige Rolle bei der Transkription, dem Zellzyklus und der Apoptose. Das endgültige Schicksal von cAMP ist seine Umwandlung in AMP durch die Spaltung der Phosphodiesterbindung durch 3′,5′-zyklisches Adenosinmonophosphat-Phosphodiesterase.

Pyrophosphat

Die Spaltung des Nebenprodukts dieser Reaktion, PPi, durch Pyrophosphatase ergibt zwei Moleküle anorganisches Phosphat (Pi). Die ATP-Synthase kann dieses anorganische Phosphat wieder in Adenindiphosphat (ADP) einbauen, um ATP unter Verwendung der Energie der Protonenmotivkraft herzustellen.

Säugetier-Adenylyl-Cyclase

Es gibt zehn Isoenzyme von Adenylyl-Cyclasen in Säugetieren, Adenylyl-Cyclase Typ I-X, (ADCY I-X); In Säugetieren spielt Adenylyl-Cyclase eine wichtige Rolle in Signaltransduktionswegen, in denen cAMP ein sekundärer Botenstoff ist.

ADCY I-IX haben alle eine allgemeine Struktur; sie bestehen aus zwei Transmembranbereichen (M1, M2), die aus sechs membranüberspannenden Helices bestehen und die Funktion haben, das Enzym in der Membran zu verankern, und zwei Zytoplasmabereichen (C1, C2), die weiter unterteilt werden können (C1a, C1b, C2a, C2b) und für die gesamte katalytische Aktivität und die Regulierung durch G-Proteine und Forskolin verantwortlich sind. In Lösung können die C1a- und C2a-Domänen miteinander Heterodimere bilden, entweder in demselben oder in verschiedenen Enzymen, oder sie können mit ihren identischen Einheiten auf verschiedenen Enzymen Homodimere bilden. Die C1b-Domäne ist sehr groß (≈15 kDa) mit vielen regulatorischen Stellen und hat eine variable Struktur in verschiedenen Isozymen, während die C2b-Domäne in vielen Isozymen fast nicht vorhanden ist und noch nicht mit einer bestimmten Funktion in Verbindung gebracht wurde.

Typ II

Struktur

Ein Monomer der C2-Domäne hat eine interne, hydrophobe, antiparallele, die von mehreren amphipathischen Domänen umgeben ist, mit Ausnahme eines Bereichs, der ein Homodimer mit einer anderen C2-Domäne bilden muss. Zwei Monomere der C2-Domäne der Adenylylcyclase vom Typ II binden sich in Lösung zu einem Homodimer, das für die katalytische Umwandlung von ATP in cAMP und PPi erforderlich ist. Wenn sie gebunden sind, bilden sie eine tiefe Spalte, die das Zentrum ihrer Bindungsstelle überspannt; diese Spalte ist geeignet, um zwei Moleküle an ihren Enden zu binden. Zwischen den Sauerstoffatomen des Forskolins und dem umgebenden Peptidgerüst bestehen starke Wasserstoffbrückenbindungen, und die übrigen Wechselwirkungen sind stark hydrophob, da die Forskolin-Bindungsstelle zehn aliphatische und aromatische Reste enthält. Durch die Bindung von Forskolin entsteht eine hydrophobe Bindung zwischen den Monomeren, von denen jedes zwei verschiedene hydrophobe Oberflächen hat, die an Forskolin binden; diese Wechselwirkung macht das Homodimer stabil. Das Forskolin interagiert auch mit Asn 1025, das für die katalytische Aktivität unerlässlich ist, und positioniert es richtig, und es kann sogar direkt mit dem ATP interagieren. Dieser Homodimer-Forskolin-Komplex kann als Reaktion auf ein Signal durch Bindung an die βγ-Untereinheit eines G-Proteins weiter aktiviert werden. Diese βγ-Untereinheit bindet an den Teil einer α-Helix auf der äußersten Schicht des Komplexes, die einen Teil davon ausmacht.

Der Teil dieses Homodimers befindet sich innerhalb der Spalte und ist durch zwei hochkonservierte Gruppen von polaren Resten gekennzeichnet (Arg 997 (Grün), Asn 1025 (Rot), Ser1028(Rosa), Arg 1029(Orange), Asp 1031(Gelb) und Ser 1032(Lila)). Einer dieser Sätze befindet sich auf jeder monomeren Untereinheit, auf dem Homodimer ordnen sie sich antiparallel an, wobei sie zueinander zeigen.

Überexpression Störungen

Im Gehirn von Säugetieren wird die Ausführung von gedächtnisbasierten Funktionen durch den präfrontalen Kortex (PFC) durchgeführt. Durch Hyperpolarisation aktivierte zyklische Nukleotid-gesteuerte Kanäle (HCN-Kanäle) auf Neuronen schließen sich, damit elektrochemische Signale das Axon hinunter und in eine Synapse fließen können; wenn HCN-Kanäle offen sind, kann das elektropotentielle Signal nicht durch die Zelle übertragen werden. Die Exposition dieser Kanäle gegenüber cAMP führt dazu, dass sie sich öffnen, wodurch die Signalübertragung gestoppt wird und somit höhere kognitive Gedanken beeinträchtigt werden. Bei Patienten mit Schizophrenie ist ein cAMP-regulierendes Molekül, Disrupted-in-Schizophrenia 1 (DISC1), mutiert und kann den cAMP-Spiegel nicht regulieren; daher kann ein erhöhter cAMP-Spiegel Schizophrenie verursachen. Es wird angenommen, dass die Schließung von HCN-Kanälen auch bei anderen Störungen wie ADHS und bipolaren Störungen eine Rolle spielt. Daher liegt es nahe, dass die Regulierung der cAMP-Produktion durch gezielte Beeinflussung der Adenylylzyklase vom Typ II, die im Gehirn vorkommt, als Behandlung für diese Störungen dienen könnte.

Rv1264 Adenylylzyklase

Obwohl die Adenylylzyklase in allen Organismen auf universeller Ebene vorkommt, haben entfernt verwandte Organismen unterschiedliche Modifikationen des Enzyms, die jeweils auf eine bestimmte Aufgabe in einer bestimmten Umgebung spezialisiert sind. Wie bereits erwähnt, gibt es beim Menschen 10 bekannte Isoenzyme der Adenylylcyclase, während Escherichia coli nur ein Isozym und Mycobacterium tuberculosis 15 Isozyme besitzt. Eine besonders interessante Adenylylcyclase von M. tuberculosis, Rv1264, hat einen N-Terminus, der gewissermaßen als pH-Sensor fungiert, da er die Aktivität des Enzyms in Abhängigkeit vom pH-Wert der umgebenden Lösung reguliert. Diese Adenylylzyklase gehört wie die meisten anderen zur Klasse III. Adenylylzyklasen dieser Klasse haben mehrere Domänen, mindestens eine für die Katalyse und eine weitere für die Regulierung.

Struktur

Die Adenylylzyklase ist ein 363 Reste langes Protein, das aus einer katalytischen und einer regulatorischen Domäne besteht und eine flexible Domäne enthält, die die beiden verbindet. Die aktive Struktur ist ein Homodimer, das dem Säugetier-Homodimer vom Typ II ähnelt, bei dem eine α-Helix des einen Monomers (Kette A) durch die zentrale Spirale des anderen (Kette B) verläuft. Durch diese Dimerisierung befindet sich die regulatorische Domäne von Kette A in unmittelbarer Nähe der katalytischen Domäne von Kette B und umgekehrt. Zwei Schaltelemente sind im Protein vorhanden, eines in der C-terminalen Domäne (α1-Schalter) und ein weiteres in der Linker-Region (αN10-Schalter), die große Konformationsänderungen des Enzyms als Reaktion auf relativ kleine Umweltveränderungen ermöglichen.

C-terminale katalytische Domäne

Die katalytische Aktivität in Rv1264 wird von den Resten ausgeführt: Asp 222 (Rot), Lys 261 (Blau), Asp 265 (Orange), Arg 298 (Rosa), Asp 312 (Gelb), Asn 319 (Lila), Arg 323 (Grün). Alle diese Reste bilden eine stark polare Umgebung, die in Bezug auf Ladung und Polarität komplementär zum Zwischenprodukt der Reaktion ist. Die Reste, die die Phosphate des ATP führen, Arginin 298 und 323, binden ein im aktiven Zentrum. Dieses Sulfat-Ion befindet sich in der Position, die während der Katalyse vom β-Phosphat des ATP eingenommen wird. Bei der Katalyse wird das β-Phosphat vom α-Phosphat abgespalten; diese Reaktion kann durch Senkung der Energie durch komplementäre Ladungsassoziationen zwischen dem β-Phosphat und den Argininen 298 und 323 günstiger gestaltet werden. Ein weiterer Rest, , bindet ein Molekül durch elektrostatische Wechselwirkungen. Die spezifische Funktion dieser Assoziation ist nicht bekannt, aber aufgrund ihrer Nähe zum aktiven Zentrum könnte sie eine Rolle bei der Katalyse spielen.

Die Aminosäuresequenzierung hat gezeigt, dass die Sequenz zwischen der katalytischen Domäne der Adenylylzyklase von Rv1264 und der katalytischen Domäne der Adenylylzyklase von Säugetieren nicht gut konserviert ist und nur etwa 25 % mit der oben beschriebenen Adenylylzyklase vom Typ II der Säugetiere übereinstimmt. Die beiden unterschiedlichen Isoenzyme ähneln sich jedoch insofern, als die Überlagerung der beiden Isoenzyme eine beträchtliche Überlappung aufweist, mit einer mittleren quadratischen Abweichung (rmsd) von weniger als 1,76 Å zwischen 79 % aller Isoenzyme. Ein bemerkenswerter Unterschied zwischen den katalytischen Domänen von Rv1264 und der Typ-II-Adenylylzyklase ist ihre relative Größe; Rv1264 hat keinen Dimerisierungsarm und mehrere seiner Schleifen sind verkürzt. Dies führt dazu, dass die katalytische Domäne der Adenylylzyklase Rv1264 als Dimer mit einer kleineren Schnittstellenfläche assoziiert als die des Säugetiers vom Typ II, mit Schnittstellenflächen von 1900Å2 bzw. 3800Å2. Die aktiven Stellen der Rv1264 und Säugetier Typ II Adenylylzyklasen sind sogar noch konservierter; die in der aktiven Stelle haben einen rmsd von nur 0,69Å, und in der aktiven Stelle haben einen rmsd von 1,17Å.

Alle der oben genannten strukturellen Informationen für die C-terminale katalytische Domäne ist nur wahr, wenn das Enzym in seinem aktiven Zustand ist. Im inaktiven Zustand des Enzyms ist das aktive Zentrum demontiert, so dass keine katalytische Aktivität vorliegt. Im Vergleich zu den festen N-terminalen Domänen kann sich jede der C-terminalen monomeren Domänen um bis zu 6 Å verschieben und um 55° drehen. Durch diese massive Veränderung der Tertiärstruktur der C-terminalen Domänen wird das aktive Zentrum aufgelöst, und die katalytischen Reste werden bis zu 25 Å von ihrer katalytisch aktiven Position entfernt. Nicht nur die aktive Stelle ist in der C-terminalen Domäne gestört, sondern auch die Grenzfläche zwischen den beiden Monomeren nimmt von 1900Å2 auf 930Å2 ab.

α1-Schalter

Der befindet sich innerhalb der C-terminalen katalytischen Domäne und besteht als kompakte α-Helix, wenn sich das Enzym in seinem aktiven Zustand befindet. Bei Inaktivierung wird die α-Helix-Konformation des α1-Schalters instabil, und er verwandelt sich in eine zufällige Spule. Da sich dieser Schalter in unmittelbarer Nähe des aktiven Zentrums befindet, führt eine größere Strukturänderung zu einer erheblichen Störung des aktiven Zentrums und zur Inaktivierung des Enzyms.

Diese Struktur ist in Adenylylzyklasen von Säugetieren konserviert, wo sie für die Bindungsstelle der βγ-Phosphate des ATP-Substrats verantwortlich ist. Zusammen mit einer anderen α-Helix bildet sie die Bindungsstelle für die Gsα- und Giα-G-Proteinuntereinheiten, die die Aktivität der Adenylylzyklasen regulieren.

N-terminale regulatorische Domäne

Die N-terminale Domäne hat eine regulierende Funktion; sie verfügt über einen einzigartigen Mechanismus, der abhängig vom pH-Wert der umgebenden Lösung bestimmt, ob das Enzym aktiv ist oder nicht. Jedes Monomer im katalytisch aktiven Dimer hat zehn, wenn sie dimerisiert sind, bilden sie eine scheibenförmige Struktur. Ein einzelnes Molekül bindet sich in einer hydrophoben Tasche. Die Funktion dieses Polyethylenglykols scheint strukturell zu sein; seine spezifische Platzierung und Bewegung zwischen aktiven und inaktiven Formen des Enzyms lässt jedoch vermuten, dass es auch bei der Erkennung von Hydrophobieänderungen in der Umgebung eine Rolle spielt.

αN10-Schalter

Der befindet sich in der Linker-Region und seine Konformationsänderung hat eine drastischere Auswirkung auf das gesamte Enzym als der α1-Schalter. Wenn das Enzym aktiv ist, besteht der αN10-Schalter aus einer zufälligen Spule mit einer kurzen α-Helix; diese Konformation ermöglicht nur eine schwache Interaktion zwischen der N-terminalen regulatorischen Domäne und der C-terminalen katalytischen Domäne, so dass das Enzym katalytische Aktivität entfalten kann. Diese Helix kann sich um bis zu 24Å ausdehnen, wodurch die monomeren C-terminalen katalytischen Domänen des Dimers getrennt werden. Diese Trennung der Domänen führt zu einer Verringerung der Grenzfläche und zur Verschiebung von Resten; wie bereits erwähnt, führen diese Veränderungen zu einer Inaktivierung des Enzyms, und daher ist ein Hauptmerkmal des inaktiven Zustands des Enzyms ein verlängerter αN10-Schalter. Wenn sich der αN10-Schalter ausdehnt, bewegt er sich nach außen, und das Pentaethylenglykol bewegt sich in einen neu gebildeten Hohlraum durch die αN10-Helix. Dies unterstützt die Idee, dass der Pentaethylenglykol-Ligand nicht nur für die Struktur, sondern auch für die Regulierung zuständig ist.

Regulierung durch den pH-Wert

Am Anfang der Linker-Region befindet sich ein Rest, der einen erheblichen Einfluss auf die Regulierung durch den pH-Wert hat. Bei einem basischen pH-Wert hat der Rest keine Ladung und minimale Wechselwirkungen mit den beiden katalytisch wichtigen Resten, die 14 Å und 21 Å von ihren katalytisch aktiven Positionen entfernt liegen. Das Enzym ist in diesem Zustand inaktiv, nicht nur wegen der Reste Lys 261 und Asp 312, sondern auch, weil andere wichtige strukturelle Komponenten der katalytischen Stelle abgebaut werden. Bei einem sauren pH-Wert wird Rv1264 aktiv (optimaler pH-Wert ~ 5,8) und weist eine bis zu 40-fache Steigerung der Aktivität auf. Bei diesem sauren pH-Wert wird His 192 protoniert und positiv geladen, was zu erheblichen strukturellen Veränderungen im gesamten Protein führt, einschließlich der Verdichtung sowohl des αN10-Schalters als auch des α1-Schalters und der Kontraktion der α4-Helix, was wiederum eine Verlagerung des Paraethylenglykol-Liganden bewirkt. Das positiv geladene His 192 stößt die Reste Lys 261 und Asp 312 elektrostatisch ab, wodurch sie zusammen mit anderen strukturellen Veränderungen um 14 Å bzw. 21 Å in ihre katalytisch aktiven Positionen verschoben werden.

, ein Rest, der viele Reste, die für die C-terminale – N-terminale Interaktion wichtig sind, durch Wasserstoffbrückenbindungen organisiert, ist ebenfalls wichtig für die Regulation. Wenn dieser Rest mutiert ist, geht die pH-Regulierung verloren und das Enzym ist ständig aktiv.

Viele andere Reste tragen ebenfalls zur pH-Regulierung bei; es sind die elektrostatischen Wechselwirkungen und Wasserstoffbrücken in der C-terminalen – N-terminalen Domänenschnittstelle, die es der Adenylylzyklase Rv1264 ermöglichen, pH-empfindlich zu sein.

Biologische Rolle

M. tuberculosis ist ein pathogenes Bakterium, und daher ist es mit einer Reihe von Immunreaktionen des Wirts konfrontiert, die versuchen, es loszuwerden. Einer der Abwehrmechanismen des Wirts, denen M. tuberculosis ausgesetzt ist, ist die Übersäuerung der Phagolysosomen. Die Fähigkeit, dieses saure Milieu zu erkennen und darauf angemessen zu reagieren, kann M. tuberculosis bei der Infektion eines Wirts sehr helfen. Wenn der cAMP-Spiegel erhöht wird, verzögert sich die Ansäuerung anderer Strukturen, und der erhöhte cAMP-Spiegel aktiviert cAMP-Rezeptorproteine, die wiederum die Transkription regulieren.

3D-Strukturen der Adenylylcyclase

3D Adenylylcyclase 3D-Strukturen