Aggregation von Ampholin an Heparin und andere saure Polysaccharide bei der isoelektrischen Fokussierung

Der Mechanismus der Komplexierung von Ampholin im pI-Bereich von 3,5 bis 5 an Heparin bei der isoelektrischen Fokussierung wurde mit der Farbstoffbindetechnik bei verschiedenen pH-Werten in Lösung untersucht. Bei einem pH-Wert von 6,7 gibt es keine signifikante Wechselwirkung zwischen Heparin und Ampholin. Eine schwache oder selektive Bindung tritt bei pH 5,1 auf, eine sehr starke Wechselwirkung bei pH 3,5. Im letztgenannten System scheinen sich die Ampholin-Komponenten aufgrund ihrer geordneten Abfolge von positiven Ladungen, die jeweils zwei Methylengruppen voneinander entfernt sind, wie Polykationen zu verhalten, was eine starke Bindung an Polyanionen begünstigt. Darüber hinaus scheint es für die starke Bindung zwischen Heparin und Ampholin variable Stöchiometrien zu geben, die von ihren relativen Mengen abhängen. Es wird vorgeschlagen, dass bei einem niedrigen Verhältnis von Heparin zu Ampholin (Ampholin-Überschuss) die Aggregation senkrecht zur Heparin-Kette erfolgt, wobei die Ammonium-Endladung jedes Ampholin-Moleküls eine negative Ladung entlang des Heparin-Moleküls neutralisiert; bei höheren Verhältnissen (Heparin-Überschuss) ist das gebundene Ampholin-Segment parallel zum Heparin-Molekül ausgerichtet, so dass im Durchschnitt eine Ampholin-Komponente ca. drei negative Ladungen neutralisiert. Die Bänderung von Heparin bei der isoelektrischen Fokussierung im pH-Bereich von 3,0 bis 4,5 lässt sich durch die Aggregation der verschiedenen Komponenten auf Heparin in Mengen erklären, die von der Nettoladung der Ampholin-Spezies bei dem gegebenen pH-Wert und von den sich ändernden Stöchiometrien in Abhängigkeit von der Variation des Verhältnisses von Heparin zu Ampholin entlang des pH-Gradienten abhängen. Die Bindung von Ampholin an Polygalacturonat wurde auch bei überschüssigem Ampholin in einem pH-Bereich nachgewiesen, der vom Grad der Protonierung der Carboxylgruppen dieses sauren Polysaccharids sowie von der positiven Nettoladung des Ampholins abhängt. Die bei einem pH-Wert von 4,2 bis 4,5 beobachtete Aggregation führte zu der Vorhersage und dem anschließenden Nachweis, dass Polygalacturonat auch bei isoelektrischer Fokussierung eine Bindung aufweist. Dies stützt die Hypothese, dass die Aggregation von Ampholin an Polyanionen mit ausreichender Ladungsdichte ein allgemeines Phänomen ist, das bei der isoelektrischen Fokussierung in geeigneten pH-Bereichen zu einer unerwünschten Bandenbildung bei bestimmten Polymeren führen kann. Ausgehend von ihrem Verhalten bei der isoelektrischen Fokussierung bei pH 3,0 bis 4,5 scheint die Aggregationsstärke der untersuchten Polyanionen Heparin A = Heparin B größer als Polyglutamat größer als carboxylreduziertes Heparin B größer als Polygalakturonsäure zu sein.