Ammoniumsulfat-Proteinausfällung: Der Schlüssel zum Aussalzen

Die Salzausfällung kann ein sehr leistungsfähiges Werkzeug zur Reinigung von Proteinen durch Ausfällung sein. Ammoniumsulfat ist in der Regel das Salz der Wahl, da es billig, sehr gut wasserlöslich und in der Lage ist, viel stärker hydratisiert zu werden (mit mehr Wassermolekülen in Wechselwirkung zu treten) als fast jedes andere ionische Lösungsmittel. In der Praxis wird Ammoniumsulfat entweder direkt als Feststoff oder als (in der Regel) gesättigte Lösung zugegeben, um die gewünschten Proteine auszufällen.

Bei niedrigen Salzkonzentrationen (<0,15M) neigt die Zugabe von mehr Salz im Allgemeinen dazu, die Löslichkeit von Proteinen zu erhöhen, da die Ionen die Proteinmoleküle vor den Ladungen anderer Moleküle abschirmen; dieser Trend wird als „Einsalzen“ bezeichnet. Ab einem gewissen Punkt wird die Ionenstärke zu hoch und wirkt sich negativ auf die Löslichkeit der Proteine aus, was als „Aussalzung“ bezeichnet wird. Dies geschieht, weil das gelöste Salz mit den Proteinen um die knappen Wassermoleküle konkurriert, wodurch sich die Oberflächenspannung des Wassers erhöht und sich das Protein daher enger faltet. Die Verringerung der Proteinoberfläche bedeutet eine geringere Protein-Wasser-Wechselwirkung, die mehr hydrophobe Wechselwirkungen zwischen den Proteinmolekülen ermöglicht, was zur Aggregation und anschließend zur Ausfällung führt.

Proteine in Lösung können auch fraktioniert werden, da sie in Abhängigkeit von der Salzkonzentration ausfallen. Auf diese Weise ist es möglich, bestimmte Proteine zu reinigen, indem man eine bestimmte Menge Ammoniumsulfat hinzufügt, um unerwünschte Proteine auszufällen, den Überstand gewinnt und dann etwas mehr Ammoniumsulfat hinzufügt, um das gewünschte Protein auszufällen, und dann dieses Pellet des ausgefällten Proteins aufbewahrt. Da die Salzfällung nur die Löslichkeit der Proteine beeinträchtigt und sie nicht denaturiert, kann die gewonnene Fraktion über längere Zeiträume in der Salzlösung aufbewahrt werden, ohne dass man sich Sorgen über eine bakterielle Kontamination machen muss, da der hohe Salzgehalt jegliches mikrobielles Wachstum oder Proteaseaktivität hemmt.

Da die Ammoniumsulfatfällung nur die Löslichkeit der Proteine verringert und sie nicht denaturiert, können die Proteine durch Entfernen der restlichen Ammoniumsulfatlösung konzentriert und das Proteinpellet dann in Standardpuffern oder einer niedrigeren Ammoniumsulfatkonzentration resolubilisiert werden. Die Proteinlösung kann dann durch hydrophobe Interaktionschromatographie oder Gelfiltrationschromatographie weiter gereinigt werden. Ammoniumsulfat kann auch verwendet werden, um einige Proteine, die durch Denaturierungsmittel wie Harnstoff entfaltet wurden, durch allmähliche Erhöhung der Ammoniumsulfatkonzentration wieder in ihre richtige native Konformation zu bringen.

Es gibt einige bewährte Verfahren, die bei der Arbeit mit Ammoniumsulfat beachtet werden sollten, z. B.:

• Verwenden Sie einen Mörser und einen Stößel, um Klumpen aufzubrechen und das Ammoniumsulfat anderweitig zu zerkleinern, um die Zugabe und das Auflösen zu erleichtern.
• Nur eine kleine Menge Ammoniumsulfat auf einmal zugeben, warten, bis es sich auflöst, und vorsichtig umrühren, um Schaumbildung zu vermeiden.
• Einen Puffer wie 50 mM HEPES oder Tris verwenden, um die säurebildende Wirkung von Ammoniumsulfat zu minimieren.
• Verwenden Sie Ammoniumsulfat in analytischer Qualität, da mindere Qualitäten in der Regel mit Schwermetallen verunreinigt sind.

Das Verfahren der Salzfällung ist mit einigen Nachteilen verbunden. Das Aussalzen von Proteinen erfordert eine vorherige Kenntnis der Löslichkeit des Proteins. Außerdem können Verunreinigungen, die in der Ausgangsprobe vorhanden sind, auch in der Fraktion, die das interessierende Protein enthält, vorhanden sein; dieses Verfahren konzentriert das Protein, reinigt es aber nicht. Außerdem kann es notwendig sein, das Salz aus der Proteinprobe zu entfernen, so dass eine weitere Verarbeitung in Form von Dialyse oder Chromatographie erforderlich ist.

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