Analytische Empfindlichkeit, funktionelle Empfindlichkeit

Eine der grundlegenden Eigenschaften jeder analytischen Methode ist die kleinste Konzentration, die zuverlässig gemessen werden kann. Zur Beschreibung der niedrigsten Konzentration, die ein Immunoassay anzeigen kann, wurde eine Reihe von Begriffen und Konzepten verwendet, und diese Vielzahl von Begriffen kann wirklich verwirrend sein. Im Folgenden werden einige dieser Begriffe und ihre Bedeutung für die Beantwortung der grundlegenden Frage erörtert: Was ist die niedrigste Konzentration, die ich mit diesem Assay messen kann?
Analytische Empfindlichkeit
Die formale Definition der analytischen Empfindlichkeit ist „die niedrigste Konzentration, die vom Hintergrundrauschen unterschieden werden kann“. Diese Konzentration wird eigentlich als Nachweisgrenze des Assays bezeichnet, wird aber meist als Empfindlichkeit bezeichnet. In der Regel wird dieser Wert durch Wiederholungen einer Probe ermittelt, von der bekannt ist, dass sie keinen Analyten enthält. Anschließend werden die gemessenen Zählwerte (CPS) dieser Wiederholungen verwendet, um einen Mittelwert und eine Standardabweichung (SD) zu berechnen. Die analytische Empfindlichkeit wird bestimmt als die Konzentration, die dem Mittelwert der Zählungen aus der Nullprobe plus 2 SD für immunometrische Assays und dem Mittelwert minus 2 SD für kompetitive Assays entspricht. Dies wird im Abschnitt „Analytische Sensitivität“ der Packungsbeilagen von IMMULITE® und IMMULITE® 2000 angegeben.
In der realen Welt hat die analytische Empfindlichkeit nur einen begrenzten praktischen Wert. Die wirkliche Einschränkung besteht darin, dass die Ungenauigkeit bei jedem Assay mit abnehmender Konzentration sehr schnell zunimmt. Dieses Phänomen lässt sich leicht erkennen, wenn man sich das Präzisionsprofil des Assays ansieht, eine grafische Darstellung, die zeigt, wie sich die Ungenauigkeit eines Assays mit der gemessenen Konzentration verändert. (Siehe Abbildungen 1 und 2 für Beispiele.)

Abbildung 1. Repräsentatives DPC-Präzisionsprofil.

Abbildung 2. Repräsentatives DPC-Präzisionsprofil. Es ist zu beachten, dass die funktionelle Empfindlichkeit im Bereich von 0,01-0,02 µIU/mL per Definition für einen TSH-Test der „dritten Generation“ erforderlich ist.1,2
Nicht nur bei der analytischen Empfindlichkeit, sondern auch bei Konzentrationen, die deutlich darüber liegen, kann die Ungenauigkeit so groß sein, dass die Ergebnisse nicht gut genug reproduziert werden können, um von echtem klinischem Nutzen zu sein. Folglich stellt die analytische Empfindlichkeit in der Regel nicht die niedrigste messbare Konzentration dar, die klinisch nützlich ist.
Diese Einschränkung der analytischen Sensitivität galt schon immer für RIA und IMMULITE und gilt für alle Methoden aller Hersteller. Da Patientenproben in der Regel nicht in Wiederholungen untersucht werden, ist der Mangel an Reproduzierbarkeit bei Routinetests möglicherweise nicht ohne weiteres erkennbar. Die Gesamtqualität und der Nutzen der Ergebnisse werden jedoch beeinträchtigt. Aus diesem Grund wird die untere Grenze des Berichtsbereichs in der IMMULITE- und IMMULITE 2000-Software häufig auf eine Konzentration oberhalb der analytischen Empfindlichkeit festgelegt. DPC legt die Berichtsgrenzen für jeden Assay so fest, wie es eine umfassende Bewertung nahelegt, die den Bereich der effektiven und zuverlässigen Leistung für den Assay in Bezug auf seine beabsichtigte klinische Verwendung darstellt.
Die Grenzen der analytischen Sensitivität zur Beschreibung der unteren Grenze der klinisch wirksamen Leistung eines Assays führten zur Entwicklung eines anderen Konzepts.
Funktionelle Sensitivität
Vor etwa zehn Jahren entwickelte eine Gruppe von Forschern, die TSH-Tests untersuchten, als Reaktion auf den begrenzten Nutzen der analytischen Sensitivität als Maß für die Testleistung ein Konzept, das sie als funktionelle Sensitivität bezeichneten.1 Sie definierten es als „die niedrigste Konzentration, bei der ein Test klinisch brauchbare Ergebnisse liefern kann“. Klinisch brauchbare Ergebnisse für TSH wurden als gute Genauigkeit mit einem täglichen CV von nicht mehr als 20 % angesehen. Auch wenn die Wahl dieser CV-Grenze etwas willkürlich war, waren die Forscher der Ansicht, dass ein CV von 20 % für TSH die größte Ungenauigkeit darstellt, die für klinische Zwecke toleriert werden kann.1
Da der CV die Standardabweichung ist, die als Prozentsatz des Mittelwerts ausgedrückt wird, bedeutet ein CV von 20 %, dass die SD 20 % des Mittelwerts betragen würde. Bei einer Probe mit einer TSH-Konzentration von 0,1 µIU/mL betrÃ?gt der Bereich, der 95 % der erwarteten Ergebnisse einer Wiederholungsanalyse umfasst, beispielsweise ±40 % (±2 SD) oder 0,06 µIU/mL bis 0,14 µIU/mL.
Obwohl das Konzept der funktionalen SensitivitÃ?t und die Verwendung eines 20%igen CV als Grenze der klinischen NÃ?tzlichkeit ursprÃ?nglich nur fÃ?r TSH-Assays entwickelt wurde, hat es sich auch bei anderen Immunoassays durchgesetzt. Das Konzept hat sich durchgesetzt, weil es dem Labor einen objektiven und klinisch sinnvollen Hinweis auf die praktische Untergrenze eines Assays gibt.
Bei der Entwicklung eines neuen Assays wendet DPC im Wesentlichen denselben Ansatz an und bewertet sowohl die Präzision als auch die Genauigkeit, um die Konzentrationen zu ermitteln, bei denen die Grenzen der klinischen Verwendbarkeit wahrscheinlich erreicht werden. Der Software-Berichtsbereich basiert auf dieser Bewertung. Insbesondere bei konkurrierenden Assays besteht in der Regel ein erheblicher Unterschied zwischen der analytischen Empfindlichkeit und der unteren Berichtsgrenze. Der in der IMMULITE- und IMMULITE 2000-Software festgelegte Meldebereich entspricht der Empfehlung von DPC für den CLIA’88* „meldepflichtigen Bereich“, d. h. dem Konzentrationsbereich, in dem die Testleistung als gültig dokumentiert wird.
Überprüfung der Testleistung
Gegenwärtig ist für Labors, die in den USA automatisierte Immunoassay-Systeme verwenden, das einzige empfindlichkeitsbezogene Leistungsmerkmal, das gemäß CLIA’88 vom Labor überprüft werden muss, die untere Grenze des meldepflichtigen Bereichs. Einige Laboratorien können sich auch dafür entscheiden, die funktionale Empfindlichkeit eines neuen Assays abzuschätzen; und in der Vergangenheit wollten einige die analytische Empfindlichkeit verifizieren. Jede dieser Bewertungen ist ein anderes Experiment mit unterschiedlichen Protokollen und Anforderungen. Der erste Schritt besteht also darin, zu entscheiden, was überprüft werden soll, und dann das entsprechende Protokoll zu verwenden und die Daten entsprechend auszuwerten.
Wenn sich ein Labor für die Bewertung der analytischen Empfindlichkeit entscheidet, besteht das Ziel in der Regel darin, den in der Packungsbeilage angegebenen Wert für diese Leistungsmessung zu überprüfen. Es ist wichtig, dass die für eine analytische Empfindlichkeitsstudie verwendete Probe eine echte Nullkonzentrationsprobe mit einer geeigneten Probenmatrix ist. Jede andere Art von Probe kann die Ergebnisse verfälschen. Das übliche Protokoll beinhaltet die Untersuchung von 20 Wiederholungen der Nullprobe und die anschließende Berechnung des Mittelwerts und der SD des CPS. Die analytische Empfindlichkeit wird als die Konzentration geschätzt, die dem Mittelwert der Nullprobe plus 2 SD für immunometrische („Sandwich“-) Assays wie TSH oder minus 2 SD für kompetitive Assays wie T4 entspricht. Der technische Dienst kann bei der Berechnung dieser Konzentration behilflich sein. Dieses Protokoll liefert eine erste Schätzung, die in der Regel für einen Vergleich mit der in der Packungsbeilage angegebenen analytischen Empfindlichkeit ausreicht. Es sind jedoch mehrere Experimente erforderlich, die mehrere Kit-Chargen umfassen, um eine zuverlässige und genaue Bewertung zu erhalten.
Bei der Bewertung der funktionellen Sensitivität geht es darum, die niedrigste Konzentration zu bestimmen, die einem vom Labor vorgegebenen Zielwert für die tägliche (Interassay-)Ungenauigkeit entspricht und die Grenze des klinischen Nutzens für einen bestimmten Assay darstellt. In Anlehnung an die ursprüngliche Anwendung des Konzepts auf TSH wurde üblicherweise ein CV von 20 % als Zielwert festgelegt. Dieser CV ist jedoch nicht immer der am besten geeignete Grenzwert. Bei einigen Assays kann ein CV von mehr als 20 % mit klinisch zuverlässigen und aussagekräftigen Ergebnissen vereinbar sein, während bei anderen ein CV von weniger als 20 % die Grenze des klinischen Nutzens darstellen kann. Das Leistungsziel muss für jeden Assay auf der Grundlage seiner beabsichtigten klinischen Anwendung festgelegt werden.
Nach der Bestimmung des täglichen CV, der die klinisch nützliche Grenze der Reproduzierbarkeit darstellt, ist der nächste Schritt die Schätzung der Konzentration, bei der der CV diese Grenze erreichen könnte. Auf der Grundlage früherer Studien, von Daten aus der Packungsbeilage und von Schätzungen aus dem Präzisionsprofil des Assays kann der technische Dienst in der Regel dabei helfen, einen „Zielbereich“ von Konzentrationen zu ermitteln, der die vorgegebene CV-Grenze umschließt.
In der Regel sollte diese Studie mit mehreren unverdünnten Patientenproben oder Pools von Patientenproben durchgeführt werden, deren Konzentrationen den Zielbereich abdecken. Diese Proben können jedoch schwer zu beschaffen sein. Vernünftige Alternativen sind Patientenproben, die auf Konzentrationen verdünnt wurden, die den Zielbereich abdecken, oder Kontrollmaterialien, die in oder nahe diesem Bereich liegen. Wenn eine Probe für die Studie verdünnt werden muss, ist das verwendete Verdünnungsmittel entscheidend. Die Routine-Probenverdünnungsmittel sind nur für die Verdünnung von Proben mit sehr hoher Konzentration vorgesehen; bei einigen Assays können sie eine messbare, wenn auch sehr niedrige scheinbare Konzentration aufweisen. Die Verwendung dieser Verdünnungsmittel kann die Ergebnisse der Studie verfälschen.
Die Proben sollten wiederholt in mehreren Durchläufen analysiert werden, idealerweise über einen Zeitraum von Tagen oder Wochen, um die tägliche Präzision zu beurteilen. (Ein einziger Durchlauf mit 20 Wiederholungen liefert keine gültige Bewertung der funktionellen Sensitivität). Nach der Datenerfassung berechnen Sie den CV für jede getestete Probe. Die funktionelle Empfindlichkeit ist die Konzentration, bei der der CV den vorgegebenen Grenzwert erreicht. Diese Konzentration kann aus den Untersuchungsergebnissen durch Interpolation geschätzt werden, wenn sie nicht zufällig mit einer der getesteten Konzentrationen übereinstimmt.
Die Überprüfung der unteren Grenze des meldepflichtigen Bereichs ist ein Teil des Prozesses zur Überprüfung des gesamten meldepflichtigen Bereichs. Dazu wird in der Regel eine Wiederholungsanalyse an einer Reihe von drei bis fünf Proben mit bekannten Konzentrationen durchgeführt, die den meldepflichtigen Bereich abdecken. Diese Proben können aus einer einzigen Probe mit einer Konzentration nahe der oberen Grenze des Bereichs gewonnen werden, die dann verdünnt wird, um zusätzliche Proben zu erhalten, die den gesamten meldepflichtigen Bereich abdecken. Die erhaltenen Ergebnisse werden sowohl hinsichtlich der Reproduzierbarkeit als auch der Wiederfindung der erwarteten Werte bewertet, um festzustellen, ob die Leistung des Assays den Anforderungen des klinischen Nutzens über den meldepflichtigen Bereich entspricht.
Schlussfolgerung
Warum liegt also die untere Grenze des Software-Berichtsbereichs bei 1,0 µg/dL (13 nmol/L), wenn in der Packungsbeilage die Empfindlichkeit mit 0,3 µg/dL (3,9 nmol/L) angegeben ist? In diesem Beispiel handelt es sich um einen kompetitiven Assay, und die Ungenauigkeit des Assays �bersteigt die klinisch sinnvollen Grenzen bei einer Konzentration, die weit �ber der analytischen Empfindlichkeit liegt.
Wenn die Ungenauigkeit so groß ist, dass man nicht mit Sicherheit sagen kann, dass Ergebnisse von, sagen wir, 0,4 µg/dL (5 nmol/L) und 0,7 µg/dL (9 nmol/L) tatsächlich unterschiedlich sind, wäre es dann nicht besser, beide als “
Eigentlich ist es in der Regel nicht die Nachweisgrenze des Assays (analytische Empfindlichkeit), sondern die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse, die die untere Grenze der klinisch zuverlässigen Assay-Leistung in der Routinepraxis bestimmt.

1. Spencer CA. Thyroid profiling for the 1990s: free T4 estimate or sensitive TSH measurement. J Clin Immunoassay 1989; 12:82-9.
2. Spencer CA, et al. Interlaboratoriums-/Methodenunterschiede in der funktionellen Empfindlichkeit immunometrischer Assays für Thyreotropin (TSH) und Auswirkungen auf die Zuverlässigkeit der Messung subnormaler TSH-Konzentrationen. Clin Chem 1995;41:367-74. Nachdruck (Katalognummer ZD060) auf Anfrage bei DPC erhältlich.
*CLIA’88: der US Clinical Laboratory Improvement Act.