Antibiotikaempfindlichkeit von Indikatorbakterien Escherichia coli und Enterokokken spp. isoliert von Enten in der Gemeinde Morogoro, Tansania
Methoden
Studiengebiet und Entenprobenahme
Diese Querschnittsstudie wurde zwischen November 2014 und März 2015 in der Gemeinde Morogoro durchgeführt, wo 100 Moschusenten (Carina moschata) aus 26 Hinterhofherden beprobt wurden. Die Studienenten wurden nach dem Zufallsprinzip aus jeder Herde ausgewählt, wobei 5-10 % der Herdengröße beprobt wurden. Zu den beprobten Vögeln gehörten 86 weibliche und 14 männliche Enten. Vor der Probenahme wurden mithilfe eines Fragebogens grundlegende Informationen über Haltung, Fütterung, Verwendung und Entsorgung nicht verwendeter Antibiotika gesammelt (Additional file 1). Die ausgewählten Enten wurden manuell fixiert, und ein steriles Wattestäbchen wurde in die Kloake eingeführt, um Fäkalien zu sammeln. Die Proben wurden in einer Kühlbox mit Eisbeutel aufbewahrt und zur Analyse ins Labor der Sokoine University of Agriculture gebracht. Aus Gründen der Einheitlichkeit nahmen zwei Forscher, die von den Labortechnikern in der Entnahme von Tupferproben von Vögeln geschult worden waren, die Probenahme bei allen 100 Enten vor.
Isolierung und Identifizierung von E. coli und Enterokokken spp.
Die Kotproben wurden auf MacConkey-Agar (Oxoid, Basingstoke, UK) aufgebracht und 24 Stunden lang unter aeroben Bedingungen bebrütet, um E. coli zu isolieren. Verdächtige Kolonien wurden anhand der Koloniemorphologie, der Gram-Färbung und biochemischer Tests weiter identifiziert. Zur Isolierung von Enterokokken spp. wurden die Proben auf Slanetz-Bartley-Agar (Oxoid, Basingstoke, UK) plattiert und 48 Stunden lang unter aeroben Bedingungen bebrütet; die Identifizierung erfolgte anhand der Kolonienmorphologie und biochemischer Tests. Bei der Isolierung und Identifizierung wurden E. coli ATCC25922 und Enterococcus faecium ATCC 2912 als Kontrollstämme einbezogen.
Antibiotika-Empfindlichkeit
Alle E. coli- und Enterokokken-Isolate wurden mit der Scheibendiffusionsmethode auf Antibiotika-Empfindlichkeit getestet und gemäß CLSI ausgewertet. Die antimikrobielle Empfindlichkeit wurde auf einige Antibiotika getestet, die in Tansania in der Humanmedizin häufig verwendet werden. Für E. coli wurden vier Antibiotika in den angegebenen Konzentrationen getestet: Ampicillin 10 µg, Cefotaxim 30 µg, Trimethoprim-Sulphamethoxin 25 µg und Tetracyclin 30 µg. Enterokokken wurden gegen Ampicillin 10 µg, Erythromycin 15 µg, Rifampin 5 µg, Tetracyclin 30 µg und Trimethoprim-Sulfamethoxin 25 µg getestet. Alle Antibiotikaplättchen stammten von Oxoid, Basingstoke, UK.
Ethische Erwägungen
Die Erlaubnis zur Durchführung dieser Studie wurde vom städtischen Viehzuchtbeauftragten von Morogoro erteilt, und die ethische Genehmigung für die Studie wurde von den ethischen Ausschüssen der Sokoine University of Agriculture, Tansania, erteilt. Vor der Probenahme wurde von jedem der Landwirte eine mündliche Zustimmung eingeholt.
Ergebnisse
Von 100 Kotproben, die kultiviert wurden, wiesen 91 % E. coli auf, von denen 64 (70,3 %) eine Resistenz gegen verschiedene getestete Antibiotika zeigten (Tabelle 1). Mehrfache Antibiotikaresistenzen bei E. coli waren: 28 (30,8%) Isolate gegen vier Antibiotika, 35 (38,5%) gegen drei Antibiotika, 13 (14,3%) gegen zwei Antibiotika, 11 (12,1%) Isolate gegen ein Antibiotikum. Enterokokken wurden aus allen Proben isoliert, und 42 % zeigten eine Resistenz gegen verschiedene getestete Antibiotika. Fünf Prozent der Enterococcus-Isolate waren gegen alle Antibiotika resistent, 13% gegen vier Antibiotika, 21% gegen drei Antibiotika, 26% gegen zwei Antibiotika und 28% gegen ein getestetes Antibiotikum. Die Ergebnisse zur Entenhaltung und ihrem möglichen Zugang zu Antibiotikarückständen sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Von den 26 befragten Landwirten betrieben 92,3 % eine extensive Entenhaltung, bei der sie Zugang zu Dumpingplätzen hatten. Es wurde keine Verabreichung von Tierarzneimitteln an Enten gemeldet, aber die Befragten gaben an, andere Tiere mit Tetracyclinen/Oxytetracyclinen zu behandeln.
Diskussion
Die aktuelle Studie ergab, dass die E. coli-Isolationsrate 91 % betrug, während alle Enten Enterokokken bewohnten und die Isolate hohe Raten von Mehrfachantibiotikaresistenz aufwiesen. Diese Studie hat gezeigt, dass die Indikatorbakterien von frei fischenden Enten in Tansania für Studien zur Antibiotikaresistenz verwendet werden können. Dies deutet darauf hin, dass das Problem der Antibiotikaresistenz selbst bei Bakterienisolaten von Tieren, die nicht mit Antibiotika behandelt werden, weit verbreitet ist. Dies hat Auswirkungen auf die öffentliche Gesundheit, da Enten in der Umgebung von Gehöften nach Futter suchen und ihre Fäkalien überall absetzen, so dass die resistenten Bakterien in die Nahrungskette gelangen und den Menschen befallen oder das resistente Gen auf pathogene Bakterien übertragen werden kann.
Die geschätzte Prävalenz der Antibiotikaresistenz bei den in dieser Studie isolierten E. coli ist vergleichbar mit der in Malaysia berichteten Resistenz. In Nigeria wurde eine niedrige Prävalenz von 8,6 % festgestellt, was wahrscheinlich auf die Verwendung verschiedener Antibiotika wie Ofloxacin, Nalidixinsäure und Gentamycin zurückzuführen ist. Die hohe Prävalenz von Antibiotikaresistenzen, die in dieser Studie beobachtet wurde, ist wahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass Enten aufgrund ihrer breiten Verwendung ständig Antibiotikarückständen aus tierischen und menschlichen Ausscheidungen ausgesetzt sind. Studien zeigen, dass Antibiotika, die in der Tierernährung eingesetzt werden, im Darm nur schlecht absorbiert werden und die Ausgangsstoffe mit dem Kot ausgeschieden werden. Dies wird durch mehrere Studien bestätigt, in denen hohe Antibiotikarückstände in Abwässern und tierischen Ausscheidungen festgestellt wurden. Daher ist die normale Flora von Enten ständig Antibiotikarückständen ausgesetzt, was dazu führt, dass sie Resistenzen entwickeln, wie in dieser Studie beobachtet wurde.
Die E. coli-Resistenz gegen Ampicillin war im Vergleich zu anderen in der Studie verwendeten Antibiotika am höchsten (81%), ähnlich wie in einem früheren Bericht aus der Slowakei, wo die Resistenz 87,8% betrug. Im Allgemeinen zeigen Studien, dass 60-70 % der E. coli-Isolate eine Resistenz gegen Ampicillin entwickelt haben. Dies könnte auf die übermäßige Verwendung von Ampicillin in der menschlichen Praxis zurückzuführen sein, dessen Rückstände potenzielle Quellen für Umweltkontaminationen sind, die von Enten als Futter aufgenommen werden. Im Falle von Sulfamethoxin wurde eine Resistenz von 76 % festgestellt, wie sie zuvor von Van Tuat ermittelt wurde. Die antibakterielle Resistenz von Tetracyclin lag in dieser Studie bei 59 %, in der Slowakei bei 37,5 % und in Nigeria bei 75 %. Interessanterweise wiesen die E. coli auch eine antibakterielle Resistenz gegen Cefotaxim auf (63 %), ein Antibiotikum, das in Tansania bei der Behandlung von Tieren nicht häufig eingesetzt wird. Enten haben möglicherweise Zugang zu Cefotaxim-Rückständen in Mülldeponien, in denen sich menschliche Fäkalien und entsorgte Arzneimittelreste befinden (Tabelle 2). Allerdings wurde bei Bakterien, die aus der Kanalisation verschiedener Gesundheitseinrichtungen isoliert wurden, eine hohe Resistenz gegen Cefotaxim beobachtet.
In der Studie wurden auch Mehrfachresistenzen von E. coli gegen mehr als ein Antibiotikum beobachtet. Die Ergebnisse waren zu hoch, wenn man sie mit der in Vietnam durchgeführten Studie vergleicht, bei der die Mehrfachresistenz von E. coli gegen vier Antibiotika 16,7 %, gegen drei Antibiotika 20 % und gegen zwei Antibiotika 23,3 % betrug. Dieses Auftreten von Mehrfachresistenzen deutet darauf hin, dass Nutztiere eine Rolle als Reservoir resistenter Bakterien für die Umweltkontamination spielen. Es wurde festgestellt, dass Bakterienpopulationen, die aus dem Darm von Tieren isoliert wurden, die Antibiotika ausgesetzt waren, mit fünfmal höherer Wahrscheinlichkeit gegen ein bestimmtes Antibiotikum resistent sind. Die nicht resistenten Bakterien erwerben normalerweise die extrachromosomalen Antibiotikaresistenzplasmide (R-Plasmide) von den resistenten Bakterien, wenn sie in engem Kontakt stehen. Die beobachtete Resistenz kann auf den unvernünftigen Einsatz von Antibiotika zurückzuführen sein, durch den eine beträchtliche Menge an Rückständen in die Umwelt freigesetzt wird. Weitere Faktoren, die zur Entwicklung von Resistenzen führen, könnten die leichte Verfügbarkeit und der zügellose Einsatz von Breitspektrum-Antibiotika bei der präsumptiven Behandlung von Infektionen selbst in Gesundheitseinrichtungen sein. Die mangelnde Durchsetzung von Vorschriften über den Einsatz von Antibiotika als Teil von Infektionskontrollprogrammen könnte das Resistenzmuster in erheblichem Maße beeinflusst haben.
Enterokokken spp. sind natürliche Kommensalen des menschlichen und tierischen Darms. Alle untersuchten Enten wiesen Enterokokken spp. in ihrem Darminhalt auf, die eine Resistenzrate von 42 % gegenüber verschiedenen getesteten Antibiotika zeigten. Dennoch zeigten die Ergebnisse dieser Studie eine hohe Resistenz gegen Rifampin (62 %), Ampicillin (62 %) und Tetracyclin (42 %). Bei mehr als 65 % der Isolate wurde auch eine Mehrfachresistenz festgestellt. Wie bereits erwähnt, könnte die beobachtete Resistenz der Bakterien gegen die verschiedenen getesteten Antibiotika bei fehlender Verwendung der Arzneimittel bei Enten auf Rückstände zurückzuführen sein, die in die Umwelt gelangen, wo Enten leicht mit Antibiotika und anderen resistenten Bakterien in Kontakt kommen können. Wenn resistente Bakterien mit nicht resistenten Bakterien in Kontakt kommen, kann ein Austausch von genetischem Material stattfinden und das resistente Gen erworben werden. In anderen Studien wurde berichtet, dass aus Enten isolierte Enterokokken spp. eine Resistenz gegen Makrolide und Lincosamid-Antibiotika aufweisen. Enterococci spp. ist jedoch von Natur aus gegen mehrere Antibiotikagruppen, darunter Cephalosporine und Aminoglykoside, resistent. Darüber hinaus tragen viele Stämme übertragbare genetische Elemente für eine erworbene Resistenz gegen verschiedene Antibiotika wie Tetracyclin in sich. Andere Studien zur Antibiotikaresistenz von aus Enten isolierten Enterococci spp. wurden mit dem Antibiotikum Vancomycin durchgeführt. Weitere Empfindlichkeitsstudien von Enterococci spp. gegenüber Vancomycin werden für die Zukunft vorgeschlagen, da das Antibiotikum heutzutage ein gängiges Medikament in der Humanmedizin in Tansania ist.
Die Fragebogenstudie unterstützt die Laborbeobachtung der hohen Resistenzrate von E. coli und Enterococcus spp. Es wurde festgestellt, dass Antibiotika in der Behandlung von Tieren und Menschen weit verbreitet sind. Unabhängig von der Nichtverwendung von Tierarzneimitteln in der Dämmerung sind die Tiere durch die extensive Tierhaltung der Umwelt mit Antibiotikarückständen und anderen Bakterien von Tieren und Menschen ausgesetzt, die Antibiotika eingenommen haben. Dies wird durch die Feststellung gestützt, dass die beobachteten Resistenzen auf Antibiotika zurückzuführen sind, die üblicherweise bei Mensch und Tier eingesetzt werden (Tabelle 2). Die resistenten Bakterien wurden aus einer Vielzahl von Quellen isoliert, u. a. aus Abwässern und der Umwelt. Medikamentenreste und -behälter wurden achtlos in der Umgebung der Haushalte entsorgt, wodurch die Enten dem Antibiotikum ausgesetzt sein könnten. Daher kann die intensive Haltung von Enten dazu beitragen, die unnötige Exposition von Vögeln gegenüber Antibiotikarückständen zu minimieren.
Schlussfolgerung
Im Allgemeinen war die Antibiotikaresistenz von E. coli und Enterococcus spp. in dieser Studie hoch. Dies zeigt, dass Nutztiere und Hühner, die ständig mit Antibiotika behandelt werden, als potenzielle Hauptquellen für Antibiotikaresistenzgene bei aus Enten isolierten Bakterien eine Rolle spielen. Die Isolierung von multiresistenten E. coli und Enterococcus spp. aus Enten dient als potenzieller Überträger von antibiotikaresistenten Stämmen auf den Menschen und stellt ein ernsthaftes Problem für die öffentliche Gesundheit dar.
Grenzwerte
In dieser Studie wurden nur 100 Entenproben aus der Gemeinde Morogoro verwendet, was die Verallgemeinerung der Ergebnisse einschränkt, die als repräsentativ für den Status der Antibiotikaresistenz bei E. coli und Enterococcus spp. in Enten in Tansania gelten. Auch die Anzahl der getesteten Antibiotika war gering. Die Prüfung der Antibiotika-Empfindlichkeit von Bakterien mit Hilfe des Scheibendiffusionstests kann gegenüber der Mikrodilutionsmethode in der Brühe unterlegen sein. In der Studie wurden auch nicht die Resistenzgenotypen von E. coli und Enterococcus spp. bestimmt, die gegen verschiedene Arten von Antibiotika resistent waren. Das Vorhandensein anderer Tiere auf dem Gelände, auf dem die Entenproben entnommen wurden, wirkt sich jedoch als Störfaktor auf die Resistenzraten aus, die bei Bakterienisolaten von Enten beobachtet wurden.