[Antigen-Retrieval: Bedeutung und Nachteile in der Immunhistochemie]

Eines der größten Probleme in der Immunhistochemie besteht darin, sowohl eine gute Morphologie als auch die Immunreaktivität von Antigenen in Gewebeschnitten zu erhalten. Verschiedene Techniken zur Wiederherstellung der Immunreaktivität von Antigenen (Demaskierung) nach routinemäßigen Gewebepräparationen, wie Fixierung, Dehydrierung und Einbettung, wurden entwickelt und finden nun Anwendung für Immunfärbungen nicht nur bei zytohistologischen Untersuchungen, sondern auch bei pathoklinischen Diagnosen. In diesem Bericht wurden zunächst die Mechanismen und die Bedeutung der Fixierung und der Antigenrückgewinnung unter dem Gesichtspunkt der Proteininaktivierung untersucht. Zweitens wurden einige praktische Probleme und Hinweise zu zwei der gängigsten Demaskierungstechniken, dem Enzymverdau und dem hitzeinduzierten Epitop-Retrieval (HIER), besprochen, um die Techniken präzise an die Immunhistochemie anzupassen. Das größte Artefakt, das durch die Fixierung entsteht, ist die Maskierung von Gewebeantigenen aufgrund von Quervernetzungen zwischen den Aminosäureresten der Proteine. Es ist wichtig, für jedes Antigen eine geeignete Fixierungsbedingung zu wählen, die seine biochemische Natur und seine Resistenz gegenüber der Fixierung berücksichtigt. (Tabelle 2), und die Fixierungsbedingungen auf ein Minimum zu beschränken, damit die Immunreaktivität des Antigens durch verschiedene Demaskierungstechniken leicht wiedergewonnen werden kann (Tabelle 3, Abb. 1). Das Antigen-Retrieval an sich ist der Prozess, der die Denaturierung von Proteinen in Geweben verursacht, genau wie viele andere Proteininaktivierungsprozesse (Tabelle 1). Der Enzymverdau kann die maskierenden Teile der Proteine um ein Antigen herum anätzen, um dessen Epitop freizulegen. Obwohl der Enzymverdau relativ einfach ist und die Behandlungsbedingungen leicht zu kontrollieren sind, sind die Ergebnisse je nach Art oder Menge der Enzyme nicht unbedingt dramatisch und konsistent. Daher muss man sein eigenes Verdauungshandbuch finden, um das beste Färbeergebnis für jedes Antigen zu erzielen (z. B. Tabelle 4). So lieferte der Pepsin-Verdau die besten Ergebnisse bei der Immunfärbung von Brom-Desoxyuridin (BrdU) und proliferierendem Zellkern-Antigen (PCNA), während andere Enzyme kaum Wirkung zeigten (Tabelle 5). Die Erhitzung kann auch das Polypeptidgerüst spalten und die durch die Fixierung entstandenen Vernetzungen aufbrechen. Die Auswirkung der Erwärmung auf die Antigenrückgewinnung ist temperaturabhängig und scheint proportional zum Produkt aus Temperatur und Zeit zu sein. Im Falle der PCNA-Immunfärbung auf Paraformaldehyd-fixierten, in Paraffin eingebetteten Schnitten war eine Erhitzung auf 90 °C für mindestens 3 Minuten erforderlich. Mit zunehmender Erhitzung nahmen jedoch auch unspezifische Hintergrundfärbungen zu (Tabelle 6), was eines der größten Probleme bei der Antigenrückgewinnung darstellt (Abb. 2a, c). Eine Möglichkeit, solche unerwünschten Ergebnisse zu vermeiden, ist die Kombination aus suboptimaler Erhitzung (bei 80 Grad C für 10-15 Minuten) und Pepsinverdau (Abb. 2b, d). Eine wichtige theoretische Überlegung bei der Anwendung einer solch drastischen Denaturierungsmethode ist, ob die maskierten Antigenepitope angemessen freigelegt werden können, ohne dass es zu falsch-positiven (oder falsch-negativen) Ergebnissen mit zuvor vertrauten Antikörpern kommt. Es scheint, dass jedes Antigen eine „maßgeschneiderte“ Gewebepräparation benötigt, um seine Antigenität und präzise Lokalisierung optimal zu erhalten. Entsprechend der Entwicklung der Immunologie, Molekularbiologie, Genetik oder Embryologie dürfte der Bedarf an Mehrfach-Immunfärbungen in Kombination mit anderen Technologien wie der In-situ-Hybridisierung zunehmen, um die räumlichen und funktionellen Beziehungen zwischen verschiedenen Molekülen in situ zu analysieren. Die Antigenrückgewinnung würde dann zu einer leistungsfähigen Strategie.