Antikörper-Validierung
Antikörper-Validierung
Nicht alle Antikörper sind für jedes Experiment und Bedingung gültig, sie müssen für die jeweilige Anwendung und Spezies validiert werden. Derzeit gibt es kein Standardverfahren für die „Antikörper-Validierung“, was die Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit von Experimenten stark beeinträchtigen kann. Zeitschriften und Förderorganisationen haben Schritte unternommen, um diese Lücke zu schließen. Viele verlangen nun, dass ausdrücklich angegeben wird, wie ein Antikörper für eine bestimmte Verwendung validiert werden soll. Leider gibt es keine allgemeingültigen Kriterien für die Validierung von Antikörpern. Es liegt also an jedem Forscher, jeden einzelnen Antikörper für die vorgesehene Anwendung zu validieren.
Grundlegende Validierung
Zu den Standardmethoden der Antikörpervalidierung gehören Western Blot, ELISA, Durchflusszytometrie und IHC. Die meisten Forscher sind mit diesen bewährten Methoden vertraut. Der Validierungsprozess kann zeitaufwändig sein, da der Forscher oder der Hersteller den Antikörper für jede Anwendung validieren muss. Diese Schwierigkeit wird noch dadurch verstärkt, dass die Bedingungen der einzelnen Tests unterschiedlich sind. Ein Western Blot beispielsweise hängt von der Denaturierung der Proteine ab. So kann ein Western-Blot-validierter Antikörper unter denaturierenden Bedingungen gut funktionieren, aber Antigene in ihrer nativen Konformation (z. B. ELISA) nicht erkennen.1 Ebenso kann ein auf native Proteinaffinität validierter Antikörper dasselbe Antigen nach Denaturierung oder Fixierung nicht mehr binden.
Die oben genannten Methoden spielen eine wichtige Rolle bei der Validierung von Antikörpern. Wir können uns jedoch nicht ausschließlich auf diese Methoden verlassen, da sie die ständig wachsenden Anwendungen nicht abbilden. Das Vertrauensniveau der validierten Antikörper kann durch die Einbeziehung anderer Validierungstechniken erhöht werden.
Alte Techniken, neue Anwendungen
Um die Unzulänglichkeiten der grundlegenden Antikörpervalidierung zu beheben, hat sich kürzlich eine Gruppe von Wissenschaftlern zusammengefunden, um „eine Reihe von Standardrichtlinien für die Validierung von Antikörpern vorzuschlagen“.2 Sie schlagen vor, dass sich die Forscher zusätzlich zu den grundlegenden Methoden der Antikörpervalidierung auf konzeptionelle Säulen stützen. Dazu gehören genetische Strategien, unabhängige Antikörperstrategien und die Expression markierter Proteine.2
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Genetische Strategien: CRISPR-Cas9 und mehr
Genetische Strategien bestehen aus Techniken wieCRISPR-Cas9, RNAi und siRNA-Knockdown, die in Verbindung mit einem Proteindetektionsassay eingesetzt werden. Mit diesen Methoden wird jede unspezifische Bindung durch den fraglichen Antikörper nach Ausschalten oder Deaktivieren des entsprechenden Gens nachgewiesen. Wenn der Antikörper spezifisch ist, sollte in den ausgeschalteten bzw. ausgeschalteten Zelllinien kein oder ein vermindertes Signal des Antikörpers nachgewiesen werden.
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Unabhängiger Antikörperansatz
Die Verwendung unabhängiger Antikörper ist eine weitere Methode, mit der unspezifische Bindungen nachgewiesen werden können. Beim unabhängigen Antikörperansatz werden zwei verschiedene (unabhängige) Antikörper verwendet, die dasselbe Antigen, aber unterschiedliche Epitope binden. Deshalb sollten die zwei Antikörper das gleiche Erkennungsmuster und keine Off-Target-Bindung aufweisen.2 Diese Technik erfordert mehrere Proben für das Testen, um die variable Zielprotein-Expression zu kontrollieren, was teuer und zeitaufwendig werden kann.2 Zusätzlich hängt die Validierungstechnik von der Verfügbarkeit von mehreren Antikörpern ab, die verschiedene Epitope auf dem gleichen Zielprotein erkennen. GenScript bietet Epitop-Binning inMonoExpress™ mAb-Services, die „unabhängige Antikörper“ für Protein-Antigene enthalten.
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Tagged Protein Expression
Die Analyse der Detektion von getaggten Zielproteinen kann auch eine Möglichkeit bieten, die unspezifische Bindung der Antikörper zu messen. Bei dieser Methode werden die Zielproteine entweder mit einem Affinitäts-Tag (z. B. FLAG) oder einem fluoreszierenden Protein (z. B. GFP) modifiziert. Dann wird, ähnlich wie beim unabhängigen Antikörperansatz, das Erkennungsmuster des zu validierenden Antikörpers mit dem des Tag-spezifischen Antikörpers verglichen. Diese Methode ist zwar einfach, doch muss sichergestellt werden, dass die markierten Proteine in endogenen Mengen exprimiert werden, denn „eine Überexpression könnte die Erkennung von Off-Target-Bindungsereignissen verdecken“.2
Rekombinante Antikörper als Alternative zu monoklonalen Antikörpern?
Ein kürzlich ergangener Aufruf zum Handeln in Bezug auf die Validierung von Antikörpern schlug vor, dass Forscher nur rekombinante Antikörper anstelle von polyklonalen oder sogar monoklonalen Antikörpern verwenden. Monoklonale Antikörper werden mit Hybridom-Zelllinien hergestellt. Leider können Hybridom-Zelllinien absterben, ihre Antikörper kodierenden Gene verlieren oder nicht mehr wachsen, wenn sie aus dem Gefrierschrank genommen werden.3 Darüber hinaus können von Hybridomen produzierte monoklonale Antikörper an mehr als ein Ziel binden. Durch die Bestimmung der Sequenz des vom Hybridom kodierten Antikörpers und die rekombinante Herstellung des Antikörpers werden diese Probleme überwunden. Außerdem können rekombinante Antikörper aufgrund der definierten Sequenz eine weitere Validierungsebene im Vergleich zur alleinigen Anwendung der oben genannten Techniken bieten.3
Diese zusätzlichen Validierungsmethoden sollen „den Nachweis erbringen, dass ein Antikörper sein Ziel bindet, und in den meisten Fällen sollten sie auch die Bewertung einer potenziellen Kreuzreaktivität unter den getesteten Bedingungen ermöglichen“.2 Allerdings müssen die alten und neuen Strategien wahrscheinlich kombiniert werden, um einen Antikörper ordnungsgemäß zu validieren.
Auswahl der geeigneten Antikörper-Validierungsmethode
Wie wählt man bei all diesen Fragen rund um die Antikörper die geeignete Methode aus?
Zunächst muss man entscheiden, in welchem Assay man den Antikörper einsetzen will. Bei der CRISPR-Cas9-Methode zum Beispiel wird das Zielprotein nicht verändert, und es wird bestätigt, dass der Antikörper keine Kreuzreaktivität mit anderen Proteinen aufweist. Daher können Sie diese Technik zur Validierung von Antikörpern für eine Vielzahl von Assays verwenden, darunter Western Blot, IHC, Immunzytochemie (ICC), Durchflusszytometrie, ELISA, Immunpräzipitation (IP), Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) und Reverse-Phase-Protein-Assays.2 Aufgrund der Schwierigkeiten bei der Expression eines modifizierten Proteins wird die Validierung eines Antikörpers mit Hilfe der Expression eines markierten Proteins jedoch nur für Western Blots, IHC, ICC und Durchflusszytometrie empfohlen.
Zweitens muss sich der Forscher der Probenbeschränkungen solcher Validierungsmethoden bewusst sein. So können beispielsweise sowohl CRISPR-Cas9/KO als auch Techniken zur Expression markierter Proteine nicht zur Validierung von Antikörpern in menschlichen Gewebeproben und Körperflüssigkeiten wie Plasma und Serum verwendet werden.2 Das liegt daran, dass beim Menschen keine genetische Manipulation möglich ist, anders als bei Zelllinien.
Schließlich muss der Forscher, unabhängig vom Antikörper und der jeweiligen Validierungsmethode des Antikörperanbieters, mindestens eine Validierungsstrategie in seinem speziellen Anwendungs- oder Probenkontext durchführen.2
Die Validierung eines jeden Antikörpers für seine spezifische Anwendung und Spezies ist der Schlüssel zum Erreichen reproduzierbarer und zuverlässiger Ergebnisse. Die Informationen helfen Ihnen bei der Entscheidung, welche Methoden Sie in Ihrem Labor verwenden sollten. Für weitere Hilfe mit Antikörper-Validierung oder anderen Anwendungen, besuchen SieGenScript Antibody Technical Resources.
Angepasst von Inhalt erstellt von BitesizeBio im Auftrag von GenScript.