AP-Endonuklease EXO-3-Mangel verursacht Entwicklungsverzögerung und abnorme Vulvalorganogenese, Pvl, durch DNA-Glycosylase-initiierte Checkpoint-Aktivierung in Caenorhabditis elegans

Das Expressionsniveau von AP-Endonukleasen steigt nach dem L4-Stadium

Nach dem Schlüpfen entwickeln sich C. elegans über vier Larvenstadien (L1-L4), die jeweils durch eine Häutung unterbrochen werden, zu Erwachsenen. Die adulten Stadien werden weiterhin in zwei Stadien unterteilt: das Stadium des jungen Erwachsenen und das Stadium des graviden Erwachsenen. Um einen Einblick in die Rolle der AP-Endonukleasen nach der Embryogenese zu erhalten, haben wir die zeitliche Veränderung der mRNA-Expressionsmenge von exo-3 oder apn-1 gemessen. Nach 0, 24 und 48 Stunden, wenn sich die meisten N2-Würmer im Ei-Stadium, L1-Stadium bzw. L4-Stadium befinden, wurde kein Unterschied in der mRNA-Expression von exo-3 und apn-1 festgestellt (Abb. 1a,b). Nach 60 Stunden, wenn sich die meisten N2-Würmer im jungen Erwachsenenstadium befinden, waren die Expressionsniveaus von exo-3 und apn-1 etwa 13-fach bzw. 2,3-fach höher als nach 0 Stunden (Abb. 1a,b). Nach 72 Stunden, wenn sich die meisten N2-Würmer im graviden Erwachsenenstadium befinden, war das Expressionsniveau dasselbe wie nach 60 Stunden (Abb. 1a,b). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass AP-Endonukleasen nach der Embryogenese, insbesondere nach dem L4-Stadium, benötigt werden.

Die Exo-3-Mutanten weisen eine Entwicklungsverzögerung auf

Um den Beitrag der AP-Endonukleasen zur Entwicklung der Würmer von den L4- bis zu den adulten Stadien zu klären, wurden Würmer, denen eine oder beide AP-Endonukleasen (EXO-3 und APN-1) fehlten, ab dem Stadium des befruchteten Eies 3 Tage lang unter normalen Aufzuchtbedingungen inkubiert (Abb. 1c). Die Entwicklungsstadien L4, junger Erwachsener und gravider Erwachsener wurden anhand des Zustands der Vulva-Morphologie und des Ausbrütens der Eier unterschieden (Abb. 1d,f). Obwohl sich alle N2-Würmer zu graviden Adulten entwickelten, befanden sich nur 14 % der exo-3-Mutanten im graviden Adultenstadium, 85 % im jungen Adultenstadium und 1 % im Larvenstadium (Abb. 1g), was darauf hindeutet, dass ein EXO-3-Mangel zum Abbruch der Entwicklung oder zu einer Entwicklungsverzögerung führt. Im Gegensatz dazu wurden alle apn-1-Mutanten zu graviden Adulten, und die apn-1;exo-3-Mutanten befanden sich in fast denselben Entwicklungsstadien wie die exo-3-Mutanten (Abb. 1g). Zwölf Stunden später erreichten alle exo-3- und apn-1;exo-3-Mutanten das gravide Erwachsenenstadium (Daten nicht gezeigt), was darauf hindeutet, dass ein EXO-3-Mangel nicht zum Abbruch der Entwicklung im jungen Erwachsenenstadium führt, sondern lediglich zu einer Entwicklungsverzögerung. Um genau zu untersuchen, wie lang die Verzögerung bei den exo-3-Mutanten war, haben wir die Zeit bis zum Erreichen des graviden Erwachsenenstadiums jedes Wurms alle zwei Stunden gemessen und die Differenz der durchschnittlichen Zeit zwischen N2 (N = 8) und den exo-3-Mutanten (N = 16) berechnet. Der Unterschied betrug 6 Stunden.

Die Entwicklungsverzögerung der exo-3-Mutanten hängt von der DNA-Glykosylase NTH-1 ab

Es ist plausibel, dass der Phänotyp der Entwicklungsverzögerung der exo-3-Mutanten durch die Anhäufung von AP-Stellen oder 3′-blockierten SSB in der DNA verursacht wird, da diese Substrate für EXO-315 sind. Diese Strukturen in der DNA können durch DNA-Glykosylasen erzeugt werden. Von den beiden in C. elegans konservierten DNA-Glykosylasen erzeugt UNG-1 AP-Stellen durch monofunktionelle DNA-Glykosylase-Aktivität an Uracil in der DNA, und NTH-1 produziert 3′-blockierte SSB durch bifunktionelle DNA-Glykosylase-Aktivität an oxidativen Pyrimidin-Läsionen in der DNA. Daher untersuchten wir die Abhängigkeit der Verzögerung bei den exo-3-Mutanten von UNG-1 und NTH-1. Drei Tage nach der Entwicklung aus den Eiern befanden sich 9 % der ung-1;exo-3-Mutanten im graviden Erwachsenenstadium, 86 % im jungen Erwachsenenstadium und 5 % im Larvenstadium, und diese Anteile waren fast die gleichen wie bei den exo-3-Mutanten (11 % im graviden Erwachsenenstadium, 85 % im jungen Erwachsenenstadium und 4 % im Larvenstadium) (Abb. 2), was darauf hindeutet, dass die Verzögerung unabhängig von UNG-1 ist. Im Gegensatz dazu befanden sich 94 % der nth-1;exo-3-Mutanten im graviden Erwachsenenstadium und 6 % im jungen Erwachsenenstadium. Die nth-1;ung-1;exo-3-Mutanten zeigten ähnliche Ergebnisse (Abb. 2), was darauf hindeutet, dass die Verzögerung von NTH-1 abhängt.

Die Entwicklungsverzögerung der exo-3-Mutanten wird durch MMS und NaHSO3 verstärkt

Um zu klären, ob AP-Site-erzeugende Agenzien eine Entwicklungsverzögerung verursachen können, führten wir einen Entwicklungstest mit MMS und Natriumbisulfit (NaHSO3) durch (Abb. 3a). Es ist bekannt, dass MMS indirekt AP-Stellen erzeugt20,21 und dass es DNA-Läsionen im Genom von C. elegans hervorruft22. 3,5 Tage nach der Eiablage auf Platten, die 0,94 mM MMS enthielten, befanden sich 97 % von N2 im graviden Erwachsenenstadium und 3 % im Larvenstadium, während sich 61 % der exo-3-Mutanten im graviden Erwachsenenstadium, 34 % im jungen Erwachsenenstadium und 5 % im Larvenstadium befanden (Abb. 3b), was darauf hindeutet, dass MMS-induzierte AP-Stellen bei den exo-3-Mutanten eine weitere Entwicklungsverzögerung verursachen als bei N2. Andererseits befanden sich 93 % der apn-1-Mutanten im graviden Erwachsenenstadium, 6 % im jungen Erwachsenenstadium und 1 % im Larvenstadium, was mit den Ergebnissen für N2 vergleichbar ist (Abb. 3b). NaHSO3 schädigt die DNA hauptsächlich durch Desaminierung von Cytosin zu Uracil23. Vier Tage nach der Entwicklung aus dem Eistadium entwickelten sich alle exo-3-Mutanten, die nicht mit NaHSO3 behandelt wurden, zu graviden Adulten, aber 33 % der mit 10 mM NaHSO3 behandelten Mutanten befanden sich im graviden Adultenstadium, 12 % im jungen Adultenstadium und 55 % im Larvenstadium (Abb. 3c), was darauf hindeutet, dass NaHSO3 bei den exo-3-Mutanten zu einer Entwicklungsverzögerung führte. Diese Verzögerung war bei den ung-1;exo-3-Mutanten geringer, da 79 % der mit 10 mM NaHSO3 behandelten Mutanten im graviden Erwachsenenstadium, 14 % im jungen Erwachsenenstadium und 7 % im Larvenstadium waren (Abb. 3c), was darauf hindeutet, dass die NaHSO3-induzierte Entwicklungsverzögerung auf die UNG-1-Aktivität zurückzuführen ist. Insgesamt können AP-Stellen eine Entwicklungsverzögerung verursachen, ebenso wie 3′-blockierte SSB, die durch NTH-1 erzeugt werden.

Die Entwicklungsverzögerung der exo-3-Mutanten wird durch CHK-2 induziert

Wir stellten als nächstes die Hypothese auf, dass die durch DNA-Glykosylase ausgelöste Entwicklungsverzögerung der exo-3-Mutanten auf die Aktivierung des DNA-Schadenskontrollpunkts zurückzuführen ist, die durch von DNA-Glykosylasen erzeugte Spaltprodukte ausgelöst wird. Gene für den DNA-Schadenskontrollpunkt, wie chk-2 und clk-2, sind in C. elegans beschrieben worden24. Um unsere Hypothese zu testen, wurde der Entwicklungstest unter chk-2 (RNAi) oder clk-2 (RNAi) Bedingungen durchgeführt (Abb. 4a). Obwohl sich 14 % der exo-3;Kontrollwürmer (RNAi) im graviden Erwachsenenstadium und 84 % im jungen Erwachsenenstadium befanden und die exo-3;clk-2 (RNAi)-Würmer ähnliche Anteile aufwiesen (18 % im graviden Erwachsenenstadium und 82 % im jungen Erwachsenenstadium), befanden sich 93 % der exo-3;chk-2 (RNAi)-Würmer im graviden Erwachsenenstadium (Abb. 4b). Der Knockdown von chk-2 rettete also die Entwicklungsverzögerung in den exo-3-Mutanten, was darauf hindeutet, dass CHK-2 die Entwicklungsverzögerung in den exo-3-Mutanten auslöst.

EXO-3 verhindert die dut-1 (RNAi)-induzierte Pvl-Bildung

DUT-1 ist eine Desoxyuridintriphosphat-Nukleotidohydrolase (dUTPase), die dUTP zu dUMP hydrolysiert. Daher führt dut-1 (RNAi) zu einem Anstieg von dUTP im Nukleotidpool, das durch DNA-Replikation anstelle von dTTP in die DNA eingebaut wird, was zu einer Anhäufung von Uracil in der DNA führt25,26. Es wurde berichtet, dass dut-1 (RNAi) bei Wildtyp-N2-Würmern eine abnormale Vulvalorganogenese (Pvl) auslöst und dass die dut-1 (RNAi)-induzierte Pvl von UNG-127 abhängig ist. Wir vermuteten, dass ein Mangel an EXO-3 die Häufigkeit von dut-1 (RNAi)-induziertem Pvl erhöht, weil EXO-3 zur Reparatur von AP-Stellen nach der Spaltung von Uracil in der DNA durch UNG-1 benötigt wird. Um dies zu bestätigen, wurde die dut-1 (RNAi)-induzierte Pvl-Bildung in AP-Endonuklease-defizienten Mutanten beobachtet (Abb. 5a-c). Von den erwachsenen Tieren, die 4 Tage nach der Entwicklung aus den Eiern überlebten, waren 52 % Exo-3-Mutanten mit dut-1 (RNAi)-induziertem Pvl und 13 % waren N2-Würmer mit Pvl (Abb. 5d), was darauf hindeutet, dass EXO-3-Mangel eine Zunahme von dut-1 (RNAi)-induziertem Pvl verursacht. Andererseits hatten 15 % der apn-1-Mutanten Pvl, was dem Anteil der N2-Würmer mit Pvl entspricht (Abb. 5d). Die apn-1;exo-3-Mutanten und exo-3-Mutanten wiesen einen ähnlichen Anteil auf, wobei 52 % Pvl hatten (Abb. 5d).

Die Zunahme der dut-1 (RNAi)-induzierten Pvl in den exo-3-Mutanten ist unabhängig von NTH-1 von UNG-1 abhängig

Um zu untersuchen, ob die Zunahme der dut-1 (RNAi)-induzierten Pvl in den exo-3-Mutanten durch UNG-1-Aktivität zustande kam, untersuchten wir die Abhängigkeit des Phänotyps von UNG-1. Der Prozentsatz der ung-1;exo-3-Mutanten mit Pvl betrug 2 %, was dem der ung-1-Mutanten mit Pvl (1 %) entsprach (Abb. 6a), was darauf hindeutet, dass die Zunahme von Pvl in den exo-3-Mutanten nur auf die UNG-1-Expression zurückzuführen ist.

Als nächstes untersuchten wir, ob die von UNG-1 produzierten Spaltprodukte benötigt werden, um Pvl zu induzieren, d.h. ob AP-Stellen über die AP-Lyase-Aktivität von NTH-1 in 3′-blockierte SSB umgewandelt werden. Der Prozentsatz der exo-3-Mutanten mit Pvl war vergleichbar mit dem der nth-1;exo-3-Mutanten (Abb. 7b), was darauf hindeutet, dass NTH-1 für das dut-1 (RNAi)-induzierte Pvl nicht notwendig ist.

Die Zunahme von dut-1 (RNAi)-induziertem Pvl in den exo-3-Mutanten wird durch CHK-2 angetrieben

Wir stellten die Hypothese auf, dass die UNG-1-abhängige Zunahme von dut-1 (RNAi)-induziertem Pvl in den exo-3-Mutanten über eine DNA-Checkpoint-Aktivierung erfolgen kann, die durch von UNG-1 produzierte Spaltprodukte zusätzlich zur Entwicklungsverzögerung angetrieben wird. Es wurde auch berichtet, dass dut-1 (RNAi)-induziertes Pvl durch die Checkpoint-Kinase CLK-227 verursacht wird. Daher untersuchten wir, ob der Anstieg des durch dut-1 (RNAi) induzierten Pvl in den exo-3-Mutanten von CHK-2 und CLK-2 abhängig ist. Obwohl 49 % der exo-3;Kontrollwürmer (RNAi) dut-1 (RNAi)-induziertes Pvl aufwiesen, waren es nur 10 % der exo-3;chk-2 (RNAi)-Würmer (Abb. 6b). Andererseits war der Anteil der exo-3;clk-2 (RNAi)-Würmer mit Pvl fast derselbe (44 %) wie der der exo-3;control (RNAi)-Würmer. Der Knockdown von chk-2 rettete also den Anstieg der dut-1 (RNAi)-induzierten Pvl in den exo-3 Mutanten, wie er bei der Entwicklungsverzögerung beobachtet wurde. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Anstieg von dut-1 (RNAi)-induziertem Pvl in den exo-3-Mutanten über die CHK-2-Expression erfolgt.

Oxidative DNA-schädigende Agenzien erhöhten den Anteil von Pvl in den exo-3-Mutanten nur, wenn sie mit dut-1 (RNAi) kombiniert wurden

Um andere DNA-schädigende Agenzien zu untersuchen, die einen Anstieg von Pvl in den exo-3-Mutanten verursachen, haben wir untersucht, ob die Pvl-Bildung durch oxidative DNA-schädigende Agenzien wie ndx-1 (RNAi), ndx-2 (RNAi) und Methylviogen (MV) erhöht wird. NDX-1 und NDX-2 hydrolysieren 8-oxo-dGDP zu 8-oxo-dGMP24,28. Dementsprechend führen ndx-1 (RNAi) und ndx-2 (RNAi) zu einem Anstieg von 8-oxo-dGDP im Nukleotidpool. Das Vorhandensein von 8-oxo-dGDP reduziert die 8-oxo-dGTPase-Aktivität von NDX-4, wodurch sich 8-oxo-dGTP im Pool anreichert24. 8-oxo-dGTP wird während der DNA-Replikation in die DNA eingebaut, was zu einer Anhäufung von 8-oxoG in der DNA führt24,28. MV erzeugt Superoxidradikale, die anschließend oxidative Läsionen in der DNA verursachen29. Die einmalige Behandlung mit ndx-1 (RNAi), ndx-2 (RNAi) oder MV hatte jedoch keine Auswirkungen auf das Auftreten von Pvl in den exo-3-Mutanten. (Daten nicht gezeigt). Als nächstes untersuchten wir, ob jedes oxidative DNA-schädigende Agens in Kombination mit der dut-1 (RNAi)-Behandlung den Anstieg von Pvl in den exo-3-Mutanten weiter verstärkte (Abb. 7a). Jede der getesteten Behandlungen verstärkte den Anstieg der dut-1 (RNAi)-induzierten Pvl in den exo-3-Mutanten um etwa 10 % (Abb. 7b), was darauf hindeutet, dass oxidative Läsionen in der DNA ebenfalls einen Anstieg von Pvl verursachen können.

In In-vitro-Experimenten wurde festgestellt, dass NTH-1 eine schwache DNA-Glycosylase-Aktivität gegenüber 8-oxoG in der DNA besitzt, zusätzlich zu seiner viel höheren Aktivität gegenüber oxidativen Pyrimidin-Läsionen30. Daher vermuten wir, dass der stärkere Anstieg des dut-1 (RNAi)-induzierten Pvl durch die zusätzlichen oxidativen Agenzien von der Aktivität von NTH-1 abhängt. Obwohl wir die Abhängigkeit des Phänotyps von NTH-1 bestätigten, änderte der NTH-1-Mangel nicht den Anteil der Würmer, die Pvl aufwiesen (Abb. 7b).