Apc-verwandte Modelle der intestinalen Neoplasie: ein kurzer Überblick für Pathologen

Das kolorektale Karzinom ist in der westlichen Welt eine häufige Ursache der Krebssterblichkeit. In vielen Pathologiepraxen machen kolorektale Adenome, die im Rahmen von Screening-Koloskopien entfernt werden, einen hohen Prozentsatz des täglichen Arbeitspensums aus, so dass die Morphologie des menschlichen kolorektalen Karzinoms und der Adenome, seiner Vorläuferläsionen, den chirurgischen Pathologen vertraut ist. In akademischen Zentren können chirurgische Pathologen gebeten werden, Mausmodelle von Neoplasien für Prüfärzte zu interpretieren, und ein grundlegendes Verständnis der Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen der Morphologie menschlicher Darmneoplasien und Mausmodellen ist für eine genaue Interpretation erforderlich.

Genetisch veränderte Mausmodelle der Tumorentstehung werden zwar manchmal wegen ihrer unvollkommenen Modellierung menschlicher Krankheiten kritisiert, sind aber nützlich, um zu beurteilen, ob bestimmte Mutationen zur Tumorbildung führen können, für Studien zur Chemoprävention und zur Aufklärung der Funktionalität veränderter Genprodukte. In der wissenschaftlichen Literatur werden zahlreiche gentechnisch veränderte Mausmodelle (GEM) für Darmneoplasien beschrieben, die sich grob in fünf Gruppen einteilen lassen: Apc-verwandte Modelle mit Veränderungen in der Wnt-Signalübertragung, Mismatch-Reparatur-defiziente Modelle, mit Karzinogenen behandelte Modelle, Modelle mit Veränderungen im transformierenden Wachstumsfaktor β und Kolitis-assoziierte Neoplasien, die in immundefizienten Modellen wie IL10-/- Mäusen auftreten. Diese Übersicht konzentriert sich auf die Pathologie eines der ersten GEM-Modelle für intestinale Neoplasien, der ApcMin+/- Maus und verwandter Modelle, mit dem Ziel, die morphologischen Merkmale der intestinalen Läsionen zu beschreiben und sie mit menschlichen kolorektalen Adenomen und Karzinomen zu vergleichen.

Eines der am häufigsten verwendeten Modelle für humane intestinale Neoplasien ist das ApcMin+/- Modell, das 1990 im Labor von William Dove entwickelt wurde (Moser et al., 1990). Die ApcMin+/- Maus, das erste Keimbahn-Mausmodell für intestinale Neoplasien, trägt eine autosomal-dominante Funktionsverlustmutation am Apc-Codon 850, die durch die Exposition gegenüber N-Ethyl-N-Nitrosoharnstoff (ENU), einem hochwirksamen Mutagen, hervorgerufen wurde. Seither wurde eine Reihe weiterer Modelle mit Apc-Mutation, viele mit verkürzenden Mutationen, entwickelt (Tabelle 1).

Diese Apc-verwandten Modelle sind besonders nützlich, weil die häufigste Treibermutation für kolorektales Karzinom beim Menschen eine Mutation im Tumorsuppressorgen APC ist, Dies führt zur Inaktivierung von APC und zur Aktivierung des Wnt-Signalweges mit Stabilisierung von β-Catenin und dessen Verlagerung in den Zellkern. Das APC-Gen beim Menschen kodiert ein 213-Kilodalton-Protein, das an der Zelladhäsion und -motilität, der Regulierung des Zellzyklus, der Apoptose und der Signaltransduktion beteiligt ist (Boman & Fields, 2013), und seine Keimbahnmutation führt zur familiären Adenomatose polyposis coli (FAP). Dieses Krebsprädisposition-Syndrom ist durch die Entwicklung von Hunderten von kolorektalen Adenomen gekennzeichnet, die in jungen Jahren zu einem Adenokarzinom führen. Die meisten Mutationen, die FAP verursachen, liegen in der 5′-Hälfte des Gens und führen zu verkürzten Polypeptiden.

Genetik von APC-verwandten Tiermodellen

Viele der Apc-verwandten Mausmodelle wurden so konstruiert, dass sie Keimbahnmutationen in Apc enthalten, die zur Expression eines verkürzten Apc-Proteins führen; in den meisten dieser Modelle sind nur Heterozygoten lebensfähig, da Homozygotie embryonal tödlich ist. Der Verlust der Wachstumskontrolle bei Verlust der verbleibenden Wildtyp-Kopie von Apc führt zu multiplen Darmadenomen. Der spezifische Ort der Apc-Mutation beeinflusst die Polypenvielfalt, den Ort und die Langlebigkeit der Mäuse (McCart et al., 2008). So weist die Apc1638N/+-Maus im Vergleich zur ApcMin/+-Maus eine geringere Polypenbelastung und eine längere Lebenserwartung auf (Smits et al., 1998). In der Apc1322T-Maus behält das mutierte Protein eine 20-Aminosäure-β-Catenin-Bindungs-/Abbau-Repeat (in der ApcMin/+-Maus gibt es keine); Adenome in diesen Mäusen sind im Vergleich zu ApcMin/+-Mäusen früher nachweisbar, haben eine schwerere Dysplasie und sind größer (Pollard et al., 2009). Der Zeitpunkt des Apc-Funktionsverlusts kann ebenfalls wichtig sein; so führt beispielsweise ein schrittweiser Apc-Verlust mittels Apc(Min/CKO) oder Apc(1638N/CKO) zu grob sichtbaren Neoplasien im Darm, während ein gleichzeitiger Verlust zu einer okkulten klonalen Expansion durch Kryptenspaltung ohne morphologische Transformation führt (Fischer et al., 2012). Die Deletion des gesamten Apc-Gens in der ApcΔel-15-Maus führt im Vergleich zur Apc-Trunkierung zu einer schnelleren Tumorentwicklung, einer geringeren Überlebensrate, einer stärkeren Polyposis und einer fortgeschritteneren Progression von Dickdarmtumoren im Vergleich zu ApcMin/+-Mäusen (Cheung et al, 2010).

Genetisch veränderte Rattenmodelle mit Apc-Mutation stehen ebenfalls zur Verfügung und sind aufgrund der Langlebigkeit der Modelle und der relativ einfachen Durchführung der Koloskopie, die Längsschnittuntersuchungen ermöglicht, attraktiv (Tabelle 2). Die bekanntesten sind die Kyoto Apc Delta (KAD)-Ratte und die Pirc-Ratte. Die KAD-Ratte wurde durch ENU-Mutagenese gewonnen und weist eine Nonsense-Mutation am Codon 2523 im Exon 15 von Apc auf, die zu einem verkürzten Protein führt. Diese Ratten sind im homozygoten Zustand lebensfähig und entwickeln spontan keine Darmtumore. Eine Behandlung mit Azoxymethan und Dextransulfat-Natrium (AOM/DSS) ist notwendig, um Darmneoplasien zu induzieren. Die Pirc-Ratte, die ebenfalls durch ENU-induzierte Mutagenese erzeugt wurde, weist eine Apc-Mutation am Nukleotid 3409 auf, die ein verkürztes Protein erzeugt. Diese Mutation ist im homozygoten Zustand embryonal tödlich. Die Mutation hat eine 100%ige Penetranz, wobei alle Ratten nach einem Alter von 4 Monaten Dickdarmpolypen entwickeln.

Ein genetisch verändertes Schweinemodell, das eine APC 1311-Mutation trägt, die ortholog zum menschlichen APC 1309 ist, wurde entwickelt. Diese Tiere entwickeln aberrante Kryptenherde, einzelne Kryptenadenome und multiple kolorektale Adenome, ähnlich wie bei der menschlichen FAP. Die größeren Adenome weisen eine Progression in Form einer hochgradigen Dysplasie auf. Charakteristisch ist eine Oberflächenbeteiligung, ähnlich wie bei menschlichen Adenomen (Flisikowska et al., 2012).

Modifikatoren des Krebsphänotyps

Seit langem ist bekannt, dass Rassenunterschiede eine signifikante Auswirkung auf die Tumorlast im ApcMin+/–Modell haben, das normalerweise auf einem C57Bl/6J-Hintergrund gehalten wird. Die Kreuzung von B6 Min/+ Mäusen mit AKR und anderen Inzuchtstämmen führte zu einem Rückgang der durchschnittlichen Tumorzahl bei den F1-Mäusen (Shoemaker et al., 1997). Rückkreuzungsexperimente und andere genetische Analysen zur Kartierung von Modifier-Loci haben eine Reihe von Modifier of Min (Mom) Kandidatengenen hervorgebracht (McCart et al., 2008). Darüber hinaus haben die Ernährung und das Darmmikrobiom der Mäusekolonie wichtige Auswirkungen auf die Vermehrung, Entwicklung und Größe von Polypen. So hat sich beispielsweise gezeigt, dass eine fettreiche, ballaststoffarme westliche Ernährung die Polypenzahl und die Tumorprogression bei ApcΔ716/+-Mäusen erhöht (Hioki et al., 1997).

Pathologie

Die Morphologie der Darmläsionen in ApcMin+/- und verwandten Modellen ist bei allen Modellen ähnlich, obwohl das Alter des Auftretens, der Grad der Dysplasie und die Verteilung im Magen-Darm-Trakt variieren (Tabelle 1). Die frühesten erkennbaren Läsionen bestehen aus einer einzelnen vergrößerten Krypta oder einer kleinen Gruppe von Krypten, die von überfüllten Zellen mit erhöhtem Kern-Zytoplasma-Verhältnis und Kernhyperchromasie ausgekleidet sind (Abb. 1). Bei diesen frühen Läsionen handelt es sich um niedriggradige dysplastische Läsionen, die den kleinen tubulären Kolonadenomen ähneln, die bei Patienten mit FAP auftreten. Im Dünndarm entwickelt sich eine kleine Einstülpung in der Lamina propria in der proliferativen Zone an der Grenze zwischen Krypta und Zotten (Abb. 2). Die adenomatösen Zellen schieben sich in die Lamina propria und bis in die Zotten und bilden eine doppelte Schicht adenomatösen Epithels unter einer normalen Oberflächenschleimhaut (Abb. 3). Im Dickdarm wuchern die frühen Adenome in die Lamina propria zwischen den Krypten ein, obwohl auch Adenome in einzelnen Krypten gefunden werden können (Oshima et al., 1997). Die Immunhistochemie für Beta-Catenin kann bei der Identifizierung früher Adenome helfen, da selbst einzelne Kryptenadenome in ApcMin+/- und verwandten Modellen eine Akkumulation von nukleärem Beta-Catenin aufweisen (Abb. 4).

Wenn die Adenome wachsen, bilden sie polypoide, gestielte oder manchmal becherförmige Läsionen mit einem depressiven Zentrum (Abb. 5a und b). 5a und b). In vielen Modellen gehen die Adenome nicht über eine geringgradige Dysplasie hinaus. In länger lebenden Modellen mit weniger Tumoren entwickeln einige jedoch eine hochgradige Dysplasie, die durch eine kribriforme Architektur gekennzeichnet ist, bei der nicht alle Zellen in Kontakt mit einer Basalmembran stehen (Abb. 6). Zahlreiche mitotische Figuren und apoptotische Körper sind in Adenomen in allen Entwicklungsstadien üblich.

Die in ApcMin+/- und verwandten Modellen auftretenden Darmneoplasmen enthalten mehrere Zelltypen, bestehen aber hauptsächlich aus Zellen vom absorbierenden Typ und Becherzellen (Tabelle 3). Adenome, die im Dünndarm von ApcMin+/- und verwandten Modellen entstehen, enthalten Paneth-Zellen, die in der Hämatoxylin- und Eosinfärbung leicht zu identifizieren sind (Abb. 7) und durch Immunhistochemie für Lysozym hervorgehoben werden. Es wurde nachgewiesen, dass sie 10 % oder weniger der Zellen in Dünndarmadenomen ausmachen (Moser et al., 1992). Der Dickdarm der Maus enthält keine Paneth-Zellen, aber Lysozym-exprimierende Zellen ohne PAS-Positivität wurden in Dickdarmadenomen in diesen Modellen identifiziert, was auf eine Paneth-Zell-ähnliche Differenzierung auch in Dickdarmläsionen schließen lässt (Moser et al., 1992; Husoy et al., 2006). Neuroendokrine Zellen machen einen kleinen Anteil der Zellen in Adenomen vom Typ ApcMin+/- aus, aber der spezifische Zelltyp spiegelt die neuroendokrinen Zellen wider, die in der normalen Darmschleimhaut an der Stelle des Adenoms zu finden sind (Moser et al., 1992). So sind beispielsweise Serotonin-exprimierende Zellen die häufigsten neuroendokrinen Zellen im Mausdarm und kommen überall vor; solche Zellen machen bis zu 5 % der ApcMin+/- Adenomzellen in Läsionen von Dünn- und Dickdarm aus (Moser et al., 1992). PYY-positive Zellen werden dagegen nur in Adenomen aus dem distalen Kolon gefunden, was die normale Verteilung dieser Zellen widerspiegelt. Neuroendokrine Zellen sind diffus über die Adenome verstreut und bilden keine kleinen Cluster wie die Lysozym-positiven Zellen (Moser et al, 1992).

Die Dysplasie in intestinalen Adenomen in Mausmodellen sollte unter Verwendung derselben Terminologie (niedriggradige Dysplasie, hochgradige Dysplasie, intramukosales Karzinom) und Kriterien wie für menschliche kolorektale Adenome eingestuft werden (Washington et al., 2013). Die meisten Adenome in der ApcMin+/- Maus und verwandten Modellen weisen eine niedriggradige Dysplasie auf, aber viele werden mit zunehmendem Alter der Maus immer größer, und einige wenige entwickeln sich in der Abfolge Adenom-Karzinom. Invasive Karzinome sind selten, da die meisten Mäuse vor der Progression an Anämie oder Darmverschluss sterben. Allerdings entwickeln einige der längerlebigen Modelle mit weniger Adenomen ein in die Submukosa invasives Adenokarzinom (Colnot et al., 2004; Fodde et al., 1994; Robanus-Maandag et al., 2010). Metastasen treten in ApcMin+/- Mäusen nicht auf und sind in verwandten Modellen äußerst selten (Fodde et al., 1994).

Chirurgische Pathologen, die mit der Analyse von Darmproben beauftragt sind, sollten sich eines Fallstricks bei der Beurteilung der Tumorinvasion in Mausmodellen bewusst sein. Da die Schichten des Mäusedarms dünn und empfindlich sind, kommt es häufig zu einer Herniation von gutartigem Epithel in die Submukosa (Boivin et al., 2003), insbesondere im Rahmen eines Rektumprolapses und bei entzündlichen Zuständen (Abb. 8a und b). Eine ähnliche Verdrängung der adenomatösen Mukosa (Pseudoinvasion) tritt bei gestielten kolorektalen Adenomen beim Menschen und bei der Colitis cystica profunda auf. Konsensrichtlinien für die Unterscheidung zwischen Herniation und invasivem Adenokarzinom wurden auf einem Workshop über Mausmodelle für intestinale Neoplasien in den Jackson Laboratories im Jahr 2000 von einer Gruppe von Wissenschaftlern und Pathologen entwickelt (Boivin et al., 2003) und sind in Tabelle 4 zusammengefasst. Es ist möglicherweise nicht möglich, ein invasives Karzinom mit Sicherheit zu diagnostizieren, insbesondere in entzündlichen Modellen oder in Bereichen mit Prolaps, und die Bewertung älterer Mäuse mit besser entwickelten Läsionen kann für eine eindeutige Bestimmung der Invasion erforderlich sein.

Die Invasion in die Lamina propria ist durch die Entwicklung von winkelförmigen Kryptenprofilen mit einzelnen infiltrierenden Zellen gekennzeichnet und kann mit Stromaveränderungen wie Desmoplasie und erhöhter Entzündungszelldichte einhergehen (Abb. 9a und b).