Aporphinalkaloide aus Ocotea macrophylla (Lauraceae)
ARTIGO
Aporphinalkaloide aus Ocotea macrophylla (Lauraceae)
Ludy Cristina Pabon*; Luis Enrique Cuca
Departamento de Química, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Bogotá, KR 30 45 03, Kolumbien. AA 14490
ABSTRACT
Vier Aporphinalkaloide aus dem Holz von Ocotea macrophylla (Lauraceae) wurden isoliert und als (S)-3-Methoxy-Nordomesticin (1) charakterisiert, (S)-N-Ethoxycarbonyl-3-methoxynordomestizin (2), (S)-N-Formyl-3-methoxynordomestizin (3) und (S)-N-Methoxycarbonyl-3-methoxynordomestizin (4); Die Alkaloide 2-4 werden zum ersten Mal beschrieben. Die Struktur der isolierten Verbindungen wurde auf der Grundlage ihrer Spektraldaten und durch Vergleich ihrer Spektraldaten mit in der Literatur beschriebenen Werten bestimmt. Die Alkaloidfraktion und Verbindung 1 zeigten antimykotische Aktivität gegen Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici und auch Verbindung 1 zeigte antimikrobielle Aktivität gegenüber Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis sowie.
Schlüsselworte: Ocotea macrophylla; Aporphinalkaloide; Lauraceae.
INTRODUCTION
Die Gattung Ocotea (Lauraceae) umfasst mehr als 350 Arten, die auf dem amerikanischen Kontinent und im südlichen Afrika vorkommen.1,2 In Kolumbien gibt es 35 Ocotea-Arten, die über das ganze Land verteilt sind, vor allem in den Andenwäldern.3 In der traditionellen Medizin finden einige Ocotea-Arten unterschiedliche Anwendung. O. quixos wird als Desinfektionsmittel, Lokalanästhetikum und Antidiarrhoikum verwendet.4 O. lancifolia wird als Antiparasitikum eingesetzt, und O. caparrapi wird zur Behandlung von Insektenstichen, Schlangenbissen, Bronchitis und Krebstumoren verwendet.5,6
Chemisch ist die Gattung Ocotea vor allem als Quelle von Metaboliten des Typs Furofuran7 und Tetrahydrofuran-Lignane,8 Bicyclooctan9 und Benzofuran-Neolignane,10 sowie Benzylisochinolin11 und Aporphinalkaloide bekannt.5 In früheren Studien wurden vier Aporphinalkaloide aus dem Holz von Ocotea macrophylla isoliert und als Nantenin, Glaucin, Isocorydin und Dehydronantenin identifiziert.12,13 In dieser Arbeit beschreiben wir die Isolierung und Strukturbestimmung von drei neuen Aporphinalkaloiden 2-4 neben (S)- 3-Methoxy-Nordomesticin 1 und die Berichte über antibakterielle und antimykotische Aktivitäten der Verbindungen.
ERGEBNIS UND DISKUSSION
Der ethanolische Extrakt aus dem Stamm von O. macrophylla wurde einer Säure-Base-Extraktion unterzogen, um eine Alkaloidfraktion zu erhalten, die weiter fraktioniert und durch chromatographische Methoden gereinigt wurde, was zur Isolierung von vier Alkaloiden führte: (S)-3-Methoxynordomestizin (1), (S)-N-Ethoxycarbonyl-3-Methoxynordomestizin (2), (S)-N-Formyl-3-Methoxynordomestizin (3) und (S)-N-Methoxycarbonyl-3-Methoxynordomestizin (4). Die Strukturen der Alkaloide 1-4 sind in Abbildung 1 und die spektroskopischen Daten in Tabelle 1 dargestellt.
Das Signal bei δH 6.30 (1H, s) zeigte im HMQC-Experiment keine Konnektivität, was auf das Vorhandensein einer phenolischen OH-Gruppe hinweist, was durch IR bestätigt wird. Die Analyse des HMQC-Spektrums erlaubte die Lokalisierung von Substituenten, entsprechend den beobachteten Korrelationen zwischen den Signalen bei δH 5.94 und 5.95 (für die Methylendioxygruppe) mit den Signalen bei δC 145.9 (C-9) und 146.2 (C-10) und den beiden letztgenannten Signalen mit den Protonen bei δH 6.70 (H-8) bzw. 7.90 (H-11), was auf das Vorhandensein einer Methylendioxygruppe an den Positionen 9 und 10 und zweier Wasserstoffatome am aromatischen Ring in para-Orientierung schließen lässt. Das Vorhandensein der Hydroxylgruppe an Position 1 wurde anhand von Korrelationen zwischen den Signalen bei δH 6,30 und δC 116,5, die C-11b zugeordnet sind, bestimmt. Die Lage der Methoxylgruppen in den Positionen C-2 und C-3 wurde anhand der Korrelation der Wasserstoffe bei δH 3,96 und 3,86 mit den Kohlenstoffen bei δC 138,4 (C-2) bzw. δC 147,8 (C-3) bestimmt.
Die absolute Konfiguration von C-6a wurde als S bestimmt, da es einen negativen Cotton-Effekt bei 280 nm und einen positiven Cotton-Effekt bei 240 nm in der CD-Kurve aufweist.17 Zusätzlich wurde dies durch den positiven Wert der optischen Drehung 25D = +51,7 (c 0,38, CHCl3) bestätigt.18 Daher wurde das Alkaloid 1 als (S)-3-Methoxy-Nordomesticin bestimmt, ein Aporphin-Alkaloid, das zuvor aus Nectandra sinuata19 berichtet wurde und ebenfalls zur Familie der Lauraceae gehört. Dieser Bericht korrigiert und vervollständigt die spektroskopischen Daten dieser Verbindung.
Alkaloid 2 wurde als gelbes Öl erhalten, das positiv auf das Dragendorff-Reagenz reagiert und dessen optischer Drehwert 25D 25D = +33,3 (c 0,60, CHCl3) beträgt. Das UV- und IR-Spektrum von 2 ähnelte dem von 1, mit der Ausnahme, dass in beiden Spektren Absorptionen aufgrund einer Carbamatgruppe bei 282 nm bzw. bei 1688 cm-1 auftraten.20 Die 1H- und 13C-NMR-Spektren zeigten ein ähnliches Profil wie das von 1. Im 1H-NMR erschienen zwei neue Signale bei δH 4.29 (2H, m) und 1.29 (3H, m) sowie die Verschiebung des Signals H-5 aufgrund der Anwesenheit einer Schutzgruppe in der Nähe. Das COSY-Experiment zeigte die Korrelation der Signale δH 4,29 und 1,29, was auf das Vorhandensein einer Ethylgruppe hinweist, die aufgrund ihrer Verschiebung an ein Heteroatom gebunden sein könnte. Die 13C-NMR- und DEPT-Spektren zeigten das Auftreten von drei neuen Signalen bei δC 158,8 (C), 61,0 (CH2) und 14,8 (CH3), typische Signale für eine an ein Stickstoffatom gebundene Ethoxycarbonylgruppe. Die absolute Konfiguration von C-6a wurde als S bestimmt, da es die gleichen Cotton-Effekte wie 1 zeigte. Daher wurde die Alkaloidverbindung 2 als (S)-N-Ethoxycarbonyl-3-methoxy-nordomesticin identifiziert. Sein ESIMS-Spektrum zeigte einen pseudomolekularen Ionenpeak bei m/z 414 +, der der Molekülformel C22H22NO7 entspricht, und Fragmentierungen waren auf den Verlust von CH3OH und CH3CH2OH bei m/z 382 + bzw. m/z 368 + zurückzuführen. Das ESI-Spektrum im negativen Ionenmodus zeigte Peaks bei m/z 412 – und m/z 383 ., wobei der letzte den Verlust einer Ethylgruppe darstellt. Diese Art von Alkaloiden mit N-Ethoxycarbonyl-Substituenten wurde aus Lindera angustifolia (Lauraceae) isoliert.21
Alkaloid 3 wurde als gelbes Öl mit einem optischen Rotationswert von 25D 25D = +7,5 (c 0,53 CHCl3) erhalten. Das IR-Spektrum war dem der Alkaloide 1 und 2 ähnlich. Zusätzlich wurde das Vorhandensein von Absorptionen bei 2830, 2700 und 1739 cm-1 beobachtet, die für die Formylgruppe charakteristisch sind. Im negativen HRESIMS-Modus wurde das pseudomolekulare Ion bei m/z 369,1133 beobachtet, was der Molekularformel C20H20NO6 entspricht. Der negative Ionenmodus der ESI-MS-Spektren zeigte den Verlust einer Formylgruppe bei m/z 339. Das NMR-Profil war ähnlich wie das der Alkaloide 1 und 2. In der 1H-NMR erschienen verschiedene Signale, die zu einem Gemisch aus zwei Isomeren im Verhältnis 3:1 gehören. Der Vergleich des Hauptisomers mit dem Alkaloid 1 im NMR zeigte das gleiche Muster der Substitution des aromatischen Rings, abgesehen vom Auftreten zweier neuer Signale bei δH 8,25 (1H, s) im 1H und bei δC 161,9 im 13C der Formylgruppe zu 3. Diese Funktionalität am Stickstoff führte zur Bildung von Rotationsisomeren, die zuvor für Alkaloide mit einer N-Formyl- und N-Acetylgruppe beschrieben wurden.22 Die absolute Konfiguration wurde als S bestimmt, in der gleichen Weise wie bei 1 und 2. Daher wurde dieses Alkaloid 3 als (S)-N-Formyl-3-Methoxy-Nordomesticin identifiziert.
Alkaloid 4 wurde als weißer Feststoff mit einem Schmelzpunkt von 222-223 ºC (MeOH) und mit einer optischen Drehung von 25D 25D = +47,0 (c 0,55 CHCl3) erhalten. Die Analyse der NMR-Daten von 4 ergab, dass es das gleiche Grundgerüst wie 2 hat, aber einen Methylester aufweist, wie die Signale bei δH 3.76 (3H, s) und δC 52.6 für 4 anstelle der Signale für die Ethylgruppe in 2 zeigen. HRESIMS zeigte ein pseudomolekulares Ion – bei m/z 398.1233 entsprechend der Summenformel C22H22NO7. Daher wurde das Alkaloid 4 als (S)-N-Methoxycarbonyl-3-Methoxy-Nordomesticin identifiziert.
Die antimykotische Aktivität wurde durch die Scheibendiffusionsmethode gegen Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici,23 einen phytopathogenen Pilz, der Tomatenkulturen befällt und den Landwirten große Verluste zufügt, bewertet. Die Alkaloidfraktion war bei 250 μg/μL aktiv gegen F. oxysporum. Die Hemmwirkung gegen das Pilzwachstum war bei 5 μg/μL für (S)-3-Methoxy-Nordomesticin 1 mäßig, während die anderen Alkaloide unwirksam waren, was darauf hindeutet, dass das Vorhandensein von elektronenziehenden Substituenten am Stickstoffatom die antimykotische Aktivität verringert.
Obwohl es nur wenige Bewertungsberichte über die antimykotische Aktivität von Aporphinen gibt, wurde festgestellt, dass diese gegen Arten wie Candida albicans aktiv sind,24,25 aber inaktiv gegen Pilzerreger wie Cladosporium herbarium.26 Diese Ergebnisse sind ein neuer Bericht zur Bewertung der antimykotischen Aktivität dieser Alkaloide, in dem hervorgehoben wird, dass die Art der Substituenten am Stickstoff der Aporphine einen Einfluss auf die antimykotische Aktivität hat, die sie aufweisen.
Die antibakterielle Aktivität wurde mit der von Lerhrer27 beschriebenen Radialdiffusionsmethode gegen zwei Gram(+)-Standardstämme bewertet: Staphylococcus aureus 6538 und Enterococcus faecalis 29212 und drei Gram (-): Escherichia coli 25922 und Salmonella tiphymurium, Stämme MS7953 und 14028s. Alkaloid 1 (2,5 μg) zeigte antimikrobielle Aktivität gegen die beiden untersuchten Gram-positiven Bakterien mit Werten von 30 AU, wie in Tabelle 2 dargestellt.
Für das racemische Gemisch der Verbindung 3-Methoxy-Nordomesticin wurde eine Aktivität gegen E. coli (MIC= 256 μg/mL) und S. aureus (MIC= 512 μg/mL) berichtet,28 in diesem Fall ist die Verbindung 1 jedoch nicht aktiv gegen E. coli.
Gleichermaßen wie bei der antimykotischen Aktivität zeigen die Ergebnisse, dass die Art des Substituenten am Stickstoff die antibakterielle Aktivität beeinflusst (Tabelle 2).
EXPERIMENTAL
Allgemeine Verfahren
Der Schmelzpunkt wurde mit dem Mel-temp Fisher Johns, Laborgerät bestimmt. UV-Spektren wurden mit einem Perkin Elmer Lambda 2S und CD-Spektren mit einem JASCO J-720 Spektrometer aufgenommen. IR-Spektren wurden mit einem Perkin Elmer FT-IR Panagon 500 Serie 1000 als Dünnfilm aufgenommen. Die optischen Drehungen wurden mit einem Schmidt-Haensch-Polarimeter aufgezeichnet. 1H- (400 MHz) und 13C- (100 MHz) NMR-Spektren sowie 2D-Spektren (COSY, HMQC und HMBC) wurden mit einem Bruker Avance 400 MHz-Spektrometer unter Verwendung von CDCl3 als interne Referenz durchgeführt. HRMS wurden mit einem Shimadzu LCMS-IT-TOF-Massenspektrometersystem mit ESI im Positiv-Ionen-Modus und Negativ-Ionen-Modus bestimmt. Die Säulenchromatographie (CC) wurde mit Kieselgel (70-230 und 230-400 mesh, Merck) durchgeführt, und die analytische Chromatographie erfolgte mit Kieselgel 60 PF254 (0,25 mm).
Pflanzenmaterial
Die Stängel von O. macrophylla wurden im Juli 2006 von W. Delgado in Nocaima, Kolumbien, gesammelt. Das botanische Exemplar wurde von A. Jara identifiziert und als Belegexemplar (COL-517191) im kolumbianischen Nationalen Herbarium der Nationalen Universität von Kolumbien, Bogotá, Kolumbien, hinterlegt.
Extraktion und Isolierung
Getrocknete und angetriebene Stängel (2,0 kg) von Ocotea macrophylla wurden mit EtOH durch Mazeration bei Raumtemperatur extrahiert und im Vakuum konzentriert, um einen Extrakt (102,6 g) zu erhalten. Eine Probe (48,9 g) dieses Extrakts wurde mit Ultraschall in Wasser aufgelöst und mit 5% HCl auf pH 2,0 angesäuert. Die saure Suspension wurde anschließend filtriert und mit 20 % NaOH auf pH 8,0 alkalisiert und anschließend mit Chloroform extrahiert. Die Chloroformfraktion (3,01 g) wurde einer Säulenchromatographie mit Kieselgel unterzogen und mit einem Gradienten von Petrolether:AcOiPr (4:6 bis 0:10) und AcOiPr:MeOH (10:0 bis 0:10) eluiert, wobei vier Fraktionen (I-IV) erhalten wurden. Die Fraktion I (347 mg) wurde wiederholt über eine Säule (CC) auf Kieselgel chromatographiert und mit n-Hexan:AcOiPr (9:1-8:2), CHCl3 und Tol:AcOiPr 7:3 eluiert. Dies ergab die Alkaloide 1 (7 mg) und 2 (4 mg). Fraktion II (250 mg) wurde einer Säulenchromatographie auf Kieselgel unterzogen und mit CHCl3:AcOEt (85:15) eluiert, dann einer CC auf Sephadex LH-20 (CH3OH) unterzogen, um Alkaloid 3 (8 mg) zu erhalten. Fraktion IV (1433 mg) wurde durch wiederholte Säulenchromatographie auf Kieselgel unter Verwendung von CH2Cl2:MeOH 97:3 und CH2Cl2 als Elutionssysteme gereinigt. Schließlich ergaben aufeinanderfolgende Waschungen mit MeOH das Alkaloid 4 (98 mg).
Antifungstest
F. oxysporum wurde aus der Kultursammlung der Universität von Cundinamarca (Abteilung für Agronomie, Labor für Phytopathologie) gewonnen. Als Medium für die Tests der antifungalen Aktivität wurde PDA verwendet. Der Nährboden wurde mit 100 μl einer Lösung von 105 Sporen beimpft. Die Proben wurden in Lösungen verschiedener Konzentrationen hergestellt, die 50, 25 und 10 μg/μL der Alkaloidfraktion und 5, 2,5, 1,0, 0,5, 0,2 und 0,1 μg/μL der reinen Alkaloide entsprechen. Zehn Mikroliter der Proben wurden auf die Filterpapierscheiben aufgetragen und auf das geimpfte Medium gelegt. Die Platten wurden versiegelt und für 3 Tage bei 25 °C im Brutschrank belassen. Deutliche Zonen, die sich gegen einen wachsenden Pilz abzeichnen, zeigen die minimale Menge der Fraktion oder des Alkaloids an, die erforderlich ist, um das Wachstum des Pilzes zu hemmen. Für jede Behandlung wurden drei Wiederholungen durchgeführt. Benomyl (Benzimidazol – 5 μg) wurde als Positivkontrolle verwendet, und Aceton diente als Negativkontrolle.23
Antibakterielle Tests
Die antibakterielle Aktivität wurde mittels Radialdiffusionsmethode in Anlehnung an die zuvor von Lehrer veröffentlichte Methodik bewertet.27 Die Verbindungen wurden gegen zwei Gram(+)-Stämme untersucht: Staphylococcus aureus ATCC 6538 und Streptococcus fecalis ATCC 29212 und drei Gram (-) Stämme: Escherichia coli ATCC 25922 und Salmonella tiphymurium, ATCC 14028s und Salmonella tiphymurium MS7953. Von jedem Stamm wurde eine Kolonie isoliert und in 3 ml Sojatryptikase (TSB) für Gram (+)-Stämme und Luria-Bouillon (LB) für Gram (-)-Stämme gegeben und bei 37 °C unter Rühren bebrütet, bis die Mikroorganismen in der logarithmischen Phase waren. Der Überstand wurde entfernt, und das erhaltene Sediment wurde in Phosphatpuffer (PBS) resuspendiert, gefolgt von Waschen mit PBS und Zentrifugieren. Schließlich wurde das Sediment erneut in PBS suspendiert und die optische Dichte bei 620 nm bestimmt, um die Anzahl der KBE (koloniebildende Einheiten) pro Milliliter zu berechnen. Dabei wird ein bestimmtes Volumen, das 4 x 107 KBE enthält, in jeder Schale dispergiert. Das abgemessene Volumen wurde gemischt und in 15 mL Agarose homogenisiert, die auf mehr oder weniger 45 °C erhitzt wurde. Diese Bakteriensuspension wurde in Petrischalen serviert und bei Raumtemperatur erstarren gelassen, wonach mit einer sterilen Stanze Löcher von 2 mm Durchmesser gemacht wurden.
Die Testproben wurden durch Auflösen von 1 mg der reinen Verbindung in 500 μl DMSO hergestellt, die 8 μl der Probe in doppelter Menge aufgetragen und bei 37 °C 30 min lang inkubiert wurden. Nach dieser Zeit wurde das Nährmedium zugegeben, das geschmolzenen Agar-Agar und TSB enthält, 18 Stunden bei 37 °C bebrütet und dann der Durchmesser der Hemmzonen durch die Aktivität der Verbindung gemessen. Als Positivkontrollen wurden verschiedene Antibiotika, Ampicillin (50 mg/mL), Kanamycin (10 mg/mL) und Tetracyclin (4,12 mg/mL) in einer Verdünnung von 1:100 in PBS und als Negativkontrollen DMSO und PBS verwendet, wobei jede Kontrolle 8 μl in jede Vertiefung gab. Die Durchmesser der Hemmungszonen wurden in Millimetern gemessen, und die Ergebnisse wurden als Aktivitätseinheiten gemäß dem Verhältnis angegeben, das besagt, dass 1 Aktionseinheit (UA) 0,1 mm der Hemmungszone entspricht.
ZUSATZMATERIAL
HINWEISE
Die Autoren möchten der Nationalen Universität von Kolumbien für die finanzielle Unterstützung dieses Projekts danken. Außerdem danken wir dem Kernspinresonanzlabor und dem Massenspektrometrie-Labor für ihre Unterstützung bei der Aufnahme der NMR-Spektren bzw. der HR-ESI-MS. Darüber hinaus möchten die Autoren der Universität Javeriana für die optischen Rotationen, dem FIDIC (Foundation Institute of Inmunology of Colombia) für die Aufnahme der CD-Spektren und insbesondere Prof. J. M. Lozano für die Untersuchung der antibakteriellen Aktivität danken.
1. Takaku, S.; Haber. W.; Setzer, W.; Biochem. Syst. Ecol. 2007, 35, 525.
2. Guerrini, A.; Sacchetti, G.; Muzzolli, M.; Moreno, G.; Medici, A.; Besco, E.; Bruni R.; J. Agric. Food Chem. 2006, 54 , 7778.
4. Ballabeni, V.; Tognoli, M.; Bertoni, S.; Bruni, R.; Guerrini, A.; Moreno, G.; Barocelli, E.; Pharmacol. Res. 2007, 55, 23.
5. Fournet, A.; Ferreira, M.; Rojas, A.; Guy, I.; Guinaudeau, H.; Heinzen, H.; Fitoterapia. 2007, 78, 382.
6. Palomino, E.; Maldonado, C.; J. Nat. Prod. 1996, 59, 77.
7. Marques, R.; Batistuzzo, S.; Silva, C.; Barbosa, J.; Fassarella, L.; Mutat. Res. 2003, 536, 117.
8. López, H.; Valera, A.; J. Nat. Prod. 1995, 58, 782.
9. Zschocke, S.; Staden, J.; Paulus, K.; Bauer, R.; Horn, M.; Munro. O.; Brown N.; Drewes, S.; Phytochemistry 2000, 54, 591.
10. Lordello, A.; Yoshida, M.; Phytochemistry 1997, 46, 741.
11. Silva, I.; Barbosa, J.; Silva, M.; Lacerda C. da-Cunha, E.; Biochem. Syst. Ecol. 2002, 30, 881.
12. Franca, N.; Giesbrecht, A.; Gottlieb, O.; Malgalhaes, A.; Malgalhaes, E.; Maia, J.; Phytochemistry 1975, 14, 1671.
13. Warrumby, S.; Lordello, A.; Quim. Nova 2007, 30, 92.
14. Wu, Y.; Chao, Y.; Chang, F.; Chen, Y.; Phytochemistry 1996, 46, 181.
15. Mathouet, H.; Elomri, A.; Lameiras, P.; Daich, A.; Vérité, P.; Phytochemistry 2007, 68, 1813.
16. Tantisewie, B.; Pharadai, T.; Pandhuganont, M.; Guinaudeau, H.; Freyer, A.; Shamma, M.; J. Nat. Prod. 1989, 52, 652.
17. Ringdahl, B.; Chan, R.; Craig, J.; J. Nat. Prod. 1981, 44, 80.
18. Nishiyama, Y.; Moriyasu, M.; Ichimaru, M.; Iwasa, K.; Kato, A.; Mathenge, S.; Chalo, P.; Juma, F.; Phytochemistry 2006, 67, 2671.
19. Castro, O.; Hasbun, C.; Calderon, M.; Fitoterapia 1991, 62, 72.
20. Chen, Y.; Chang, F.; Wu, Y.; J. Nat. Prod. 1996, 59, 904.
21. Zhao, O.; Zhao, Y.; Wang, K.; J. Ethnopharm. 2006, 106, 408.
22. Chang, F.; Wei, J.; Teng, C.; Wu. Y.; J. Nat. Prod. 1998, 61, 1457.
23. Gomez, Y.; Gil, K.; González, E.; Farías, L.; Rev. Biol. Biol. Tropen. 2007, 55, 767.
24. Kuo, R.; Chang, F.; Chen, C.; Teng, C.; Yen, H.; Wu. Y.; Phytochemie 2001, 57, 421.
25. Agnihotri, V.; ElSohly, H.; Khan, S.; Jacob, M.; Joshi, V.; Smillie, T.; Khan, I.; Walker, L.; Phytochem. Lett. 2008, 1, 89.
26. Ma, W.; Fukuski, Y.; Tahara, S.; Osawa, T.; Phytotherapie 2000, 71, 527.
27. Lerhrer, R.; Rosenman, M.; Harwig. S.; Jackson, R.; Eisenhaver, P.; J. Inmunol. Methoden. 1991, 137, 167.
28. Nimgirawath, S.; Udomputtimekakul, P.; Taechowisan, T.; Wanbanjob, A.; Shen Y.; Chem. Pharm. Stier. 2009, 57,
Eingegangen am 26.6.09; angenommen am 6.11.09; veröffentlicht im Internet am 3.10.10
* email: [email protected]
ZUSATZMATERIAL
