Assoziation von HPV-Genotypen mit externen anogenitalen Warzen: eine Querschnittsstudie
Studiendesign und Teilnehmer
Eine Querschnittsstudie mit einer nicht-probabilistischen Stichprobe wurde durchgeführt. Patienten, die dermatologische Kliniken im Farwania Health District Area besuchen, wurden von November 2016 bis Mai 2017 konsekutiv für die Studie rekrutiert. Immunkompetente Patienten mit früherer klinischer Diagnose externer anogenitaler Warzen, bei denen eine Kryotherapie oder Laserbehandlung geplant war, wurden gebeten, die Einverständniserklärung zu unterschreiben, nachdem der Dermatologe sie mündlich um ihre Teilnahme gebeten hatte. Zum Zeitpunkt der Entnahme wurden die Warzenproben in einem universellen Transportmedium (HealthLink Inc., Copan Italia S.p.A., Italien) gesammelt und bei – 80 °C gelagert. Die ethische Genehmigung wurde von der Ethikkommission des Health Sciences Center (Nummer: VDR/EC/2310) und dem Gesundheitsministerium eingeholt.
Demographische und klinische Daten wurden von jedem Patienten erhoben, darunter: Alter (Jahre), Geschlecht (männlich, weiblich), Nationalität (kuwaitisch, nicht kuwaitisch), Anzahl der Warzen (eine, zwei bis vier und mindestens fünf), Dauer des Vorhandenseins von Warzen (< ein Monat, ein bis sechs Monate, sieben bis 12 Monate und mehr als 12 Monate), Größe jeder Warze (in Zentimetern) (< eine, eine, zwischen einer und zwei, mehr als zwei), Partner hat Warzen (ja, nein), und ob die Warzen zuvor behandelt wurden (ja, nein). Keiner der Teilnehmer erhielt eine HPV-Impfung, da die HPV-Impfung in Kuwait noch nicht eingeführt wurde, obwohl ihre Einführung derzeit im Gesundheitsministerium diskutiert wird.
DNA-Extraktion und Kontrollen
Die erhaltenen Gewebeproben wurden bei – 80 °C gelagert. Aufgrund der großen Anzahl der eingegangenen Proben wurden alle Warzen pro Patient zusammen zerkleinert und einer einzigen DNA-Isolierung unterzogen. Das Gewebe wurde mit einer sterilen Schere und einer Pinzette auf einer Petrischale zerkleinert, und etwa 25 g Gewebe wurden gewogen. Das Gewebe wurde in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und in 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen überführt. Genomische DNA wurde aus den Gewebeproben mit einem QIAmp DNA Mini Kit (Qiagen, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert.
HPV-Typ 2, HPV-Typ 1 und HPV-Typ 16 Vektoren (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) wurden als Kontrollen in den PCR-Experimenten verwendet.
Echtzeit-PCR
Der Echtzeit-PCR-Assay wurde zum Screening auf HPV-DNA in den Genitalwarzen durchgeführt. Fünf Mikroliter (5-μl) der extrahierten DNA wurden mit 12,5-μl 2X Syber Green Mastermix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), der ROX als passive Referenz enthält, und 10 pmol Vorwärts- und Rückwärtsprimer (10-uM, siehe unten) kombiniert. Alle Primersätze wurden von Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA, kundenspezifisch synthetisiert. Die Mischung wurde mit nukleasefreiem Wasser (Ambion, Austin, TX, USA) auf ein Volumen von 25 μl aufgefüllt. Um die Anzahl falsch positiver oder negativer Ergebnisse zu verringern, wurden die Proben auf einer 96er-Reaktionsplatte mit optischen Vertiefungen (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) in doppelter Ausführung analysiert. Jede Amplifikationscharge enthielt positive und negative Kontrollen. Um das HPV in den Proben zu quantifizieren, wurde eine fünf- bis zehnfache serielle Verdünnung der bekannten Positivkontroll-DNA zusammen mit den Proben durchgeführt. Die Real-Time-PCR-Amplifikation wurde mit dem ABI 7500 Real-Time-PCR-System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) durchgeführt.
Der Real-Time-PCR-Assay wurde auf drei verschiedenen Platten durchgeführt. Die erste Platte wurde verwendet, um die Integrität der Ziel-DNA durch einen β-Globin-PCR-Assay zu bestimmen, wobei ein Zielfragment von 268 bp amplifiziert wurde, wie zuvor von Lum und Le Marchand (1998) beschrieben. Die Nukleotidsequenz der β-Globin-Primer lautet wie folgt: β-Globin Vorwärts-PCR-Primer: 5′-TGGGTTTCTGATAGGCACTGACT-3′. β-Globin-Reverse-PCR-Primer: 5′-AACAGCATCAGGAGTGGACAGAT-3′.Die PCR-Amplifikation wurde bei 95 °C für zehn Minuten eingeleitet und mit 45 Amplifikationszyklen abgeschlossen (Denaturierung bei 95 °C für 15 s, Annealing bei 55 °C für 45 s und Verlängerung bei 65 °C für eine Minute).
Die zweite Platte wurde zum Screening auf das Vorhandensein einer HPV-Infektion unter Verwendung von MY11/GP6-Primern aus dem HPV-L1-ORF verwendet. Die Nukleotidsequenzen der MY11/GP6-Primer lauten wie folgt: MY11 Vorwärtsprimer: 5′- GCM CAG GGW CAC AAY AAT GG -3′ und GP6 Rückwärtsprimer: 5′- GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC-3′. Die erwartete Größe des amplifizierten Fragments beträgt 185 bp. Die PCR-Amplifikation wurde bei 95 °C für zehn Minuten gestartet und mit 45 Amplifikationszyklen abgeschlossen (Denaturierung bei 95 °C für 15 s, Annealing bei 45 °C für 45 s und Verlängerung bei 65 °C für eine Minute).
Die dritte Platte wurde zum Screening auf das Vorhandensein einer HPV-Infektion unter Verwendung von HVP2/B5-Primern aus dem HPV-L1-ORF verwendet. Die Nukleotidsequenzen der HVP2/B5-Primer lauten wie folgt: HVP2 Vorwärtsprimer: 5′- TCN MGN GGN CAN CCN YTN GG -3′; B5 Rückwärtsprimer: 5′- AYN CCR TTR TTR TGN CCY TG -3′. Die erwartete Größe des amplifizierten Fragments beträgt 650 bp. Die PCR-Amplifikation wurde bei 95 °C für zehn Minuten gestartet und mit 45 Amplifikationszyklen abgeschlossen (Denaturierung bei 95 °C für 15 s, Annealing bei 50 °C für 45 s und Verlängerung bei 65 °C für eine Minute).
Fluoreszenzspektren wurden während der Elongationsphase jedes PCR-Zyklus aufgezeichnet. Die Sequence Detection Software (SDS v1.7) des ABI 7500 Real-Time PCR wurde zur Erstellung der Amplifikationskurve für jede Reaktion verwendet. Nach jeder Reaktion wurde eine Dissoziationskurve erstellt, um zwischen spezifischen und unspezifischen Amplikonen zu unterscheiden. Auf der Grundlage der Amplifikationskurve wurden alle Proben mit HPV-Amplifikation ab einem beliebigen Zyklus und bis zur Zyklusnummer 40 (mit einer Cut-off-Linie von 0,2) für die Analyse ausgewählt. Nur Proben mit einer Dissoziationskurve zwischen 70 °C und 80 °C und mit einem Ableitungswert zwischen 0,100-0,500 wurden als HPV-DNA-positiv betrachtet.
Sanger-Sequenzierung
Die HPV-DNA in Warzen wurde vor der Sequenzierung durch verschachtelte PCR amplifiziert, wobei der AmpliTaq Gold Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) verwendet wurde. In der ersten PCR wurden die Primer HVP2/B5 verwendet, in der zweiten PCR die Primer CN1F/CN1R, CN2F/CN2R, CN3F/CN3R und C4F/C4R. Die erste PCR-Amplifikation wurde bei 95 °C für zehn Minuten eingeleitet und mit 35 Amplifikationszyklen abgeschlossen (Denaturierung bei 95 °C für 15 s, Annealing bei 50 °C für 45 s und Verlängerung bei 68 °C für eine Minute). Die zweite PCR-Amplifikation wurde mit 3 μl des ersten PCR-Produkts und unter denselben Zyklusbedingungen durchgeführt. Zu den erwarteten Breitspektrum-HPV-Genotypen, die mit den Primern HVP2/B5 und CN1F/CN1R, CN2F/CN2R, CN3F/CN3R und C4F/C4R bei Hautwarzen nachgewiesen werden können, gehören HPV-Typen der Gattungen alpha (HPV 2, 3, 7, 10, 27, 28, 29, 40, 43, 57, 77, 91 und 94), gamma (HPV 4, 65, 95, 48, 50, 60 und 88), mu (HPV 1 und 63), und nu (HPV 41) .
Die PCR-Produkte wurden mit einem PCR-Reinigungskit (NucleoSpin Extract II PCR Purification Kit, Macherey-Nagel GmbH & Co.KG, Düren, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt. Anschließend wurden sie einer Sanger-Sequenzierungsreaktion unter Verwendung des BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) und der oben beschriebenen nested PCR-Primer unterzogen. Nach der Sequenzierung wurden PCR-Reinigungen durchgeführt, um ungebundene Fluoreszenzfarbstoff-Desoxyterminatoren mit dem BigDye XTerminator™ Purification Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) zu entfernen. Die Proben wurden 2 Minuten lang bei 95 °C denaturiert und sofort auf Eis gekühlt und auf einen ABI 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) geladen. Die Proben wurden auf einem 50-cm-Kapillar-Array unter Verwendung von POP 6-Polymer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) als Trennmedium elektrophoretisch untersucht.
Die Proben wurden mit der Sequenzanalyse-Software v 3.7 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) analysiert. Der HPV-Sequenzabgleich wurde mit Sequenzen in der GenBank-Datenbank unter Verwendung der BLASTn-Software (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) und der Los Alamos Data National Laboratory Theoretical Biology and Biophysics HPV-Datenbank (https://pave.niaid.nih.gov/) durchgeführt.
Wenn die erhaltenen Sequenzen aufgrund der geringen Ausbeute an PCR-Produkten von schlechter Qualität waren, wurden die PCR-Produkte nach der Reinigung mit dem Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System Kit (Promega) in den pGEM-T Easy Vector (Promega, Madison, WI) kloniert, und die Sequenzierung der Inserts wurde mit M13-Vorwärts- und Rückwärtsprimern durchgeführt.
Statistische Analyse
Daten der klinischen Diagnose, demografische Daten und virologische Analysen wurden tabellarisch erfasst und mit der Statistiksoftware SPSS ‚Statistical Package for Social Sciences, SPSS Version 25.0‘ (IBM Corp, Armonk, NY, USA) analysiert. Es wurden deskriptive Statistiken berechnet: Häufigkeiten/Prozentsätze, Maße der Mitte und der Streuung. Zur Prüfung der Gleichheit der Mittelwerte wurde der t-Test mit zwei Stichproben für alle kontinuierlichen Variablen verwendet, wenn die Normalität gegeben war, andernfalls wurde der Mann Whitney U-Test verwendet. Für den Vergleich der Mittelwerte von drei Gruppen wurde je nach den erfüllten Annahmen entweder die Varianzanalyse oder der Kruskal-Wallis-Test verwendet. Der Pearson-Chi-Quadrat-Test auf Unabhängigkeit oder der exakte Fisher-Test wurden verwendet, um Assoziationen zwischen zwei kategorialen Variablen zu testen, wenn die Annahmen erfüllt waren. Um ein binäres Ergebnis mit einer Reihe von Kovariaten zu modellieren, wurde eine logistische Regression durchgeführt, und es wurden rohe und bereinigte Odds Ratios sowie deren 95%-Konfidenzintervalle geschätzt. Alle Tests waren zweispurig, und ein P-Wert von weniger als 5 % wurde als statistisch signifikant angesehen.