Auswirkungen von Statinen auf die Angiogenese und Vaskulogenese | Revista Española de Cardiología

EINFÜHRUNG

Statine hemmen die Aktivität der 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzym A (HMG-CoA)-Reduktase, eines Enzyms, das die Mevalonatsynthese katalysiert, den limitierenden Schritt in der Cholesterinbiosynthese.1 Die daraus resultierende Verringerung des intrazellulären Cholesterins führt zu einem kompensatorischen Anstieg der Cholesterinaufnahme durch Low-Density-Lipoprotein (LDL)-Rezeptoren und zu einem Rückgang des Plasmacholesterins. Die Entdeckung der Statine und ihre Anwendung bei Patienten mit hohen Cholesterinwerten hat es ermöglicht, die Primär- und Sekundärprävention der koronaren Herzkrankheit erheblich zu verbessern.2,3 In jüngster Zeit wurde die Wirksamkeit der Statine bei der Primär- und Sekundärprävention der koronaren Herzkrankheit auch bei Patienten mit niedrigeren Cholesterinwerten beobachtet.4-6 Neben der Senkung des LDL-Cholesterins (C-LDL) haben die Statine eine Reihe von pleiotropen Wirkungen auf verschiedene Komponenten der Atherosklerose, darunter die Endothelfunktion, die Zellmigration, die Entzündung und die Thromboseneigung der Plaque.7-12 Bei normocholesterinämischen Tieren wurde nachgewiesen, dass Statine eine schützende Wirkung gegen Ischämie-Reperfusionsläsionen des Herzmuskels haben, wahrscheinlich durch Mechanismen, die mit der Stickoxidproduktion (NO) durch das Endothel zusammenhängen.13

Die Serin/Threonin-Proteinkinase Akt oder Proteinkinase B (PKB) ist ein multifunktioneller intrazellulärer Regulator des zellulären Überlebens, Wachstums und Stoffwechsels14 (Abbildung 1). In Bezug auf seine kardiovaskulären Funktionen wirkt Akt/PKB auf den intrazellulären Signalweg, der durch den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF)14,15 und Angiopoietin16-18 stimuliert wird, und fördert das Zellüberleben und sorgt für eine adäquate Gefäßentwicklung.19 Die konstitutive Aktivierung der Akt-Signalübertragung schützt Kardiomyozyten vor Apoptose bei Ischämie-Reperfusionsläsionen.20 Zusätzlich zu seiner zytoprotektiven Wirkung wirkt Akt als Aktivator der NO-Produktion durch das Endothel als Reaktion auf VEGF und Scherstress durch seine Fähigkeit, die endotheliale Stickoxid-Synthase (eNOS) an den Serinen 1179 oder 1177 zu phosphorylieren,21,22 wodurch der vasomotorische Tonus kontrolliert wird.23 Andererseits ist Akt wesentlich für die Migration von Endothelzellen zum VEGF-produzierenden Herd.24 Die Fähigkeit von Akt, das Überleben der Zellen, die NO-Produktion und die VEGF-induzierte Migration zu vermitteln, deutet daher darauf hin, dass die Proteinkinase Akt die endotheliale Reaktion auf angiogene Stimuli vermitteln kann.

Abb. 1. Statine, Akt-Signalübertragung und Angiogenese/Vaskulogenese. Angiopoietin 1 (Ang-1), VEGF und Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) induzieren, wenn sie an ihre Membranrezeptoren gebunden sind, die Umwandlung von Phosphatidylinositol 4,5-Biphosphat (PIP2) in Phosphatidylinositol 3,4,5-Triphosphat (PIP3) durch Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K). Die PIP3-Bildung ist für die Phosphorylierung der Akt-Proteinkinase durch die PDK-1-Kinase erforderlich. Eine Behandlung mit Statinen erhöht die Phosphorylierung von Akt, während Wortmanin (ein PI3K-Hemmer) dies verhindert. Mevalonat, das Produkt der HMG-CoA-Reduktase, hemmt ebenfalls PI3K und die anschließende Phosphorylierung von Akt. Indem sie die HMG-CoA-Reduktase und die Produktion von Mevalonat hemmen, erhöhen die Statine also die Phosphorylierung von Akt und gleichzeitig die Phosphorylierung und Aktivierung der endothelialen Stickstoffmonoxid-Synthase (eNOS), die Stickstoffmonoxid-Synthese (NO) und eine Reihe von physiologischen Effekten, die bei der Angiogenese und Vaskulogenese ausgelöst werden. Akt verhindert auch die Apoptose von Endothelzellen.

Kürzlich wurde nachgewiesen, dass die Statine auch den intrazellulären Signalweg der Proteinkinase Akt/PKB25-27 in Endothelzellen25 und den endothelialen Vorläuferzellen (EPC) des Knochenmarks26,27 stimulieren und damit sowohl die Angiogenese25 als auch die Vaskulogenese induzieren.26 Die Auswirkungen der Statine auf die Kinetik der EPC wurden von Vasa et al. auch beim Menschen nachgewiesen.28 In diesem Artikel wird die Wirkung von Statinen auf die Induktion von Angiogenese25 und Vaskulogenese26 durch Mechanismen im Zusammenhang mit der Akt-Aktivierung untersucht.25-27

ANGIOGENESE UND VASKULOGENESE

Angiogenese und Vaskulogenese sind für die Entwicklung des Gefäßsystems im Embryo verantwortlich.29-32 Die Vaskulogenese ist der Prozess der Blutgefäßbildung aus endothelialen Vorläuferzellen (Angioblasten), die wandern und mit anderen endothelialen Vorläuferzellen verschmelzen und sich unter Bildung neuer Blutgefäße zu Endothelzellen differenzieren. Im Gegensatz dazu ist die Angiogenese der Prozess der Erweiterung der Blutgefäße, die sich durch Knospung neuer Kapillaren durch die Migration und Proliferation zuvor differenzierter Endothelzellen gebildet haben (Abbildung 2).

Abb. 2. Schematische Darstellung der Angiogenese und Vaskulogenese. (A) Vaskulogenese ist die Aggregation von Angioblasten oder endothelialen Vorläuferzellen zur Bildung von Blutgefäßen. Angioblasten vereinigen sich in situ oder wandern ein, um Blutgefäße an entfernten Stellen zu bilden. (B) Angiogenese ist die Bildung neuer Blutgefäße aus bereits bestehenden Gefäßen durch die Proliferation und Migration differenzierter Endothelzellen. (C) Angiogenese und Vaskulogenese können auch gleichzeitig auftreten. (Entnommen aus Cleaver et al.29)

Anfänglich dachte man, dass der vaskulogene Prozess auf die Embryonalentwicklung beschränkt sei, während die Angiogenese (die ebenfalls im Embryo stattfindet) der einzige Prozess sei, der an der Neovaskularisierung im Erwachsenenalter beteiligt sei. Vor kurzem wurde jedoch das Paradigma der postnatalen Neovaskularisation überprüft, und es wurde entdeckt, dass endotheliale Vorläuferzellen, die im peripheren Blut zirkulieren,33 von Neovaskularisationsherden in erwachsenen Tieren aufgenommen werden,34 ihre Anzahl als Reaktion auf eine Gewebeischämie erhöhen,35 und sie die Entwicklung von kollateralen Blutgefäßen nach ihrer Expansion in vitro und späterer Transplantation fördern.36 Diese Studien haben ergeben, dass sowohl die Angiogenese als auch die Vaskulogenese für die Neovaskularisierung bei Erwachsenen verantwortlich sind.

Ein dritter Mechanismus, der wahrscheinlich zur Entwicklung von Kollateralgefäßen beiträgt, ist die Zunahme der Größe und des Kalibers bereits bestehender arteriolärer Kollateralverbindungen, ein Prozess, der als Arteriogenese bezeichnet wird.37 Das Vorhandensein und die Anzahl dieser nativen Kollateralgefäße variiert stark zwischen Individuen und Spezies. Wenn ein Gefäß verschlossen wird, erhöht sich die Geschwindigkeit des Blutflusses durch die bereits bestehenden Kollateralgefäße und die Scherbelastung der Lumen, Faktoren, die zur Reifung der Kollateralgefäße, insbesondere derjenigen mittlerer Größe, beitragen.

Untersuchungsmethoden in vitro

Die Entwicklung von Techniken für die Kultur von Endothelzellen hat es ermöglicht, die an der Angiogenese beteiligten Prozesse zu verstehen.38 Endothelzellen in Kultur behalten die Fähigkeit, auf Faktoren zu reagieren, die die Angiogenese stimulieren oder hemmen, sowie die Fähigkeit, in vitro Endothelschläuche zu bilden. Mit Hilfe von Zellproliferationstests kann die Wirkung einer bestimmten Substanz auf die Proliferation von Endothelzellen analysiert werden. Die Migration von Endothelzellen in Richtung einer Lösung, die eine bestimmte Substanz enthält, getrennt durch eine durchlässige Membran, kann in einer Boyden-Kammer untersucht werden. Die Mechanismen der tubulären Endothelbildung und die Wirkung einer bestimmten Substanz auf die Tubuli können mit Hilfe von zwei- oder dreidimensionalen Assays untersucht werden. Mit diesen Techniken werden die Prozesse der Bildung des endothelialen Lumens und der Einfluss der extrazellulären Matrix auf die Kapillarentwicklung analysiert.38 Schließlich ermöglichen Kulturen von Endothelzellen die Untersuchung der molekularen Wege, die an den Angiogeneseprozessen beteiligt sind.

In jüngster Zeit wurden Techniken, die für die Untersuchung von differenzierten Endothelzellen entwickelt wurden, durch den Einsatz von Zellselektionstechniken und speziellen Kulturmedien auch für die Untersuchung von endothelialen Vorläuferzellen verwendet.33-36

Untersuchungsmethoden in vivo

Obwohl die Techniken in vitro eine erste Analyse der Angiogenese und Vaskulogenese ermöglichen, gibt es viele Faktoren, die diese Prozesse in vivo beeinflussen oder modulieren können.38 Um die Mechanismen der Blutgefäßbildung in vivo zu untersuchen, wurden verschiedene biologische Systeme entwickelt, um die Wirkung einer bestimmten Substanz zu quantifizieren oder zu demonstrieren: Hornhautmodelle von Mäusen, Chorioalantoidmembran von Hühnerembryonen oder Schwammimplantate.38 Diese Systeme erfordern die Tötung des Tieres, so dass sie die Wirkung nur zu einem bestimmten Zeitpunkt erfassen. Um die zeitliche Entwicklung von Ereignissen in einem einzelnen Gewebe zu untersuchen, wurden intravitale Mikroskopietechniken für die Haut auf dem Rücken oder den Schädel der Maus entwickelt.39 Schließlich hat die Entwicklung gentechnischer Verfahren es ermöglicht, die Auswirkungen der Unterdrückung (Knock-out) oder Hinzufügung (Knock-in) eines Gens auf die Prozesse der Vaskulogenese und Angiogenese zu untersuchen.

Die Untersuchung der postnatalen Vaskulogenese und der Wirkung bestimmter Substanzen auf die Prozesse der Vaskulogenese wurde durch den Einsatz von Durchflusszytometrietechniken, fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS), speziellen Techniken zur Kultivierung endothelialer Vorläuferzellen (EPC) aus peripherem Blut und murinen Knochenmarktransplantationsmodellen möglich.33-36 FACS wird zum Nachweis und zur Quantifizierung von EPC im peripheren Blut mit Hilfe von Antikörpern gegen die Oberflächenantigene dieser Zellen eingesetzt. Der Einfluss von Medikamenten oder Wachstumsfaktoren auf die Anzahl dieser Zellen im peripheren Blut kann auf diese Weise analysiert werden. Die von unserer Gruppe entwickelten speziellen Techniken der Zellselektion und -kultur haben es ebenfalls ermöglicht, EPC nachzuweisen und zu quantifizieren. Im Mausmodell der Knochenmarktransplantation werden Knochenmarkzellen eines Mausspenders auf einen Mausrezeptor mit einem Gen transplantiert, das für die Herstellung einer Substanz kodiert, die später nachgewiesen werden kann (Abbildung 3). In unserem Fall kodierte das Gen für die Bildung von Beta-Galaktosidase durch Endothelzellen. Die selektive Expression wird dadurch erreicht, dass dieses Gen durch einen spezifischen Endothelzellpromotor, Tie-2, im Mausspender reguliert wird. Daher exprimieren nur Endothelzellen aus dem Knochenmark des Tierspenders die Beta-Galaktosidase, die im Tierrezeptor nachgewiesen werden kann. Wenn die oben beschriebenen biologischen Experimente nach der Knochenmarktransplantation im Tierrezeptor durchgeführt werden, können wir den Einfluss einer bestimmten Substanz auf die Vaskulogenese analysieren, indem wir die Anzahl der aus dem Knochenmark stammenden endothelialen Vorläuferzellen quantifizieren.

Abbildung 3. Murines Modell der Knochenmarktransplantation für die Untersuchung der Vaskulogenese. Als Knochenmarkspender werden transgene Mäuse verwendet, die konstitutiv das Gen LacZ (das für Beta-Galaktosidase kodiert) exprimieren, das durch einen spezifischen endothelialen Promotor, Tie-2, reguliert wird. Das Knochenmark wird entnommen und auf einen Mäuserezeptor transplantiert, dessen Knochenmark sublethal bestrahlt worden ist. Nach einem Zeitraum von 4 Wochen, um die Rekonstitution des transplantierten Knochenmarks zu erreichen, werden ein oder mehrere Eingriffe in den Mausrezeptor vorgenommen (in diesem Fall handelt es sich um ein Hornhautmodell), um die Neovaskularisierung zu stimulieren. Nach diesen Eingriffen werden die Tiere getötet und eine histologische Untersuchung zum Nachweis der Beta-Galaktosidase-Expression durchgeführt. Mit der X-GAL-Färbung erhalten Zellen, die Beta-Galaktosidase exprimieren, eine bläuliche Farbe. Die Verwendung eines spezifischen Promotors für Endothelzellen ermöglicht es, die blauen Zellen, die in Neovaskularisationsherde eingebaut wurden, als Zellen endothelialer Abstammung zu identifizieren.

WIRKUNG VON STATINEN AUF DIE INDIKTION VON ANGIOGENESE UND VASKULOGENESE

Untersuchungen in unserem Labor und anderswo haben gezeigt, dass die Statine den intrazellulären Signalweg der Proteinkinase Akt/PKB stimulieren,25-27 der sowohl die Angiogenese25 als auch die Vaskulogenese fördert.26 Darüber hinaus konnten Vasa et al. auch beim Menschen die Auswirkungen von Statinen auf die Kinetik von EPC nachweisen.28

Wirkungen von Statinen in vitro

Die Statine aktivieren rasch die Proteinkinase Akt/PKB in Endothelzellen25 und EPC,26,27 wodurch die Phosphorylierung von eNOS und die anschließende Produktion von NO erhöht wird. Die Aktivierung von Akt durch Statine fördert die Proliferation, Migration und das zelluläre Überleben von Endothelzellen und EPC sowie die Bildung der Gefäßstruktur. Darüber hinaus bewirkt die Hemmung von Akt durch die Verwendung von Adenoviren, die für dominant negative Formen von Akt kodieren, eine Hemmung der durch Statine induzierten Effekte. Das Potenzial von Statinen bei Geweberegenerationsprozessen wurde bereits bei Osteoblasten nachgewiesen. In diesen Zellen steigerten Statine die Proliferation und das Aktivitätsniveau und erhöhten somit die Knochenbildung.40

Obwohl die Mechanismen der Akt-Aktivierung durch Statine nicht genau bekannt sind, ist es wahrscheinlich, dass die Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K)-Signalisierung beteiligt ist, da dieser Prozess durch Wortmanin und LY294002, zwei Inhibitoren des Enzyms, blockiert wird (Abbildung 1). Darüber hinaus ist eine Hemmung der HMG-CoA-Reduktase erforderlich, da die Aktivierung von Akt durch Simvastatin durch die Zugabe von Mevalonat zur Inkubation gehemmt wurde (Abbildung 1). Mevalonat ist nicht nur für die Biosynthese von Cholesterin notwendig, sondern auch für die Produktion von Ubichinon, Dolicholen und Isoprenoiden, die für mehrere Zellprozesse unerlässlich sind. Obwohl die Statine die Boten-RNA (mRNA) von eNOS stabilisieren, indem sie die Isoprenoid-Synthese verändern,41 konnten wir keine Veränderungen der eNOS-Proteinsynthase-Werte beobachten. In diesem Zusammenhang ist es wichtig zu betonen, dass der Anstieg der mRNA-Konzentration später erfolgte (24 Stunden) als die Aktivierung der eNOS-Phosphorylierung durch Akt (15 Minuten). Diese kürzere Aktivierungszeit steht im Einklang mit den durch Statine induzierten Veränderungen in der NO-Produktion und in der Vasodilatation, die in den Aortenanhängseln ex vivo beobachtet wurden.42

Wirkungen von Statinen in vivo

Die Statine und die Aktivierung der intrazellulären Akt-Signalgebung fördern die Angiogenese in Modellen der peripheren Ischämie, die an normocholesterinämischen Kaninchen entwickelt wurden.25 Bei Tieren, die Statine erhielten, wurden höhere Perfusionsdrücke, eine größere Anzahl von Kollateralgefäßen und eine höhere Kapillardichte beobachtet (Abbildung 4). Andererseits erhöhen die Statine die Anzahl der endothelialen Vorläuferzellen im peripheren Blut sowohl bei Mäusen26,27 als auch beim Menschen.28 Darüber hinaus steigern die Statine die Neovaskularisierung der Hornhaut bei normocholesterinämischen Mäusen, was zum Teil auf die Gefäßneubildung aus EPC aus dem Knochenmark zurückzuführen ist (Abbildungen 3 und 5).26 Mit Hilfe des Mausmodells der Knochenmarktransplantation konnte eine größere Anzahl von EPC aus dem Knochenmark in den Hornhäuten der mit Statinen behandelten Mäuse nachgewiesen werden. Daher haben Statine eine wichtige Wirkung auf die EPC-Kinetik, wie zuvor mit VEGF oder Granulozyten- und Monozyten-Kolonie-stimulierendem Faktor (GM-CSF) nachgewiesen wurde,35 und die Statin-induzierte Mobilisierung dieser Zellen könnte die postnatale Neovaskularisierung erhöhen.

Abb. 4. Statin-induzierte Zunahme der Neovaskularisation im Bein eines Kaninchens als Reaktion auf eine einseitige Resektion der Arteria femoralis. a) Die Arteria femoralis und ihre Äste sind durchtrennt. Der Gentransfer auf das Endothel erfolgt durch Infusion von Adenoviren, die für Beta-Galaktosidase (Ad-βgal) oder Akt (Ad-myrAkt) kodieren, in die distale Arteria femoralis und Inkubation während 15 Minuten bei vorübergehendem Abklemmen der Vena femoralis. b) Am dritten Tag wird der Gastrocnemius-Muskel entnommen und die X-GAL-Färbung durchgeführt, um die transgene Verteilung in den mit Hämatoxylin-Eosin gefärbten histologischen Präparaten zu bestimmen. c) Es wird eine Angiographie durch die innere Darmbeinarterie durchgeführt, um die Bildung von Kollateralgefäßen in den verschiedenen Behandlungsgruppen zu analysieren. In den nach 40 Tagen durchgeführten Angiographien ist eine Zunahme der Bildung von Kollateralgefäßen bei den Tieren zu erkennen, die 0,1 mg/kg Simvastatin durch intraperitoneale Injektion erhalten haben, im Vergleich zu den Tieren, die zwar interveniert wurden, aber nur Kochsalzlösung injiziert bekamen. Die quantitative Analyse der Kollateralgefäße wurde in der Kontrollgruppe, der mit Simvastatin behandelten Gruppe und der Gruppe von Tieren, die eine intramuskuläre Injektion von Ad-VEGF erhielten, durchgeführt. Der angiographische Score wurde in den Versuchsgruppen analysiert, die 31 Tage nach der Operation eine Infusion von Kochsalzlösung, Ad-βgal und Ad-myrAkt erhielten. d) Die Anfärbung für alkalische Phosphatase im Adduktorenmuskel des ischämischen Beins zeigte eine größere Kapillardichte in der mit Simvastatin behandelten Tiergruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe 40 Tage nach der Operation. Die Daten jedes Experiments sind als Mittelwert±SD angegeben (n=6 Kaninchen in jeder der Behandlungsgruppen, *P25)

Abbildung 5. Zunahme der kornealen Neovaskularisation durch Statin-induzierte Vaskulogenese. a) Repräsentative Fotos, die die korneale Neovaskularisation zeigen (links, Vehikel; rechts, Simvastatin). b) X-gal-Färbung ganzer Hornhäute. Die bläulichen Punkte sind Zellen, die Beta-Galaktosidase exprimieren (links, Vehikel; rechts, Simvastatin). c) Repräsentative Mikrofotografien der histochemischen Untersuchung der Fluoreszenz in in Paraffin eingebetteten Hornhäuten von Tie2/LacZ/BMT-Mäusen (links, Vehikel; rechts, Simvastatin). Das Vorhandensein doppelt positiver Zellen ist ein Beweis dafür, dass aus dem Knochenmark gewonnene endotheliale Vorläuferzellen (EPC) von den Neovaskularisationsherden aufgenommen wurden (Vaskulogenese). Die rote Farbe zeigt in diesem Fall beta-Galaktosidase an und die grüne Farbe den spezifischen Endothelmarker Isolectin B4. Bei den doppelt positiven Zellen (gelbe Farbe) handelt es sich um EPC aus dem Knochenmark, die von den neuen Gefäßen aufgenommen wurden. d) Repräsentative Mikrofotografien der histochemischen Untersuchung der Fluoreszenz in ganzen Hornhäuten von Tie2/LacZ/BMT-Mäusen (links, Vehikel; rechts, Simvastatin). Die rote Farbe zeigt Beta-Galaktosidase und die grüne Farbe zeigt den spezifischen Endothelmarker Lektin BS-1. e) Quantifizierung der aus der Transplantation stammenden EPC, die in die Neovaskulatur integriert wurden. Ausgedrückt als das Verhältnis zwischen der Anzahl der EPC und der Gesamtzahl der Endothelzellen, die die neuen Gefäße bilden. *P26)

ZUSAMMENFASSUNG

Statine fördern die Proliferation, Migration und das zelluläre Überleben von Endothelzellen und EPC aus dem Knochenmark durch Mechanismen, die mit der Aktivierung der Serin/Threonin-Proteinkinase Akt oder PKB zusammenhängen. Ähnlich wie VEGF fördern Statine die Angiogenese und Vaskulogenese. Daher kann die Aktivierung von Akt für einige der vorteilhaften Wirkungen von Statinen verantwortlich sein, einschließlich der postnatalen Neovaskularisierung.