Auxotrophie
GenetikBearbeiten
In der Genetik, wird ein Stamm als auxotroph bezeichnet, wenn er eine Mutation trägt, die es ihm unmöglich macht, eine essentielle Verbindung zu synthetisieren. So ist beispielsweise eine Hefemutante mit einem inaktivierten Uracil-Syntheseweg-Gen ein Uracil-Auxotroph (wenn z. B. das Orotidin-5′-Phosphat-Decarboxylase-Gen der Hefe inaktiviert ist, ist der resultierende Stamm ein Uracil-Auxotroph). Ein solcher Stamm ist nicht in der Lage, Uracil zu synthetisieren und kann nur wachsen, wenn Uracil aus der Umgebung aufgenommen werden kann. Dies ist das Gegenteil eines uracilprototrophen Stammes, oder in diesem Fall eines Wildtyp-Stammes, der auch in Abwesenheit von Uracil wachsen kann. Auxotrophe genetische Marker werden häufig in der Molekulargenetik verwendet; sie wurden bekanntlich in der mit dem Nobelpreis ausgezeichneten Arbeit von Beadle und Tatum über die Hypothese „ein Gen – ein Enzym“ verwendet, die Mutationen von Genen mit Proteinmutationen verbindet. Auf diese Weise können biosynthetische oder biochemische Stoffwechselwege kartiert werden, um festzustellen, welches Enzym oder welche Enzyme in den untersuchten auxotrophen Bakterienstämmen mutiert und funktionsunfähig sind.
Forscher haben E. coli-Stämme, die auxotroph für bestimmte Aminosäuren sind, verwendet, um nicht-natürliche Aminosäureanaloga in Proteine einzuführen. So können beispielsweise Zellen, die für die Aminosäure Phenylalanin auxotroph sind, in Medien gezüchtet werden, die mit einem Analogon wie Para-Azidophenylalanin angereichert sind.
Viele Lebewesen, einschließlich des Menschen, sind für große Klassen von Verbindungen, die für das Wachstum erforderlich sind, auxotroph und müssen diese Verbindungen über die Nahrung erhalten (siehe Vitamin, essentieller Nährstoff, essentielle Aminosäure, essentielle Fettsäure).
Das komplexe Evolutionsmuster der Vitamin-Auxotrophie im eukaryontischen Lebensbaum ist eng mit der gegenseitigen Abhängigkeit der Organismen verbunden.
Der Mutagenitätstest (oder Ames-Test)
Beim Salmonella-Mutagenese-Test (Ames-Test) werden mehrere Stämme von Salmonella typhimurium verwendet, die auxotroph für Histidin sind, um zu prüfen, ob eine bestimmte Chemikalie Mutationen verursachen kann, indem ihre auxotrophe Eigenschaft als Reaktion auf eine zugesetzte chemische Verbindung beobachtet wird. Die Mutation, die eine chemische Substanz oder Verbindung auslöst, wird gemessen, indem man sie auf die Bakterien auf einer Platte mit Histidin aufträgt und dann die Bakterien auf eine neue Platte ohne ausreichend Histidin für ein kontinuierliches Wachstum umsetzt. Wenn die Substanz das Genom der Bakterien nicht von auxotroph zu Histidin zurück zu prototroph zu Histidin mutiert, dann würden die Bakterien auf der neuen Platte kein Wachstum zeigen. Durch den Vergleich des Verhältnisses der Bakterien auf der neuen Platte mit der alten Platte und dem gleichen Verhältnis bei der Kontrollgruppe lässt sich also quantifizieren, wie mutagen eine Substanz ist, oder besser gesagt, wie wahrscheinlich es ist, dass sie Mutationen in der DNA verursacht. Eine Chemikalie gilt als positiv für den Ames-Test, wenn sie Mutationen verursacht, die die beobachtete Reversionsrate erhöhen, und als negativ, wenn sie sich ähnlich wie in der Kontrollgruppe verhält. Wird ein auxotrophes Bakterium auf ein Medium ohne den benötigten Metaboliten plattiert, ist eine normale, aber geringe Anzahl von Revertantenkolonien zu erwarten, da sie wieder zur Prototrophie mutieren könnten. Die Wahrscheinlichkeit dafür ist gering und führt daher zur Bildung sehr kleiner Kolonien. Wird jedoch eine mutagene Substanz hinzugefügt, ist die Zahl der Revertanten deutlich höher als ohne die mutagene Substanz. Der Ames-Test gilt grundsätzlich als positiv, wenn eine Substanz die Wahrscheinlichkeit einer Mutation in der DNA der Bakterien so stark erhöht, dass ein quantifizierbarer Unterschied zwischen den Revertanten der Mutagenplatte und der Kontrollgruppenplatte besteht. Ein negativer Ames-Test bedeutet, dass das mögliche Mutagen keinen Anstieg der Revertanten verursacht hat, und ein positiver Ames-Test bedeutet, dass das mögliche Mutagen die Mutationswahrscheinlichkeit erhöht hat. Diese mutagenen Wirkungen auf Bakterien werden als möglicher Indikator für die gleichen Wirkungen auf größere Organismen, wie den Menschen, erforscht. Es wird vermutet, dass, wenn eine Mutation in der bakteriellen DNA in Gegenwart eines Mutagens entstehen kann, derselbe Effekt auch bei größeren Organismen auftreten und Krebs verursachen könnte. Ein negatives Ames-Testergebnis könnte darauf hindeuten, dass die Substanz kein Mutagen ist und keine Tumorbildung in lebenden Organismen verursacht. Allerdings wurden nur wenige der positiven Ames-Test-Ergebnisse von Chemikalien als unbedeutend angesehen, wenn sie an größeren Organismen getestet wurden, aber der positive Ames-Test für Bakterien konnte immer noch nicht schlüssig mit der Entstehung von Krebs in größeren Organismen in Verbindung gebracht werden. Obwohl es sich um eine mögliche Determinante von Tumoren für lebende Organismen, Menschen, Tiere usw. handeln kann, müssen noch weitere Studien durchgeführt werden, um zu einer Schlussfolgerung zu gelangen.
Auxotrophie-basierte Methoden zum Einbau unnatürlicher Aminosäuren in Proteine und ProteomeEdit
Eine große Anzahl unnatürlicher Aminosäuren, die ihren kanonischen Gegenstücken in Form, Größe und chemischen Eigenschaften ähneln, werden mit Hilfe von auxotrophen Expressionswirten in die rekombinanten Proteine eingeführt. Zum Beispiel können auxotrophe Escherichia coli-Stämme mit Methionin (Met) oder Tryptophan (Trp) in einem definierten Minimalmedium kultiviert werden. In diesem Versuchsaufbau ist es möglich, rekombinante Proteine zu exprimieren, deren kanonische Trp- und Met-Reste vollständig durch verschiedene, mit dem Medium ergänzte verwandte Analoga ersetzt sind. Diese Methodik führt zu einer neuen Form des Protein-Engineerings, die nicht durch Codon-Manipulationen auf DNA-Ebene (z.B. Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese), sondern durch Codon-Neuzuordnungen auf der Ebene der Protein-Translation unter effizientem Selektionsdruck erfolgt. Daher wird die Methode als Selective Pressure Incorporation (SPI) bezeichnet.
Kein bisher untersuchter Organismus kodiert für andere als die zwanzig kanonischen Aminosäuren; zwei weitere kanonische Aminosäuren (Selenocystein, Pyrrolysin) werden durch Umkodierung von Translationsterminationssignalen in Proteine eingefügt. Diese Grenze kann durch adaptive Laborevolution von metabolisch stabilen auxotrophen Mikrobenstämmen überschritten werden. So wurde beispielsweise 2015 der erste eindeutig erfolgreiche Versuch unternommen, Escherichia coli zu entwickeln, das ausschließlich mit der unnatürlichen Aminosäure Thienopyrrolylalanin als einzigem Ersatz für Tryptophan überleben kann.