Beta-Galactosidase Assay (A better Miller)

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Hintergrund

β-Galactosidase wird durch das lacZ-Gen des lac-Operons in E. coli. Es ist ein großes (120 kDa, 1024 Aminosäuren) Protein, das ein Tetramer bildet. Die Funktion des Enzyms in der Zelle besteht darin, Laktose in Glukose und Galaktose zu spalten, damit diese als Kohlenstoff-/Energiequelle genutzt werden können. Die synthetische Verbindung o-Nitrophenyl-β-D-galactosid (ONPG) wird ebenfalls als Substrat erkannt und gespalten, um Galactose und o-Nitrophenol zu erhalten, das eine gelbe Farbe hat. Wenn ONPG in einer Reaktion im Überschuss vorhanden ist, ist die Produktion von o-Nitrophenol pro Zeiteinheit proportional zur Konzentration der β-Galaktosidase; daher kann die Produktion der gelben Farbe zur Bestimmung der Enzymkonzentration verwendet werden.

So, warum interessiert uns das? Normalerweise werden Experimente so angelegt, dass die β-Galactosidase-Konzentration in der Zelle ein Indikator für einen bestimmten Aspekt des untersuchten Systems ist. Zum Beispiel kann ein Forscher einen Promotor mit dem lacZ-Gen verbinden und die β-Gal-Konzentration als Indikator für die Aktivität des Promotors unter verschiedenen Bedingungen verwenden. Im Jahr 1972 veröffentlichte Jeffrey Miller „Experiments in Molecular Genetics“, das ein Protokoll zur Bestimmung der β-Gal-Menge mit ONPG enthielt. Aus diesem Grund werden ONPG/β-Gal-Assays als „Miller“-Assays bezeichnet, und eine standardisierte Menge an β-Gal-Aktivität ist eine „Miller Unit“.

1 Miller Unit = \displaystyle{ 1000 * \frac{(Abs_{420} – (1.75*Abs_{550}))}{(t * v * Abs_{600})} }

wobei:

• Abs420 ist die Absorption des gelben o-Nitrophenols,
• Abs550 ist die Streuung durch Zelltrümmer, die, wenn sie mit 1.75 der bei 420 nm beobachteten Streuung entspricht,
• t = Reaktionszeit in Minuten,
• v = Volumen der untersuchten Kultur in Millilitern,
• Abs600† gibt die Zelldichte wieder.

†Beachten Sie, dass dieser Wert für jedes verwendete Spektrophotometer unterschiedlich ist und durch Ausplattieren von Verdünnungen bekannter Abs600-Kulturen kalibriert werden sollte, um die koloniebildenden Einheiten pro Abs600 zu bestimmen.

In seinem Buch erklärt Dr. Miller erklärt in seinem Buch, dass diese Formel ungefähr 1 Miller-Einheit für nicht induzierte E. coli (geringe β-Gal-Produktion) und ungefähr 1000 Einheiten für eine vollständig induzierte Kultur (gewachsen auf Laktose oder IPTG) ergibt.

Nach meiner Erfahrung haben Kulturen von MG1655, die mit 1 mM IPTG in der log-Phase induziert wurden, 1500-1800 Miller-Einheiten. Der Grund für diesen Unterschied ist nicht bekannt, aber ich vermute, dass er auf die Unterschiede in der Abs600/Zelldichte zwischen dem Spektralphotometer von Dr. Miller und dem von mir verwendeten Gerät zurückzuführen ist sowie auf die Tatsache, dass ich meine Miller-Assays bei 30 °C durchführe (der Einfachheit halber), während Dr. Miller seine Assays bei 28 °C durchführte. Ich habe Promotor-Fusionen hergestellt, die ~40.000 Miller-Einheiten erzeugen; wie jedoch weiter unten erörtert wird, ist dies für den Assay zu hoch, so dass das Protokoll geändert wurde, um diesen Wert zu senken.

Protokoll

Das von mir verwendete Protokoll stammt aus einer Arbeit von Zhang und Bremer (JBC 270, 1995, Freier Volltext!), in der das ursprüngliche Miller-Protokoll stark vereinfacht wurde, um mehr Proben mit weniger Manipulationen messen zu können.

Kurz gesagt, besteht das Protokoll aus der Messung der Zelldichte einer Bakterienkultur (Abs600), dann wird ein Aliquot der Zellen aus der Küvette entnommen und mit einer „Permeabilisierungslösung“ gemischt, die Detergenz enthält, das die Zellmembranen zerstört (aber das β-Gal intakt lässt). Dies tötet die Zellen ab und stoppt die Translation. Nach der Inkubation wird eine ONPG-„Substrat“-Lösung hinzugefügt und die gelbe Farbe entwickelt sich. Dann wird eine „Stopp“-Lösung zugegeben und die Absorption von o-Nitrophenol gemessen.

1. Züchten Sie die Kulturen unter den Bedingungen, die Sie testen möchten.
2. Messen Sie während des Wachstums 80 μL der Permeabilisierungslösung in 1.
3. Messen Sie Abs600 und zeichnen Sie es auf!
4. Entnehmen Sie ein 20 μL Aliquot der Kultur und fügen Sie es zu den 80 μL der Permeabilisierungslösung hinzu.

Die Probe ist nun für mehrere Stunden stabil. So können Sie Zeitverlaufsexperimente durchführen.

1. Nach der letzten Probenentnahme bringen Sie die Proben und die Substratlösung für 20-30 Minuten in den 30 °C warmen Raum.
2. Geben Sie 600 μL Substratlösung in jedes Röhrchen und notieren Sie die Zeit der Zugabe.
3. Nachdem sich eine ausreichende Farbe entwickelt hat, geben Sie 700 μL Stopplösung hinzu, mischen Sie gut und notieren Sie die Stoppzeit.
4. Nach dem Stoppen der letzten Probe (einige können länger dauern als andere, aber im Allgemeinen sind sie in 30-90 Minuten fertig), überführen Sie die Röhrchen in eine Mikrozentrifuge und schleudern Sie sie 5-10 Minuten lang bei voller Geschwindigkeit.
5. Nehmen Sie die Röhrchen vorsichtig aus der Zentrifuge und überführen Sie die Lösung vom oberen Rand der Röhrchen in Ihre Küvette(n). Sie versuchen zu vermeiden, dass sich Partikel in der Küvette befinden, damit die Streuung den Messwert nicht beeinflusst.
6. Messen Sie Abs420. Dieser Wert sollte kleiner als 1 und größer als 0,05 sein. Wenn er etwas außerhalb dieses Bereichs liegt, ist das kein Problem.

Berechnen Sie die Miller-Einheiten wie folgt:

\displaystyle{ 1000 * \frac{(Abs_{420})}{((Abs_{600} \text{ der beprobten Kultur})*(\text{Volumen } )*(\text{Reaktionszeit}))} }

Kommentare zum Assay

• Reshma 11:28, 15. Oktober 2007 (CDT): Miller empfiehlt eine Kultur mit OD600 = 0,28 bis 0,70. Er behauptet jedoch, dass auch Übernachtkulturen verwendet werden können, dass aber exponentiell wachsende Zellen präzisere Assays ergeben.

• Wann wird die Reaktion durchgeführt? Ich habe in der Literatur keine gute Antwort darauf gefunden. Wenn ich eine Reaktion zu Ende gehen lasse, habe ich einen Abs420 von ~2-3 gemessen. Das liegt natürlich außerhalb des zuverlässigen Bereichs des Spektralphotometers, aber es gibt einen Hinweis darauf, wie weit die Reaktion gehen kann. Ich erhielt reproduzierbare Daten, als die gelbe Farbe vor der Zugabe der Stopplösung gerade noch nachweisbar war, bis etwa zur Farbe der LB-Brühe vor dem Stoppen. Denken Sie daran, dass Sie das Substrat brauchen, um das Enzym im Verlauf der Reaktion zu sättigen, also lassen Sie es nicht zu weit gehen. Ich führe routinemäßig drei separate Messungen für jede Kultur durch und berechne den Durchschnitt.
  • Reshma 11:28, 15. Oktober 2007 (CDT): Miller empfiehlt, dass der OD420nm-Wert idealerweise 0,6-0,9 betragen sollte.

• Häufig werden Einweg-Plastikküvetten verwendet, um sowohl die Trübung der Kultur als auch das gelbe o-Nitropenol zu messen. Meiner Erfahrung nach haben diese Einwegküvetten eine SCHLECHTE Optik: Ja, sie sind klar, aber der Lichtweg ist erbärmlich verzerrt (schauen Sie einfach durch eine Küvette auf ein entferntes Objekt). Dies ist kein großes Problem, wenn dieselbe Küvette für die Blindprobe und die Probe verwendet wird und sie im Spektralphotometer gleich ausgerichtet ist. Das Problem tritt auf, wenn viele verschiedene Proben in verschiedenen Küvetten gemessen werden. Die Werte können selbst für dieselbe Kultur, die in verschiedenen Küvetten gemessen wurde, GROSSE Unterschiede aufweisen. Ich empfehle, entweder eine hochwertige Glas- oder Quarzküvette zu verwenden oder die Proben in einem Plattenlesegerät mit 96-Well-Platten mit flachem Boden zu messen. Ich habe festgestellt, dass mein Fehler beim Pipettieren von 150 μl Kultur für Abs600-Messungen viel geringer war als bei der Verwendung von Einwegküvetten. Natürlich sollte die gemessene Trübung wie bei einer 1-cm-Küvette auf Zellen/ml kalibriert werden.

• Indem Sie die Proben drehen und vorsichtig eine Probe aus dem Überstand entfernen, vermeiden Sie, dass Sie die Streuung bei 550 nm messen und schätzen müssen, was sie bei 420 nm wäre.

• Wenn Ihre Reaktion zu viel β-Gal enthält, wird das Röhrchen in wenigen Minuten (oder sogar Sekunden) gelb. Das ist zu schnell. Einer der größten Fehlerquellen ist Ihre Schätzung der Reaktionszeit. Wenn Sie die Reaktionsbedingungen so einstellen, dass die Reaktion etwa eine Stunde dauert, werden die Zeitfehler unbedeutend. Wenn Sie die Reaktion verlangsamen müssen, können Sie weniger Zellen verwenden und die Menge des Permeabilisierungspuffers erhöhen, so dass das Volumen immer noch 100 μl beträgt. Alternativ können Sie die Ribosomenbindungsstelle Ihres β-Gal-Konstrukts umgestalten, um sie zu schwächen. Ich habe festgestellt, dass meine Zellen, wenn sie 40.000 Miller-Einheiten von β-Gal herstellen, durch den Translationsstress sehr krank wurden. In diesem Fall war es besser, die Translation der β-Gal mRNA zu schwächen.
  • Ich führe diese Reaktionen so durch, wie ich Enzymkinetik mache. Ich starte die Proben im Abstand von 10 Sekunden (wobei die Zeit hochgezählt wird), so dass es möglich ist, genaue Reaktionszeiten zu erhalten, auch wenn man die Reaktionen nur ein paar Minuten laufen lässt. Ich erhalte sehr reproduzierbare Ergebnisse mit Reaktionszeiten von 1,5-30 Minuten. Sobald Sie ein Gefühl dafür bekommen haben, wie lange Ihre Reaktionen dauern werden, ist es einfach, Proben zu gruppieren, die die gleiche Reaktionszeit benötigen. Wenn Sie jede Probe in dreifacher Ausfertigung durchführen, können Sie sicher sein, dass Ihre Zeitplanung reproduzierbar ist –Kathleen 16:43, 14. Dezember 2005 (EST)

• Hier ist ein Beispiel für einige aktuelle Daten, die ich mit diesem Assay erhalten habe. Es war ein Zeitverlaufsexperiment. Zu jedem Zeitpunkt habe ich 1 ml von jeder meiner Kulturen entnommen, die OD600 gemessen, drei 20-µl-Aliquots direkt aus der Küvette entnommen und jeweils 80 µl der Permeabilisierungslösung hinzugefügt. Ich habe den Test genau wie oben beschrieben durchgeführt, und alle Proben wurden bei Raumtemperatur aufbewahrt, bis der Zeitverlauf abgeschlossen war. Die OD600 für diese Kulturen schwankte im Laufe dieses Experiments von 0,4 bis 4 (in meiner Probe) und die Reaktionszeiten für die β-Gal-Assays variierten von 2-25 min. Die drei einzelnen β-Gal-Assays für jeden Zeitpunkt für jede Kultur (rote oder schwarze Symbole) sind im Diagramm aufgetragen, um die Reproduzierbarkeit des Assays innerhalb jedes Experiments zu veranschaulichen.Kathleen

Rezepte

Permeabilisierungslösung

Sie benötigen 80 μL pro Probe.

• 100 mM zweibasiges Natriumphosphat (Na2HPO4)
  • (Das Zhang-Protokoll hat 200 mM Natriumphosphat. Ich konnte es nie mit den anderen Komponenten in Lösung bringen, egal was ich versuchte, also habe ich es auf 100 mM reduziert. Ich habe sogar 50 mM ohne erkennbare Veränderung verwendet.)
• 20 mM KCl
• 2 mM MgSO4
• 0,8 mg/mL CTAB (Hexadecyltrimethylammoniumbromid)
• 0.4 mg/mL Natriumdeoxycholat
• 5,4 μL/mL beta-Mercaptoethanol

Substratlösung

Sie benötigen 600 μL pro Probe.

• 60 mM Na2HPO4
• 40 mM NaH2PO4
• 1 mg/mL o-Nitrophenyl-β-D-Galactosid (ONPG)
• 2.7 μL/mL β-Mercaptoethanol

(Das Zhang-Protokoll enthält auch 20 μg/mL CTAB und 10 μg/mL Deoxycholat. Ich lasse diese weg, da ich davon ausgehe, dass noch reichlich von der Permeabilisierungslösung vorhanden ist, und wenn sie noch nicht tot sind, werden sie es auch nicht sein.)

Stopplösung

Sie benötigen 700 μL pro Probe.

• 1 M Natriumcarbonat (Na2CO3)

Der hohe pH-Wert der Stopplösung denaturiert das β-Gal und verdoppelt ungefähr die gelbe Farbe der Reaktion.