Biologische Uhren

Der Wechsel von Tag und Nacht im Zyklus der Erde ist so zuverlässig, dass es nicht überrascht, dass Tiere, Pflanzen und Bakterien ihr Verhalten und ihre Physiologie anpassen (für einen Überblick siehe Ref. 1). Zirkadiane Rhythmen sind eine allgegenwärtige Anpassung aller Organismen an die vorhersehbarsten Herausforderungen der Umwelt. Ein biologischer Rhythmus, der unter konstanten Bedingungen anhält und eine Periode von ≈1 Tag hat, wird als „zirkadian“ (circa, „um“; dian, „Tag“) bezeichnet.

Bis vor kurzem waren die Moleküle, die der Oszillation zugrunde liegen, noch unbekannt. Störungen solcher Oszillationen durch Hemmstoffe der RNA- oder Proteinsynthese lassen vermuten, dass solche Moleküle beteiligt sind (2).

Ein erfolgreicher Ansatz zur Entschlüsselung der Mechanismen ist die Verwendung genetischer Veränderungen. Die erste und zweite Uhr-Mutante, die in der Fruchtfliege Drosophila melanogaster entdeckt wurden, sind die Perioden- und Zeitlos-Gene (3-5).

In der Fruchtfliege zyklieren die mRNA- und Proteinprodukte der Perioden- und Zeitlos-Gene für ≈24 Stunden an bestimmten Stellen des Fliegengehirns (6). Maki Kaneko et al. sprachen über diese mutmaßlichen Schrittmacherzellen im Fruchtfliegengehirn, indem sie diese molekulare Oszillation als Marker verwendeten (7). Im erwachsenen Kopf haben Proteinstudien gezeigt, dass per an bestimmten Stellen rhythmisch exprimiert wird, nämlich in den lateralen Neuronen, die zwischen dem Zentralhirn und den Sehnerven liegen. Die lateralen Neuronen werden als mutmaßliche Schrittmacherzellen für den Aktivitätsrhythmus der erwachsenen Fliege angesehen.

Kaneko et al. (7) zeigten, dass die Produkte von per und tim in einer begrenzten Anzahl von Neuronen im Larvengehirn nachweisbar sind. Die Expressionsmuster in mehreren dieser Zellen sind zyklisch. Unter diesen Neuronen exprimieren fünf seitlich gelegene Zellen. PERIOD (PER) ab dem frühen Larvenstadium, was darauf hindeutet, dass sie für die larvale Zeiterfassung der Eklosion und der Lokomotivaktivität verantwortlich sein könnten. Ein weiterer interessanter Befund ist eine Gruppe von Neuronen mit der zyklischen Expression von Per und Tim, die gegenphasig zu den lateralen Neuronen sind. Die Ergebnisse deuten auf das Vorhandensein mehrerer Oszillatoren hin, die an den Rhythmen verschiedener physiologischer oder verhaltensbezogener Prozesse in einem einzigen Organismus beteiligt sind. Kaneko et al. (7) beschrieben auch die anatomische Charakterisierung der Verdrahtungsmuster der Schrittmacherneuronen mit Hilfe der vom per-Promotor abhängigen Reportergenexpression. Ein solcher molekularer anatomischer Ansatz dürfte neue Erkenntnisse über die funktionelle Zuordnung dieses Gehirnsystems liefern. Darüber hinaus sollte der Vergleich zwischen Säugetier- und Fliegen-Uhrenzellen die evolutionären Beziehungen zwischen diesen Systemen klären.

Die zirkadiane Kontrolle der Transkription bietet einen Ansatzpunkt für die Analyse der cis-wirkenden regulatorischen Elemente und der trans-wirkenden Faktoren, durch die die Uhr viele uhrgesteuerte Genexpressionen regulieren kann (6). Diese mutmaßlichen cis-wirkenden regulatorischen Elemente, die als „time-box“ (8) bezeichnet werden, befinden sich vermutlich in der Promoter- und Enhancer-Region von uhrgesteuerten Genen. Darüber hinaus kann das uhrgesteuerte reaktionsfähige Element (6) oder die Time-Box die endogenen zirkadianen physiologischen Phänomene unter konstanten Bedingungen regulieren. Kürzlich wurde ein möglicher Kandidat für die Timebox in der Promotorregion des Periodengens von Drosophila identifiziert (9). Obwohl vorgeschlagen wurde, dass Per den mRNA-Zyklus durch transkriptionelle Unterdrückung vermittelt, ist eine direkte Interaktion zwischen Per und DNA sehr unwahrscheinlich, da PER keine DNA-bindende Domäne besitzt. Hardins Gruppe hat die Promotorregion des per-Gens in Studien mit transgenen Fliegen mit per-lacZ-Fusionsgen eingehend analysiert (9). Sie identifizierten einen zirkadianen Transkriptionsverstärker in einem 69-bp-DNA-Fragment, das eine E-Box stromaufwärts des per-Gens enthält, die für die nächtliche Aktivierung der Expression des per-Gens verantwortlich ist. Die E-Box ist eine bekannte Bindungsstelle für die Klasse der basischen Helix-Loop-Helix-Transkriptionsfaktoren.

Der bisher stärkste Kandidat für einen trans-aktiven Faktor im Oszillator ist Clock, der mit Hilfe einer vorwärtsgenetischen Strategie kloniert wurde (10). Die Gruppe von Takahashi (10) isolierte und analysierte die Lokomotoraktivität von zirkadianen Mausmutantenstämmen. Die Clock-Mutante wies eine lange Periode auf, die nach mehreren Tagen in konstanter Dunkelheit arrhythmisch wurde. Takahashi und Kollegen (10) klonierten erfolgreich das verantwortliche Gen und identifizierten die Mutation in der Protein-kodierenden Region des Clock-Gens. Interessanterweise enthält das Clock-Protein eine Protein-Protein-Bindungsdomäne (PAS), die sich im Drosophila-per-Gen befindet, und ein basisches Helix-Schleifen-Helix-Motiv für die DNA-Bindung. Darüber hinaus konnten Takahashi und Kollegen (10) die lange Periode und den arrhythmischen Phänotyp von Clock-Mutanten durch Übertragung des normalen Clock-Gens vollständig retten.

Ravi Allada et al. beschrieben die gemeinsamen molekularen Komponenten, die sich auf Clock konzentrieren, die für die Erzeugung des zirkadianen Rhythmus sowohl bei Fliegen als auch beim Menschen verantwortlich ist (11). Allada und seine Kollegen (11) untersuchten chemisch mutierte Fliegen auf der Suche nach Mutanten, die die zirkadiane Rhythmik der Lokomotoraktivität verändern oder aufheben, und fanden eine neue arrhythmische Mutante, die ursprünglich Jrk genannt wurde. Jrk-Fliegen exprimieren aufgrund einer verminderten Transkription geringe Mengen an periodischen und zeitlosen Proteinen. Das Gen wurde identifiziert und weist eine auffällige Sequenzerhaltung mit dem Säugetier-Gen für den zirkadianen Rhythmus, Clock, auf; daher nannten Allada et al. (11) dieses Fliegengen dClock. Wie die Maus-Uhr enthält auch die Drosophila-Uhr basische Helix-Loop-Helix- und PAS-Domänen sowie eine Transkriptionsaktivierungsdomäne.

Rezente Arbeiten sowohl bei Säugetieren als auch bei Fliegen deuten darauf hin, dass die Proteinpartner von CLOCK ebenfalls evolutionär konserviert sind (BMAL genannt) (12, 13). Es wurde gezeigt, dass CLOCK-BMAL-Dimere an die Promotorregion von Perioden- und Zeitlos-Genen binden und beide Gene in Fliegen transaktivieren. Darüber hinaus unterdrückt die Expression von PERIOD-TIMELESS (PER-TIM) die CLOCK-BMAL-vermittelte Reporterinduktion. Es wurde also ein Modell mit negativer Rückkopplung vorgeschlagen (Abb. 1).

Bei Säugetieren gilt der SCN im Hypothalamus als wichtiger Schrittmacher für zirkadiane Rhythmusphänomene, wie zahlreiche anatomische und physiologische Studien belegen (14). Vor kurzem wurden drei Homologe des Drosophila-Periodengens in Maus und Mensch entdeckt (15). Trotz der Existenz von drei Säugetier-Perioden-Homologen, die eine zirkadiane mRNA-Oszillation im suprachiasmatischen Nukleus im Mäusegehirn zeigen, wurde keine funktionelle Bedeutung des zirkadianen Lokomotorverhaltens berichtet.

Um zu klären, ob das Säugetier-Per-Homolog an der zirkadianen Rhythmik des Lokomotor-Verhaltens von Säugetieren beteiligt sein könnte, hat die Gruppe von Ishida ein Ratten-Per-Homolog kloniert und Ratten mit arrhythmischem SCN-Läsion hergestellt, um zirkadiane Rhythmen in peripheren Geweben zu überwachen (16).

Um zu prüfen, ob die rhythmische Expression von Ratten-PERIOD 2 (RPER2) mRNA auch in anderen Geweben als dem SCN zu beobachten ist, wurde eine Northern-Blot-Analyse an Geweben aus Auge, Gehirn, Herz, Lunge, Milz, Leber und Nieren durchgeführt. Interessanterweise zeigte sich in allen untersuchten Geweben eine rhythmische Expression von RPER2 mRNA, wobei das Verhältnis zwischen Tag und Nacht in jedem Gewebe unterschiedlich war. RPER2 verhält sich wie ein Säugetier-Homolog des Drosophila-Periodengens (16), da seine zirkadiane Expression nachts in einer Vielzahl von Geweben hoch war, wie die Periode bei Drosophila.

Da der SCN bei Säugetieren als Schrittmacher der zirkadianen Uhr gilt, untersuchte die Gruppe von Ishida (16), ob die zirkadiane Expression von RPER2 mRNA in mehreren Geweben durch eine SCN-Läsion beeinträchtigt wird. Überraschenderweise wurde die rhythmische Natur der multiplen Gewebeexpression von RPER2 durch die SCN-Läsion vollständig aufgehoben. Die Expression von RPER2 in verschiedenen Geweben unterliegt also der Kontrolle des SCN. Dies ist der erste Bericht, der darauf hinweist, dass der gewebeübergreifende zirkadiane Rhythmus von einer Gehirnuhr bei Säugetieren, dem SCN des Hypothalamus, gesteuert wird. Die Daten deuten auch darauf hin, dass ein Säugetier-Per-Homolog (RPER2) am zirkadianen Rhythmus des Lokomotor-Verhaltens bei Säugetieren beteiligt sein könnte, denn der Verlust der zirkadianen Expression von RPER2 mRNA im ganzen Körper trat auf, als die zirkadiane Lokomotor-Aktivität von Ratten verloren ging. Um dieses Problem zu klären, müssen wir transgene Tiere mit einer Loss-of-Function- oder einer Gain-of-Function-Mutation im RPER2-Gen herstellen. Die Tatsache, dass die rhythmische Expression von RPER2 mRNA in verschiedenen Geweben vollständig vom SCN abhängt, lässt vermuten, dass einige Signale erforderlich sind, um den Rhythmus des gesamten Körpers koordiniert aufrechtzuerhalten (Abb. 2). Eine SCN-Transplantationsstudie deutet ebenfalls auf die Bedeutung von humoralen Faktoren aus dem SCN hin (17). Solche humoralen Faktoren aus dem SCN könnten wichtig sein, um die zirkadiane rhythmische Expression des RPER2-Gens in peripheren Geweben zu erzeugen. Wie im Fall der Entwicklungsbiologie scheinen also Schlüsselmoleküle dieser biologischen Uhr zwischen Fliegen und Säugetieren gut konserviert zu sein. Ein gemeinsamer molekularer Uhrmechanismus von Bakterien (18) bis zum Menschen könnte in naher Zukunft ins Auge gefasst werden.