BiomedicalReports
- Einführung
- Materialien und Methoden
- Medizinische Materialien und Reagenzien
- Zubereitung von GPM
- Zellkultur und morphologische Beobachtung
- MTT-Assay
- Hoechst 33258-Färbung
- Analyse der Caspase-Aktivität
- Western-Blot-Analyse
- Statistische Analyse
- Ergebnisse
- GPM hemmt die Proliferation von HepG2-Zellen
- Die mit GPM behandelten Zellen zeigten eine abgerundete Morphologie, Schrumpfung und Verlust der Anheftung (Abb. 2). Auswirkungen von GPM auf die Kernmorphologie
- Effekte von GPM auf die Caspase-Aktivität
- Auswirkungen von GPM auf die Expressionsniveaus apoptotischer Proteine
- Diskussion
- Danksagung
- Glossar
- Abkürzungen
- Abkürzungen:
Einführung
Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) ist eine primäre Malignität der Hepatozyten, die 80 % aller primären Lebertumoren ausmacht. Weltweit ist das HCC die vierthäufigste Ursache für krebsbedingte Todesfälle (1). Patienten mit chronischen Lebererkrankungen, die mit Hepatitis-B- oder Hepatitis-C-Virusinfektionen einhergehen, entwickeln häufig ein HCC (2). Die chirurgischen Techniken wurden verbessert, und es wurden mehrere nicht-chirurgische Behandlungsmethoden entwickelt; die Verbesserung der extrem schlechten Prognose von HCC-Patienten ist jedoch nach wie vor begrenzt (3).
Die intensive Erforschung der Apoptose, auch bekannt als programmierter Zelltod, in den letzten Jahrzehnten hat diesen Prozess als eine geeignete Methode für die Krebstherapie hervorgehoben (4,5). Allerdings sind zahlreiche Medikamente mit apoptotischer Wirkung aufgrund ihrer Nebenwirkungen derzeit nur begrenzt für die Krebstherapie geeignet. Daher ist es wichtig, neue und zuverlässige therapeutische Wirkstoffe zu finden, die bei der Behandlung von Patienten mit HCC effizient die Apoptose der Krebszellen auslösen können.
In jüngster Zeit spielt die traditionelle chinesische Medizin eine wichtige Rolle bei der Behandlung bösartiger Tumore, da sie die Wirkung deutlich verbessert und die Nebenwirkungen verringert (6). Gecko, eines der beliebtesten traditionellen chinesischen Arzneimittel, wurde in der klinischen Praxis als Rohdroge zur Behandlung bösartiger Tumore eingesetzt (7-9). Gecko Rohpeptide und Gecko Ethanol-Extrakt können Apoptose in humanen HCC-Zellen induzieren und üben Antitumor-Aktivität in Aszites H22-tragenden Mäusen, die in unseren früheren Studien (10,11) nachgewiesen wurde. Das Ziel der vorliegenden Studie war es, die apoptotische Wirkung und den zugrundeliegenden Mechanismus der Gecko-Peptid-Mischung (GPM) in menschlichen Leberkarzinom-Zelllinien HepG2 in vitro zu untersuchen.
Materialien und Methoden
Medizinische Materialien und Reagenzien
Gecko japonicus wurde von BozhouYonggang Medicinal Herbs Factory Co., Ltd. (Anhui, China). Die humane HCC-Zelllinie HepG2 wurde vom Medical Science Research Institute of Henan (Henan, China) zur Verfügung gestellt.
Methylthiazolyldiphenyl-Tetrazoliumbromid (MTT) und Hoechst 33258 wurden von Sigma (St. Louis, MΟ, USA) erworben.
Das Caspase-Aktivitäts-Assay-Kit wurde vom Beyotime Institute of Biotechnology (Beijing, China) erworben. Der primäre Antikörper gegen den Apoptose-induzierenden Faktor (AIF) wurde von BosterInc. (Wuhan, Hubei, China), und der β-Actin-Antikörper wurde von Proteintech (Wuhan, Hubei, China) erworben. Der primäre Antikörper gegen Cytochrom c (Cyt c) und der sekundäre Antikörper, konjugiert an Maus oder Kaninchen, wurden von Zhongshan GoldenBridge Biotechnology Co., Ltd. (Beijing, China) erworben.
Das Mikroplatten-Lesegerät wurde von BioTekInstruments, Inc. (Winooski, VT, USA). Die Fluoreszenz- und Umkehrmikroskope BX41 wurden von Olympus (Tokio, Japan) hergestellt.
Zubereitung von GPM
Gecko-Pulver (100 g) wurde mit 400 m doppelt destilliertem Wasser gemischt und zu einem Homogenat verarbeitet. Nach 5-minütiger Zentrifugation bei 5.600 × g wurde der Niederschlag gesammelt und in 400 ml 55%iger Ethanollösung eingeweicht. Der Überstand wurde nach 5-minütiger Zentrifugation bei 5.600 × g gewonnen und bei 55 °C unter vermindertem Druck eingedampft.Anschließend wurden nach Gefriertrocknung der Rückstandsflüssigkeit gelbe Pulver gesammelt. Die gelben Pulver wurden durch Gel-Filtrationschromatographie (Sephadex G-25) gereinigt, und schließlich wurde das GPM gesammelt.
Zellkultur und morphologische Beobachtung
HepG2-Zellen wurden in modifiziertem Dulbecco-Adler-Medium, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, 100 U/mlpenicillin und Streptomycin, bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 gezüchtet. Das Kulturmedium wurde alle 2 Tage ausgetauscht und die Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase wurden für die folgenden Experimente verwendet. HepG2-Zellen (3,0×104Zellen/ml) wurden 24 Stunden lang mit verschiedenen Konzentrationen von GPM inkubiert. Die Zellen wurden beobachtet und Bilder mit einem inversen Phasenkontrastmikroskop aufgenommen, um die morphologischen Veränderungen zu erkennen.
MTT-Assay
HepG2-Zellen wurden in einer 96-Well-Platte mit einer Dichte von 6,0×103 Zellen/Well ausgesät. Unterschiedliche Konzentrationen von GPM und 0,003 mg/ml Fluorouracil (5-Fu) wurden in jede Vertiefung gegeben. Nach einer Inkubationszeit von 20, 44 bzw. 68 Stunden wurden 20 µl des MTT-Reagenz (5 mg/l) pro Vertiefung hinzugefügt und weitere 4 Stunden inkubiert. Der Überstand wurde durch 200 µl Dimethylsulfoxid ersetzt, und die Absorption (A) bei 490 nm wurde mit einem ELX800 Universal-Mikrotiterplatten-Lesegerät gemessen. Die Hemmungsrate der Zellproliferation (IR) wurde wie folgt bestimmt: IR = (1-AGPM/Kontrolle) ×100%.
Hoechst 33258-Färbung
Nach der Kultivierung über Nacht in einer 6-Well-Platte wurden dieHepG2-Zellen mit verschiedenen Konzentrationen von GPM (0,0,06 oder 0.08 mg/ml) und 0,003 mg/ml 5-Fu in frischem Kulturmedium bei37°C für 24 h behandelt. Die Zellen wurden zweimal mit Phosphat-Puffer-Salin (PBS) gewaschen und mit Hoechst 33258 Färbelösung (10µg/ml) angefärbt. Nach 15 Minuten Inkubation im Dunkeln wurden die Zellen zweimal mit kaltem PBS gewaschen und mit dem Fluoreszenzmikroskop untersucht.
Analyse der Caspase-Aktivität
Die Bestimmung der Caspase-3- und Caspase-9-Aktivität wurde mit dem Caspase-Aktivitäts-Assay-Kit nach dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Nach der Exposition gegenüber verschiedenen Konzentrationen von GPM (0, 0,06 oder 0,08 mg/ml) und 0,003 mg/ml 5-Fu für 24 Stunden wurden die Zellen geerntet und in Lysepuffer resuspendiert. Anschließend wurden die Zellen 20 Minuten lang im Lysepuffer inkubiert und 3 Minuten lang bei 16.000 × g bei 4 °C zentrifugiert. Die Überstände wurden gesammelt und der Proteingehalt wurde mit der Bradford-Methode bestimmt. Die Caspase-3- und Caspase-9-Aktivitäten wurden mit Reaktionspuffer (der Dithiothreitol enthält) und den Caspase-Substratpeptiden Ac-DEVD-pNA bzw. Ac-LEHD-pNA gemessen. Die erhaltenen Werte der optischen Dichte bei 405 nm wurden ausgedrückt als:AGPM/ACKontrolle.
Western-Blot-Analyse
HepG2-Zellen wurden 24 Stunden lang mit GPM (0, 0,06 oder 0,08 mg/ml) bzw. 0,003 mg/ml 5-Fu behandelt. Die Zellen wurden 30 Minuten lang auf Eis mit Lysepuffer behandelt und 30 Minuten lang bei 4 °C bei 13.000 × g zentrifugiert. Die Proteinkonzentration wurde mit der Bradford-Methode bestimmt. Die Proteine wurden durch 12%ige SDS-PAGE aufgetrennt und auf eine PVDF-Membran übertragen. Die PVDF-Membran wurde 1 Stunde lang bei 37°C mit 5% fettfreier Trockenmilch in PBS blockiert, 15 Minuten lang dreimal mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,1% Tween-20 (TBST) gewaschen und anschließend mit den primären Antikörpern inkubiert: Caspase-3 (Kat.-Nr. sc-7148; 1:200, polyklonaler Kaninchen-Antihuman), Caspase-9 (Kat.-Nr. sc-8355; 1:200, polyklonaler Kaninchen-Antihuman), Cyt c (Kat. sc-13156; 1:500, monoklonales Maus-Antihuman), AIF (Kat. Nr. PB0388; 1:200, polyklonales Kaninchen-Antihuman) und β-Actin (Kat. Nr. 66009-1-Ig;1:5.000, monoklonales Maus-Antihuman) über Nacht bei 4°C.Anschließend wurden die Proben 30 Minuten lang mit TBST gewaschen und die Membranen 1 Stunde lang mit den entsprechenden sekundären Antikörpern inkubiert. Die Chemilumineszenz wurde mit ECL Plus (Beyotime Institute of Biotechnology) nachgewiesen.
Statistische Analyse
Die experimentellen Daten sind als Mittelwert ±Standardabweichung dargestellt. Die Unterschiede zwischen den Gruppen wurden mittels einseitiger Varianzanalyse unter Verwendung des SPSS 19.0-Systems (IBM Corp., Armonk, NY, USA) untersucht. P<0,05 galt als Hinweis auf einen statistisch signifikanten Unterschied.
Ergebnisse
GPM hemmt die Proliferation von HepG2-Zellen
Die Wirkung von GPM auf das Wachstum von HepG2-Zellen wurde mit dem MTT-Test untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass GPM die Proliferation von HepG2-Zellen in einer dosis- und zeitabhängigen Weise signifikant hemmte (Abb. 1). Nach 24-, 48- oder 72-stündiger Behandlung mit GPM betrugen dieIC50 -Werte 0,154, 0,133 bzw. 0,051 mg/ml.
Die mit GPM behandelten Zellen zeigten eine abgerundete Morphologie, Schrumpfung und Verlust der Anheftung (Abb. 2).
Auswirkungen von GPM auf die Kernmorphologie
Die apoptotische Morphologie der Zellen wurde durchHoechst 33258-Färbung ermittelt. Wie in Abb. 3 gezeigt, wurden morphologische Veränderungen der apoptotischen Merkmale wie Kernkondensation, Chromosomenkondensation und granulare apoptotische Körper in den mit GPM behandelten Zellen auch durch Fluoreszenzmikroskopie beobachtet.
Effekte von GPM auf die Caspase-Aktivität
Als Initiatoren und Vollstrecker des Zelltods spielen die Cysteinproteasen eine wichtige Rolle im apoptotischen Prozess(12). Wie in Abb. 4 gezeigt, verursachte die Behandlung mit GPM einen signifikanten dosisabhängigen Anstieg der Caspase-3- und Caspase-9-Aktivität, was auf eine apoptotische Wirkung von GPM in HepG2-Zellen hindeutet.
Auswirkungen von GPM auf die Expressionsniveaus apoptotischer Proteine
Wie in Abb. 5 gezeigt, zeigte der Western Blotting-Test, dass GPM in HepG2-Zellen eine apoptotische Wirkung hat. Wie in Abb. 5 gezeigt, zeigte der Western Blotting-Test, dass die Freisetzung von Cyt c undAIF aus den Mitochondrien in das Zytosol zunahm, während die Expressionsniveaus von Caspase-3 und Caspase-9 durch die GPM-Behandlung dosisabhängig hochreguliert wurden. Die Veränderungen der Proteine unterschieden sich signifikant von denen der Kontrollgruppe (Abb. 6) (P<0,05).
Diskussion
In den letzten Jahrzehnten hat die Häufigkeit von Krebserkrankungen deutlich zugenommen, was der menschlichen Gesundheit schweren Schaden zufügt(13). Obwohl die gegenwärtigen Therapiestrategien eine offensichtliche krebsbekämpfende Wirkung gezeigt haben, sind schwere Nebenwirkungen unvermeidlich. Die Suche nach neuen Antitumormitteln, die wirksamer, aber weniger toxisch sind, hat zunehmende Aufmerksamkeit auf sich gezogen (14).Über die Gewinnung von Peptiden aus natürlichen Arzneimitteln für die Krebstherapie wurde weltweit ausführlich berichtet, und sie ist für die Krebsbehandlung vielversprechend. Peptide könnten auf verschiedene Weise eine Rolle spielen, z. B. durch Hemmung der Tumorproliferation, Unterbrechung des Zellzyklus, Unterdrückung der Tumorangiogenese und Auslösung der Apoptose (15). Der Gecko wird seit Hunderten von Jahren in der traditionellen chinesischen Medizin verwendet. In unseren früheren Studien zeigten die rohen Gecko-Peptide eine wirksame Antitumoraktivität bei Mäusen, die H22 trugen, und bei der HepG2-Zelllinie (16,17), aber die Auswirkungen von GPM auf menschliche Hepatozyten müssen noch aufgeklärt werden. Ziel der vorliegenden Studie war es daher, den zugrundeliegenden molekularen Mechanismus aufzudecken, durch den GPM die Apoptose in der menschlichen HCC-Zelllinie HepG2 induziert.
In der vorliegenden Studie zeigte der MTT-Test, dass GPM das Wachstum von HepG2-Zellen in einer dosis- und zeitabhängigen Weise hemmen konnte. Weitere Experimente zeigten, dass diese Hemmung auf die Behandlung mit GPM zurückzuführen war, die einen dosisabhängigen Zelltod mit typischen morphologischen Veränderungen auslöste. Mit Hilfe der Hoechst 33258-Färbung wurde gezeigt, dass der durch GPM induzierte Zelltod in HepG2-Zellen, der zur Apoptose gehört, für die Expressionsniveaus von Caspase-3 und Caspase-9 nach der GPM-Behandlung erhöht war. Die Western-Blotting-Analyse zeigte auch, dass GPM die Freisetzung von Cyt c und AIF aus den Mitochondrien in das Zytosol stimulieren konnte, was darauf hindeutet, dass die GPM-induzierte Apoptose in HepG2-Zellen durch den mitochondrialen Apoptoseweg vermittelt wird.
Apoptose ist der Hauptkontrollmechanismus, durch den Zellen unter zahlreichen Bedingungen sterben, wie z.B. bei fehlerhafter Reparatur von DNA-Schäden (18). Dieser selbstzerstörerische zelluläre Prozess ist von entscheidender Bedeutung für die Entwicklung von Organen, den Gewebeumbau, die Immunregulation und verschiedene Krankheitszustände (19). Zahlreiche Antitumormittel entfalten ihre therapeutische Wirkung durch Induktion der Apoptose (20-24). Mitochondrien spielen eine wesentliche Rolle bei der Regulierung der Zellapoptose, und es gibt bestimmte Proteine in der Intermembran, die eng mit der Zellapoptose verbunden sind (25).
Die mitochondriale Ultrastruktur ist während der Zellapoptose normal, aber ihre Funktion hat sich erheblich verändert.Mitochondriale Dysfunktion induziert die Öffnung der mitochondrialen Permeabilitätsübergangsporen und setzt mitochondriale apoptogene Proteine frei, wie AIF (26) und Cyt c (27). Normalerweise befinden sich die AIF- und Cyt c-Proteine im Intermembranraum der Mitochondrien, während sie unter der Wirkung verschiedener AIFs aus den Mitochondrien in das Zytoplasma freigesetzt werden. AIF wird schließlich in den Zellkern übertragen und verursacht die charakteristischen Veränderungen der Apoptose. AIF war das erste entdeckte Protein, das den Caspase-unabhängigen Zelltod vermittelt (28). Cyt c wird in das Zytosol freigesetzt und induziert die Caspase-abhängige Apoptose, was zur Aktivierung der Caspasen und zur Apoptose führt (29,30). AIF könnte die apoptotischen Signale verstärken, indem es die mitochondriale Freisetzung von Cyt c fördert. Obwohl die durch AIF induzierte Apoptose nicht von Caspase abhängig ist, gibt es eine Wechselwirkung, Synergie und sogar einen Antagonismus zwischen AIF, Caspase und Cyt c. Aufgrund der verschiedenen Todessignale und Zelltypen erfolgt die Regulierung der Zellapoptose tatsächlich durch verschiedene Interaktionen und das gesamte Signalnetzwerk, die weiter untersucht werden müssen.
Caspase, eine Familie von Cysteinproteasen, ist ein integraler Bestandteil des apoptotischen Weges. Die Induktion der Apoptose ist mit der Aktivierung von Caspase verbunden (31). Caspase-3 befindet sich im Downstream der Zellapoptose, und Caspase-9 ist die apikale Caspase in dem von den Vitochondrien initiierten Apoptoseweg (32). Die Aktivierung von Caspase-3 ist mit der Aktivierung von Caspase-9 korreliert (33). Die Freisetzung von Cyt c löst die Aktivierung von Caspase-9 durch die Bildung des Apoptosoms aus. Die anschließende Aktivierung der Initiator-Caspase-9 bewirkt die Spaltung der Effektor-Caspase-3, die anschließend die DNase aktiviert und die DNA-Fragmentierung im Zellkern verursacht (34). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Caspase-3 eine Vollstrecker-Caspase ist, die durch den folgenden mitochondrialen Weg aktiviert werden kann, der die Aktivierung von Caspase-9 aufgrund der Freisetzung von Cyt c in das Zytosol (35) einschließt und schließlich den programmierten Zelltod verursacht.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass GPM möglicherweise den apoptotischen Zelltod in HepG2-Zellen durch die Aktivierung des mitochondrialen apoptotischen Weges auslöst. Diese Ergebnisse zeigen, dass GPM ein potenzielles Therapeutikum für die Behandlung von HCC sein könnte.
Danksagung
Die vorliegende Studie wurde durch einen Zuschuss des Key Programs for Science and Technology Development of HenanProvince (Nr. 142102310031) unterstützt.
Glossar
Abkürzungen
Abkürzungen:
GPM |
Gecko Peptide Mischung |
Cyt c |
Cytochrom c |
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