Bisulfit-Sequenzierung

Bisulfit-Sequenzierung wendet routinemäßige Sequenzierungsmethoden auf mit Bisulfit behandelte genomische DNA an, um den Methylierungsstatus an CpG-Dinukleotiden zu bestimmen. Es werden auch andere Strategien ohne Sequenzierung angewandt, um die Methylierung an spezifischen Loci oder auf genomweiter Ebene zu untersuchen. Bei allen Strategien wird davon ausgegangen, dass die durch Bisulfit induzierte Umwandlung von unmethylierten Cytosinen in Uracil vollständig ist, und dies dient als Grundlage für alle nachfolgenden Techniken. Im Idealfall würde die verwendete Methode den Methylierungsstatus für jedes Allel separat bestimmen. Zu den alternativen Methoden zur Bisulfit-Sequenzierung gehören die kombinierte Bisulfit-Restriktionsanalyse und die Methyl-DNA-Immunpräzipitation (MeDIP).

Methoden zur Analyse von Bisulfit-behandelter DNA werden ständig weiterentwickelt. Um diese sich schnell entwickelnden Methoden zusammenzufassen, wurden zahlreiche Übersichtsartikel verfasst.

Die Methoden können allgemein in Strategien unterteilt werden, die auf methylierungsspezifischer PCR (MSP) basieren (Abbildung 4), und in Strategien, die die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter nicht-methylierungsspezifischen Bedingungen verwenden (Abbildung 3). Microarray-basierte Methoden verwenden auch PCR unter nicht-methylierungsspezifischen Bedingungen.

Nicht-methylierungsspezifische PCR-basierte MethodenBearbeiten

Abbildung 3: DNA-Methylierungsanalysemethoden, die nicht auf methylierungsspezifischer PCR basieren. Nach der Bisulfit-Konvertierung wird die genomische DNA mit einer PCR amplifiziert, die nicht zwischen methylierten und nicht-methylierten Sequenzen unterscheidet. Die zahlreichen verfügbaren Methoden werden dann verwendet, um die Unterscheidung auf der Grundlage der Veränderungen innerhalb des Amplikons als Ergebnis der Bisulfit-Konvertierung vorzunehmen.

Direkte SequenzierungEdit

Die erste berichtete Methode der Methylierungsanalyse unter Verwendung von Bisulfit-behandelter DNA verwendet PCR und Standard-Dideoxynukleotid-DNA-Sequenzierung, um die Nukleotide, die gegenüber der Bisulfit-Konvertierung resistent sind, direkt zu bestimmen. Die Primer sind so konzipiert, dass sie sowohl strangspezifisch als auch bisulfit-spezifisch sind (d. h. Primer, die Nicht-CpG-Cytosine enthalten, so dass sie nicht komplementär zu nicht-bisulfitbehandelter DNA sind) und die interessierende Methylierungsstelle flankieren (aber nicht einschließen). Daher werden im Gegensatz zur methylierungsspezifischen PCR sowohl methylierte als auch unmethylierte Sequenzen amplifiziert. Alle Stellen mit unmethylierten Cytosinen werden in der resultierenden amplifizierten Sequenz des Sense-Strangs als Thymin und im amplifizierten Antisense-Strang als Adenin dargestellt. Durch den Einbau von Hochdurchsatz-Sequenzierungsadaptern in die PCR-Primer können die PCR-Produkte mit massiver paralleler Sequenzierung sequenziert werden. Alternativ kann das PCR-Produkt auch kloniert und sequenziert werden, was allerdings sehr arbeitsintensiv ist. Nested PCR-Methoden können verwendet werden, um das Produkt für die Sequenzierung zu verbessern.

Alle nachfolgenden DNA-Methylierungsanalysetechniken unter Verwendung von Bisulfit-behandelter DNA basieren auf diesem Bericht von Frommer et al. (Abbildung 2). Obwohl es sich bei den meisten anderen Modalitäten nicht um echte Sequenzierungstechniken handelt, wird der Begriff „Bisulfit-Sequenzierung“ häufig verwendet, um DNA-Methylierungsanalysetechniken mit Bisulfit-Konversion im Allgemeinen zu beschreiben.

PyrosequencingEdit

Pyrosequencing wurde auch verwendet, um Bisulfit-behandelte DNA zu analysieren, ohne methylierungsspezifische PCR zu verwenden. Nach der PCR-Amplifikation der interessierenden Region wird die Pyrosequenzierung verwendet, um die Bisulfit-konvertierte Sequenz spezifischer CpG-Stellen in der Region zu bestimmen. Das Verhältnis von C zu T an einzelnen Stellen kann quantitativ auf der Grundlage der Menge des C- und T-Einbaus während der Sequenzverlängerung bestimmt werden. Die größte Einschränkung dieser Methode sind die Kosten der Technologie. Die Pyrosequenzierung lässt sich jedoch gut auf Screening-Methoden mit hohem Durchsatz ausweiten.

Eine weitere Verbesserung dieser Technik wurde kürzlich von Wong et al. beschrieben, die allelspezifische Primer verwendet, die Einzelnukleotid-Polymorphismen in die Sequenz des Sequenzierprimers einbauen und so eine getrennte Analyse von mütterlichen und väterlichen Allelen ermöglichen. Diese Technik ist besonders nützlich für die Analyse des genomischen Imprinting.

Methylierungssensitive Einzelstrangkonformationsanalyse (MS-SSCA)

Diese Methode basiert auf der Einzelstrangkonformationspolymorphismusanalyse (SSCA), die für die Analyse von Einzel-Nukleotid-Polymorphismen (SNP) entwickelt wurde. SSCA unterscheidet zwischen einzelsträngigen DNA-Fragmenten identischer Größe, aber unterschiedlicher Sequenz auf der Grundlage unterschiedlicher Migration in nicht-denaturierender Elektrophorese. Bei MS-SSCA wird dies zur Unterscheidung zwischen mit Bisulfit behandelten, PCR-amplifizierten Regionen genutzt, die die interessierenden CpG-Stellen enthalten. Obwohl SSCA nicht sehr empfindlich ist, wenn nur ein einziger Nukleotidunterschied vorliegt, führt die Bisulfit-Behandlung häufig zu einer Reihe von C-zu-T-Umwandlungen in den meisten interessierenden Regionen, und die resultierende Empfindlichkeit nähert sich 100%. MS-SSCA bietet auch eine semiquantitative Analyse des DNA-Methylierungsgrades auf der Grundlage des Verhältnisses der Bandenintensitäten. Diese Methode ist jedoch darauf ausgelegt, alle CpG-Stellen in der interessierenden Region als Ganzes zu bewerten und nicht nur einzelne Methylierungsstellen.

Hochauflösende Schmelzanalyse (HRM)

Eine weitere Methode zur Unterscheidung von umgewandelter und nicht umgewandelter, mit Bisulfit behandelter DNA ist die hochauflösende Schmelzanalyse (HRM), eine quantitative PCR-basierte Technik, die ursprünglich zur Unterscheidung von SNPs entwickelt wurde. Die PCR-Amplikons werden direkt durch Temperaturrampen und die daraus resultierende Freisetzung eines interkalierenden Fluoreszenzfarbstoffs während des Schmelzens analysiert. Der Methylierungsgrad, der durch den C-zu-T-Gehalt im Amplikon dargestellt wird, bestimmt die Geschwindigkeit des Schmelzens und die daraus resultierende Freisetzung des Farbstoffs. Diese Methode ermöglicht eine direkte Quantifizierung in einem Ein-Röhrchen-Assay, bewertet aber die Methylierung in der gesamten amplifizierten Region und nicht an spezifischen CpG-Stellen.

Methylierungssensitive Einzelnukleotid-Primerextension (MS-SnuPE)

MS-SnuPE verwendet die Primerextensionsmethode, die ursprünglich für die Analyse von Einzelnukleotid-Polymorphismen entwickelt wurde. Die DNA wird in Bisulfit umgewandelt, und Bisulfit-spezifische Primer werden an die Sequenz bis zu dem Basenpaar unmittelbar vor dem CpG von Interesse angehängt. Der Primer wird mit Hilfe von Dideoxynukleotiden, die die DNA-Polymerase terminieren, um ein Basenpaar in das C (oder T) verlängert, und das Verhältnis von C zu T wird quantitativ bestimmt.

Zur Bestimmung dieses C:T-Verhältnisses kann eine Reihe von Methoden verwendet werden. Zu Beginn stützte sich MS-SnuPE auf radioaktive ddNTPs als Reporter der Primerverlängerung. Fluoreszenzbasierte Methoden oder Pyrosequenzierung können ebenfalls verwendet werden. Zur Unterscheidung zwischen den beiden polymorphen Primer-Extensionsprodukten kann jedoch die MALDI-TOF-Massenspektrometrie-Analyse verwendet werden, die im Wesentlichen auf dem GOOD-Assay für die SNP-Genotypisierung basiert. Die Ionenpaar-Reverse-Phase-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (IP-RP-HPLC) wurde ebenfalls zur Unterscheidung von Primerverlängerungsprodukten verwendet.

Basenspezifische Spaltung/MALDI-TOFEdit

Eine kürzlich von Ehrich et al. beschriebene Methode nutzt die Vorteile der Bisulfit-Umwandlungen weiter, indem sie einen basenspezifischen Spaltungsschritt hinzufügt, um die aus den Nukleotidveränderungen gewonnenen Informationen zu verbessern. Indem zunächst die interessierende Region in vitro in RNA transkribiert wird (durch Hinzufügen einer RNA-Polymerase-Promotorstelle zum PCR-Primer in der anfänglichen Amplifikation), kann RNase A verwendet werden, um das RNA-Transkript an basenspezifischen Stellen zu spalten. Da RNase A RNA spezifisch an Cytosin- und Uracil-Ribonukleotiden spaltet, wird die Basenspezifität durch Zugabe von spaltresistentem dTTP erreicht, wenn eine Cytosin-spezifische (C-spezifische) Spaltung gewünscht ist, und durch Zugabe von dCTP, wenn eine Uracil-spezifische (U-spezifische) Spaltung gewünscht ist. Die gespaltenen Fragmente können dann mittels MALDI-TOF analysiert werden. Die Bisulfit-Behandlung führt entweder zur Einführung/Entfernung von Spaltstellen durch C-zu-U-Umwandlungen oder zur Verschiebung der Fragmentmasse durch G-zu-A-Umwandlungen im amplifizierten Rückwärtsstrang. Die C-spezifische Spaltung schneidet spezifisch an allen methylierten CpG-Stellen. Durch die Analyse der Größe der resultierenden Fragmente kann das spezifische Muster der DNA-Methylierung der CpG-Stellen innerhalb der Region bestimmt werden, anstatt das Ausmaß der Methylierung der Region als Ganzes zu ermitteln. Diese Methode hat sich für das Screening im Hochdurchsatz bewährt und ermöglicht die kosteneffiziente Untersuchung zahlreicher CpG-Stellen in mehreren Geweben.

Methylierungsspezifische PCR (MSP)

Abbildung 4: Die methylierungsspezifische PCR ist eine empfindliche Methode zur diskriminierenden Amplifikation und zum Nachweis einer methylierten Region von Interesse unter Verwendung von methylierungsspezifischen Primern auf bisulfitkonvertierter genomischer DNA. Solche Primer binden nur an Sequenzen, die methyliert sind und somit 5-Methylcytosine enthalten, die gegen die Umwandlung durch Bisulfit resistent sind. Alternativ können unmethylierte spezifische Primer verwendet werden.

Diese alternative Methode der Methylierungsanalyse verwendet ebenfalls mit Bisulfit behandelte DNA, vermeidet aber die Notwendigkeit, den interessierenden Bereich zu sequenzieren. Stattdessen werden die Primerpaare selbst so konzipiert, dass sie „methylierungsspezifisch“ sind, indem sie Sequenzen enthalten, die nur nicht umgewandelte 5-Methylcytosine ergänzen, oder umgekehrt „unmethylierungsspezifisch“, indem sie Thyminen ergänzen, die aus unmethylierten Cytosinen umgewandelt wurden. Die Methylierung wird durch die Fähigkeit des spezifischen Primers bestimmt, eine Amplifikation zu erreichen. Diese Methode ist besonders nützlich, um CpG-Inseln mit möglicherweise hoher Methylierungsdichte zu untersuchen, da eine höhere Anzahl von CpG-Paaren im Primer die Spezifität des Assays erhöht. Durch die Platzierung des CpG-Paares am 3′-Ende des Primers wird auch die Empfindlichkeit verbessert. Der erste Bericht über die Verwendung von MSP beschrieb eine ausreichende Empfindlichkeit, um eine Methylierung von 0,1 % der Allele nachzuweisen. Im Allgemeinen gelten MSP und die damit verbundenen Protokolle als die empfindlichsten, wenn es um die Abfrage des Methylierungsstatus an einem bestimmten Locus geht.

Die MethyLight-Methode basiert auf MSP, bietet jedoch eine quantitative Analyse mittels quantitativer PCR. Es werden methylierungsspezifische Primer und eine methylierungsspezifische Fluoreszenzreportersonde verwendet, die sich an die amplifizierte Region anlagert. Alternativ können die Primer oder die Sonde auch ohne Methylierungsspezifität entworfen werden, wenn eine Unterscheidung zwischen den CpG-Paaren innerhalb der beteiligten Sequenzen erforderlich ist. Die Quantifizierung erfolgt im Verhältnis zu einer methylierten Referenz-DNA. Eine Modifikation dieses Protokolls zur Erhöhung der Spezifität der PCR für erfolgreich bisulfit-konvertierte DNA (ConLight-MSP) verwendet eine zusätzliche Sonde für bisulfit-unkonvertierte DNA, um diese unspezifische Amplifikation zu quantifizieren.

Eine weitere Methode, die MSP-amplifizierte DNA verwendet, analysiert die Produkte mithilfe einer Schmelzkurvenanalyse (Mc-MSP). Bei dieser Methode wird Bisulfit-konvertierte DNA sowohl mit methylierungsspezifischen als auch mit unmethylierungsspezifischen Primern amplifiziert und das quantitative Verhältnis der beiden Produkte durch Vergleich der in einer Schmelzkurvenanalyse erzeugten unterschiedlichen Peaks bestimmt. Eine hochauflösende Schmelzanalysemethode, die sowohl die quantitative PCR als auch die Schmelzanalyse nutzt, wurde insbesondere für den empfindlichen Nachweis von Methylierung auf niedriger Ebene eingeführt

Microarray-basierte MethodenEdit

Microarray-basierte Methoden sind eine logische Erweiterung der verfügbaren Technologien zur Analyse von Bisulfit-behandelter DNA, um eine genomweite Analyse der Methylierung zu ermöglichen. Oligonukleotid-Mikroarrays werden unter Verwendung von Oligonukleotid-Hybridisierungssondenpaaren entwickelt, die auf die interessierenden CpG-Stellen abzielen. Eine Sonde ist komplementär zur unveränderten methylierten Sequenz, die andere ist komplementär zur C-zu-U-konvertierten unmethylierten Sequenz. Die Sonden sind außerdem Bisulfit-spezifisch, um die Bindung an DNA zu verhindern, die durch Bisulfit unvollständig umgewandelt wurde. Der Illumina Methylation Assay ist ein solcher Test, der die Bisulfit-Sequenzierungstechnologie auf Microarray-Ebene anwendet, um genomweite Methylierungsdaten zu erzeugen.