Brainbow
Brainbow-Techniken beruhen auf der Cre-Lox-Rekombination, bei der das Protein Cre-Rekombinase die Inversion oder Exzision von DNA zwischen LoxP-Stellen bewirkt. Die ursprüngliche Brainbow-Methode umfasst sowohl Brainbow-1 als auch Brainbow-2, die unterschiedliche Formen der Cre-Lox-Rekombination nutzen. Brainbow-3, eine modifizierte Version von Brainbow-1, wurde 2013 entwickelt. Bei allen Brainbow-Subtypen ist die Expression eines bestimmten XFP ein stochastisches oder zufälliges Ereignis.
Brainbow-1 verwendet DNA-Konstrukte mit verschiedenen fluoreszierenden Protein-Genen (XFPs), die durch mutierte und kanonische Formen von loxP getrennt sind. Dies schafft eine Reihe von sich gegenseitig ausschließenden Exzisionsmöglichkeiten, da die Cre-vermittelte Rekombination nur zwischen identischen loxP-Stellen stattfindet. Nach der Rekombination wird das fluoreszierende Protein, das direkt hinter dem Promotor verbleibt, eindeutig exprimiert. So kann ein Konstrukt mit vier XFPs, die durch drei verschiedene loxP-Stellen, drei Exzisionsereignisse und das ursprüngliche Konstrukt getrennt sind, vier verschiedene fluoreszierende Proteine erzeugen.
Brainbow-2 verwendet Cre-Exzision und -Inversion, um mehrere Expressionsmöglichkeiten in einem bestimmten Konstrukt zu ermöglichen. In einem DNA-Segment mit zwei entgegengesetzt orientierten XFPs löst Cre eine zufällige Inversion aus, die ein fluoreszierendes Protein in der richtigen Orientierung für die Expression belässt. Wenn zwei dieser invertierbaren Sequenzen aneinandergereiht sind, sind drei verschiedene Inversionsereignisse möglich. Wenn auch Exzisionsereignisse berücksichtigt werden, wird bei einer bestimmten Kombination von Cre-Exzisionen und -Inversionen eines von vier fluoreszierenden Proteinen exprimiert.
Brainbow-3 behält das Brainbow-1-LoxP-Format bei, ersetzt aber die RFP-, YFP- und CFP-Gene durch mOrange2, EGFP und mKate2. mO2, EGFP und mK2 wurden ausgewählt, weil sich ihre fluoreszierenden Anregungs- und Emissionsspektren minimal überschneiden und weil sie eine minimale Sequenzhomologie aufweisen, was die Entwicklung selektiver Antikörper ermöglicht, die zum Nachweis in immunhistochemischen Protokollen verwendet werden können. Brainbow-3 befasst sich auch mit dem Problem der ungleichmäßigen Füllung von Neuronen mit XFPs, indem farnesylierte Derivate der XFPs verwendet werden, die gleichmäßiger zu neuronalen Membranen transportiert werden.
Brainbow wird in vivo implementiert, indem zwei transgene Organismenstämme gekreuzt werden: einer, der das Cre-Protein exprimiert, und ein anderer, der mit mehreren Versionen eines loxP/XFP-Konstrukts transfiziert wurde. Die Verwendung mehrerer Kopien des Transgens ermöglicht es den XFPs, sich so zu kombinieren, dass eine von etwa 100 verschiedenen Farben entsteht. So wird jedes Neuron mit einem anderen Farbton markiert, der auf seiner gegebenen kombinatorischen und stochastischen Expression von fluoreszierenden Proteinen beruht.
Um die unterschiedlichen XFP-Expressionsmuster in eine sichtbare Form zu bringen, werden Gehirnschnitte mit konfokaler Mikroskopie abgebildet. Wenn sie einem Photon mit einer bestimmten Anregungswellenlänge ausgesetzt werden, sendet jedes Fluorophor ein Signal aus, das in einem roten, grünen oder blauen Kanal gesammelt wird, und die resultierende Lichtkombination wird mit einer Datenanalysesoftware analysiert. Die Überlagerung unterschiedlich gefärbter Neuronen ermöglicht die visuelle Entflechtung komplizierter neuronaler Schaltkreise.
Brainbow wurde bisher überwiegend an Mäusen getestet; die oben beschriebene Grundtechnik wurde jedoch seit der Einführung der ursprünglichen Methode im Jahr 2007 auch für den Einsatz in neueren Studien modifiziert.
MiceEdit
Das Gehirn der Maus hat 75.000.000 Neuronen und ist dem menschlichen Gehirn ähnlicher als das von Drosophila und anderen Organismen, die häufig für die Modellierung dieser Technik verwendet werden, wie C. elegans. Mäuse waren die ersten Organismen, bei denen die Brainbow-Methode des Neuroimaging erfolgreich eingesetzt wurde. Livet et al. (2007) entwickelten zwei Versionen von Brainbow-Mäusen, Brainbow-1 und Brainbow-2, die oben beschrieben sind. Um mit diesen Methoden eine vollständige Karte zu erstellen und die Axone eines Mausmuskels zu verfolgen, müssen Zehntausende von Bildern gesammelt und zu Stapeln zusammengestellt werden, um ein vollständiges Schema zu erstellen. Es ist dann möglich, jedes motorische Axon und seine synaptischen Kontakte zu verfolgen, um ein vollständiges Konnektom des Muskels zu erstellen.
Weitere Beispiele für Neuronen, die mit der Brainbow-Technik in transgenen Mäusen untersucht wurden, befinden sich im motorischen Nerv, der die Ohrmuskeln innerviert, in Axonbahnen im Hirnstamm und im Gyrus dentatus des Hippocampus.
DrosophilaEdit
Die Komplexität des Drosophila-Gehirns, das aus etwa 100.000 Neuronen besteht, macht es zu einem hervorragenden Kandidaten für die Anwendung neurophysiologischer und neurowissenschaftlicher Techniken wie Brainbow. Tatsächlich kombinierten Stefanie Hampel et al. (2011) Brainbow in Verbindung mit genetischen Targeting-Tools, um einzelne Neuronen im Drosophila-Gehirn und verschiedene neuronale Linien zu identifizieren. Eines der genetischen Targeting-Tools war ein binäres GAL4/UAS-Expressionssystem, das die Expression von UAS-Brainbow steuert und die Expression auf kleine Gruppen von Neuronen ausrichtet. Durch die Verwendung von Flip-Out-Methoden wurde die zelluläre Auflösung des Reporterkonstrukts erhöht. Die Expression der fluoreszierenden Proteine hing, wie beim ursprünglichen Brainbow, von der Cre-Rekombination ab, die mit passenden Lox-Stellen korrespondiert. Hampel et al. (2011) entwickelten auch ihre eigene Variante von Brainbow (dBrainbow), die auf der Markierung von Epitopen durch Antikörper anstelle von endogener Fluoreszenz beruht. Zwei Kopien ihres Konstrukts ergeben sechs helle, trennbare Farben. Dies und eine vereinfachte Farbzuordnung ermöglichten es ihnen, die Bahnen der einzelnen Neuronen über große Entfernungen zu beobachten. Insbesondere verfolgten sie die motorischen Neuronen vom Antennallappen bis zu den neuromuskulären Verbindungen und konnten so die spezifischen Muskelziele einzelner Neuronen identifizieren.
Letztendlich bietet diese Technik die Möglichkeit, die neuronalen Schaltkreise in Drosophila effizient zu kartieren, so dass die Forscher mehr Informationen über die Gehirnstruktur dieses Wirbellosen und deren Zusammenhang mit dem daraus resultierenden Verhalten herausfinden können.