Der AP-3-Adaptorkomplex vermittelt die Sortierung von Aminosäuretransportern der PQ-Loop-Familie von Hefe und Säugetieren zur vakuolären/lysosomalen Membran

Das Ypq1-Protein kann die vacuolare Membran über den ALP- oder den endosomalen Weg erreichen

Nachdem wir kürzlich berichtet haben, dass ein Ypq1-GFP-Fusionsprotein an der vacuolaren Membran lokalisiert ist6, wollten wir herausfinden, über welchen Transportweg Ypq1 dieses Kompartiment erreicht. Vakuolare Membranproteine können die Vakuole über zwei verschiedene Wege erreichen: den ALP (alkalische Phosphatase)- und den CPY (Carboxypeptidase Y)-Weg, wobei letzterer die Passage der Proteine über Endosomen beinhaltet (Abb. 2A). Um zu testen, ob Ypq1 dem CPY-Weg folgt, untersuchten wir seine intrazelluläre Verteilung in einer pep12Δ-Mutante, der ein t-SNARE fehlt, das an der Vesikelfusion mit dem späten Endosom beteiligt ist13. In dieser Mutante wurde Ypq1-GFP ausschließlich an der Vakuolenmembran gefunden (Abb. 2B). In einer vps27Δ-Mutante, der eine Komponente des endosomalen ESCRT-0-Komplexes fehlt, werden Membranproteine, die über Endosomen transportiert werden, typischerweise in deutlich sichtbaren Klasse-E-Kompartimenten gestapelt, die abnormal vergrößerten Endosomen entsprechen, aber das Ypq1-GFP-Protein wurde in dieser Mutante normalerweise zur Vakuolenmembran gelenkt (Daten nicht gezeigt). Diese Ergebnisse zeigen, dass Ypq1 keinen funktionierenden CPY-Weg benötigt, um die Vakuole zu erreichen. Anschließend haben wir getestet, ob Ypq1 die Vakuolenmembran über den ALP-Weg erreicht. Es ist gut dokumentiert, dass dieser Weg den AP-3-Adaptorkomplex benötigt, von dem angenommen wird, dass er am trans-Golgi wirkt, um Frachtproteine in Vesikel zu sortieren, die anschließend mit den Endosomen fusionieren. Dieser Komplex ist ein Heterotetramer, der aus zwei großen Untereinheiten (β3a und δ), einer mittleren Untereinheit (μ3a) und einer kleinen Untereinheit (σ3) besteht, und das Fehlen einer dieser Untereinheiten führt zu einem mangelhaften AP-3-Komplex14. Wir isolierten daher zwei AP-3-defiziente Stämme, apm3Δ (ohne Untereinheit μ3a) und apl5Δ (ohne Untereinheit δ). In diesen Mutanten wurde Ypq1-GFP an der Vakuolenmembran sowie in kleinen punktförmigen Strukturen gefunden, die leicht mit FM4-64 markiert werden konnten und in Wildtypzellen nicht beobachtet wurden (Abb. 2B). In amp3Δ- und apl5Δ-Mutantenzellen, die ebenfalls ein funktionelles Sec7-mCherry zur Markierung des Golgi exprimieren, war ein hoher Prozentsatz dieser punktförmigen Strukturen mit Sec7-mCherry dekoriert (Abb. 2C) (für eine Quantifizierung der Sublokalisierungsmuster, siehe ergänzende Abb. S1 online). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass sich Ypq1 bei einem Defekt des ALP-Stoffwechsels eher im Golgi anreichert, während ein erheblicher Teil des Proteins die Vakuolenmembran über einen anderen Weg erreicht. Um zu testen, ob es sich bei letzterem um den CPY-Weg handelt, bestimmten wir den Ort von Ypq1-GFP in apm3Δ pep12Δ- und apl5Δ pep12Δ-Doppelmutanten (Abb. 2B). Interessanterweise war die Abgabe von Ypq1-GFP an die Vakuole in diesen Stämmen weitgehend beeinträchtigt, und das Protein wurde größtenteils im Zytosol sowie in punktförmigen Strukturen gefunden, die mit Sec7-mCherry markiert waren (Abb. 2B,C) (für eine Quantifizierung der Sublokalisierungsmuster siehe ergänzende Abb. S1 online). Die Vakuole in diesen Doppelmutanten konnte normal mit FM4-64 markiert werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass Ypq1 sowohl über den ALP- als auch über den CPY-Weg zur Vakuolenmembran sortiert werden kann. In Wildtyp-Zellen nutzt es hauptsächlich den ALP-Weg, aber wenn dieser Weg defizitär ist, verbleibt das Protein länger im Golgi, kann aber dennoch effizient die Vakuolenmembran über den CPY-Weg erreichen. Wenn sowohl der ALP- als auch der CPY-Weg defizitär sind, ist ein kleiner Teil von Ypq1-GFP an der Vakuolenmembran nachweisbar, was darauf hindeutet, dass das Protein noch einen anderen Weg nutzen kann, der jedoch viel weniger effizient ist, um Ypq1 richtig in die Vakuole zu bringen.

Abbildung 2

Ypq1 kann die Vakuolenmembran über den ALP- oder den CPY-Weg erreichen.

(A) Die beiden wichtigsten Transportwege vom trans-Golgi zur Vakuole in der Hefe Saccharomyces cerevisiae. MVB: Multivesikulärkörper (B) Stämme 23344c (ura3), EN046 (pep12∆ ura3), LL057 (apm3∆ ura3), LL061 (apl5∆ ura3), LL088 (apm3∆ pep12∆ ura3) und LL041 (apl5∆ pep12∆ ura3), die mit dem Plasmid pLL063 (YPQ1-GFP URA3) transformiert wurden, wurden auf einem Glucose-Ammonium-Medium gezüchtet. Die Zellen durften FM4-64 15 Minuten lang internalisieren, um die Vakuole vor der Bildgebung zu markieren. (C) Stämme GC004 (ura3 leu2), BOA003 (apm3∆ ura3 leu2), BOA005 (apl5∆ ura3 leu2), BOA007 (apm3∆ pep12∆ ura3 leu2), BOA008 (apl5∆ pep12∆ ura3), die mit den Plasmiden pLL063 (YPQ1-GFP URA3) oder pBOA010 (SEC7-mCherry LEU2) transformiert wurden, wurden auf einem Glucose-Ammonium-Medium gezüchtet. Die Zellen durften CMAC 30 Minuten lang internalisieren, um das vakuoläre Lumen vor der Bildgebung zu markieren. Maßstabsbalken: 10 μm. Eine Quantifizierung der Sublokalisationsmuster von Ypq1-GFP (B) und Ypq1-GFP-Sec7-mCherry (C) ist in der ergänzenden Abbildung S1 online zu finden.

Ein saures Dileucin-Motiv fördert die Sortierung von Ypq1 in den ALP-Signalweg

Die AP-3-abhängige Sortierung von Transmembranproteinen wird häufig durch Tyrosin-basierte (YXXØ) oder Dileucin-basierte (XXXL) Signale vermittelt (wobei Ø ein sperriger hydrophober Rest und X eine beliebige Aminosäure ist)15. Ypq1 enthält eine EQQPLL-Sequenz in seiner zweiten großen Schleife, die dem Zytosol zugewandt ist. Dem Dileucin dieses Motivs geht ein Prolin voraus, ein Merkmal, das bei mehreren Ladungen beobachtet wurde, die den ALP-Weg nutzen16. Eine Dileucin-zu-Dialanin-Substitutionsmutante von Ypq1 (Ypq1LL>AA) ist zwar auf die Vakuolenmembran ausgerichtet, schmückt aber auch punktförmige Strukturen (Abb. 3A). Dieser Phänotyp ähnelt dem, der bei Wildtyp-Ypq1 in AP-3-defizienten Zellen beobachtet wurde, was darauf hindeutet, dass Ypq1LL>AA die Vakuole über den alternativen CPY-Weg erreicht. Zur Untermauerung dieser Ansicht wurde Ypq1LL>AA, das in einer pep12Δ-Mutante produziert wurde, nicht in die Vakuole transportiert, sondern in zytosolische punktförmige Strukturen fehlsortiert, wie dies für Ypq1 in den apm3Δ pep12Δ- und apl5Δ pep12Δ-Mutanten beobachtet wurde (Abb. 3A). Diese Ergebnisse zeigen, dass das saure Dileucin-Motiv von Ypq1 für seine AP-3-abhängige Sortierung in die Vakuole erforderlich ist, nicht aber für seine Pep12-abhängige Abgabe an die Vakuole. Diese Schlussfolgerungen stimmen mit den Ergebnissen einer kürzlich von S. Emr und Mitarbeitern während der Vorbereitung dieses Manuskripts veröffentlichten Studie überein17. Als nächstes untersuchten wir genauer, wie die Ypq1LL>AA-Variante in die Vakuole transportiert wird. Zunächst zogen wir die Möglichkeit in Betracht, dass dieses mutierte Protein, da es den ALP-Weg nicht nutzen kann, zunächst zur Plasmamembran fehlverteilt wird, bevor es eine schnelle Endozytose und eine anschließende Pep12-abhängige Beförderung zur Vakuolenmembran erfährt. Dieses Modell wurde durch unsere Beobachtungen nicht gestützt: Ypq1LL>AA reicherte sich in einer end3Δ-Mutante mit Endozytose-Defekt nicht an der Zelloberfläche an, was darauf hindeutet, dass es die Vakuole über den CPY-Weg erreicht (Abb. 3B). Wir stellten daraufhin die Hypothese auf, dass Ypq1LL>AA über alternative Adaptoren wie den AP-1-Komplex oder die monomeren GGA-Proteine aus dem Golgi in die Vakuole gelangen könnte. Wir exprimierten das mutierte Ypq1LL>AA-Protein in gga1Δ gga2Δ-Zellen, denen die redundanten Gga1- und Gga2-Adaptoren fehlen, und in amp1Δ-, amp2Δ- und apl4Δ-Zellen, denen Untereinheiten des AP-1-Komplexes fehlen. Bei jeder dieser Mutanten wurde festgestellt, dass das Protein immer noch die Vakuole erreicht (Abb. 3B). Diese Beobachtungen legen nahe, dass diese Adaptoren entweder redundant wirken, um die Sortierung von Ypq1LL>AA in die Vakuole über den CPY-Weg zu fördern, oder dass andere Adaptoren beteiligt sind.

Abbildung 3

Ein saures Dileucin-Motiv fördert die Sortierung von Ypq1 zum ALP-Weg.

(A) Die Stämme 23344c (ura3) und EN046 (pep12∆ ura3), die mit dem Plasmid pLL034 (YPQ1LL>AA-GFP URA3) transformiert wurden, wuchsen auf einem Glucose-Ammonium-Medium. Die Zellen durften 15 Minuten lang FM4-64 internalisieren, um die Vakuole vor der Bildgebung zu markieren. (B) Stämme 23344c (ura3), LL115 (end3∆ ura3), JA445 (gga1∆ gga2∆ ura3), LL078 (apm1∆ ura3) und LL066 (apl4∆ ura3), die mit den Plasmiden pLL063 (YPQ1-GFP URA3) oder pLL034 (YPQ1LL>AA-GFP URA3) transformiert wurden, wurden auf einem Glucose-Ammonium-Medium gezüchtet. Die Zellen durften FM4-64 15 Minuten lang internalisieren, um die Vakuole vor der Bildgebung zu markieren. Skalenbalken: 10 μm.

Ypq2 und Ypq3 gelangen ebenfalls über den ALP-Weg in die Vakuole, durchlaufen aber unterschiedliche Schicksale, wenn der ALP-Weg nicht funktioniert

Die Ypq2- und Ypq3-Proteine, die in ihrer Sequenz Ypq1 sehr ähnlich sind, lokalisieren ebenfalls an der Vakuolenmembran6 und enthalten beide auch ein saures Dileucin in der zweiten zytosolischen Schleife. Die Ergebnisse in Abb. 4A zeigen, dass Ypq2 in einer pep12Δ-Mutante normal in die Vakuole wandert. Dies gilt auch für apm3Δ- und apl5Δ-Mutanten, die einen Defekt im ALP-Stoffwechselweg aufweisen, in denen Ypq2 zusätzlich punktförmige Strukturen ausbildet, ein Phänotyp, der in Wildtypzellen nicht beobachtet wurde. Ein hoher Anteil dieser punktförmigen Strukturen war auch mit Sec7-mCherry markiert (Abb. 4B), was darauf hindeutet, dass Ypq2, ähnlich wie Ypq1, dazu neigt, sich im Golgi anzureichern, wenn der ALP-Weg defekt ist. Sowohl in apm3Δ pep12Δ- als auch in apl5Δ pep12Δ-Doppelmutanten verlagerte sich Ypq2 weitgehend in kleine punktförmige zytosolische Strukturen, von denen viele mit Sec7-mCherry dekoriert waren, obwohl ein Teil des Proteins ordnungsgemäß in die Vakuole zu gelangen schien (Abb. 4A,B) (für eine Quantifizierung der Sublokalisierungsmuster siehe ergänzende Abb. S2 online). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass sich Ypq2 wie Ypq1 verhält, indem es in erster Linie den ALP-Weg nutzt, um die Vakuole zu erreichen. Sie zeigen auch, dass Ypq2, wenn dieser Weg defekt ist, länger im Golgi verweilt, aber immer noch zur Vakuolenmembran gelangen kann, hauptsächlich über den CPY-Weg.

Abbildung 4

Ypq2 kann die Vakuolenmembran über den ALP- oder CPY-Weg erreichen.

(A) Stämme 23344c (ura3), EN046 (pep12∆ ura3), LL057 (apm3∆ ura3), LL061 (apl5∆ ura3), LL088 (apm3∆ pep12∆ ura3) und LL041 (apl5∆ pep12∆ ura3), die mit dem Plasmid pLL161 (YPQ2-GFP URA3) transformiert wurden, wurden auf einem Glucose-Ammonium-Medium gezüchtet. Die Zellen durften FM4-64 15 Minuten lang internalisieren, um die Vakuole vor der Bildgebung zu markieren. (B) Stämme GC004 (ura3 leu2), BOA003 (apm3∆ ura3 leu2), BOA005 (apl5∆ ura3 leu2), BOA007 (apm3∆ pep12∆ ura3 leu2), BOA008 (apl5∆ pep12∆ ura3), die mit den Plasmiden pLL161 (YPQ2-GFP URA3) oder pBOA010 (SEC7-mCherry LEU2) transformiert wurden, wurden auf einem Glucose-Ammonium-Medium gezüchtet. Die Zellen durften CMAC 30 Minuten lang internalisieren, um das vakuoläre Lumen vor der Bildgebung zu markieren. Maßstabsbalken: 10 μm. Eine Quantifizierung der Sublokalisationsmuster von Ypq2-GFP (A) und Ypq1-GFP-Sec7-mCherry (B) ist in der ergänzenden Abbildung S2 online zu finden.

Da die Expression eines YPQ3-GFP-Gens unter der Kontrolle des natürlichen Promotors von YPQ3 eine kaum nachweisbare Menge an Ypq3-GFP ergab, exprimierten wir das Fusionsgen unter der Kontrolle eines Galaktose-induzierbaren Promotors. Um das Risiko einer Fehllokalisierung aufgrund einer Überproduktion von Ypq3-GFP zu verringern, wurden die Zellen zunächst auf Raffinose kultiviert, dann wurde für drei Stunden Galaktose zugegeben, und schließlich wurde für zwei Stunden Glukose zugeführt, um die Transkription des YPQ3-GFP-Gens zu unterdrücken. Dieses transient induzierte Ypq3-GFP, das sich in der Zelle auf einem Niveau anreicherte, das dem endogenen Niveau von Ypq1-GFP nahe kam (siehe ergänzende Abb. S3, online), wurde an der Vakuolenmembran lokalisiert (Abb. 5A), was mit unseren früheren Ergebnissen übereinstimmt6. Diese vakuoläre Lokalisierung wurde auch in der pep12Δ-Mutante beobachtet. In den apm3Δ- und apl5Δ-Mutanten wurde Ypq3 jedoch hauptsächlich in das Lumen der Vakuole fehlverteilt. Diese Fehlsortierung war von Pep12 abhängig, da Ypq3 in apm3Δ pep12Δ- und apl5Δ pep12Δ-Doppelmutanten nicht in die Vakuole gelenkt wurde (Abb. 5A) (für eine Quantifizierung der Sublokalisierungsmuster siehe ergänzende Abb. S4 online). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Ypq3 wie Ypq1 und Ypq2 hauptsächlich den ALP-Weg nutzt, um die Vakuolenmembran zu erreichen. Wenn Komponenten des AP-3-Komplexes fehlen, wird Ypq3 in einer Pep12-abhängigen Weise zu Endosomen umgeleitet, wo es in den multivesikulären Körperpfad (MVB) sortiert wird, was dazu führt, dass es in das Vakuolarlumen gelangt. Diese Interpretation wurde durch die Isolierung einer Ypq3LL>AA-Mutante, die vom AP-3-Adaptorkomplex nicht erkannt werden sollte, weiter untersucht. In Wildtyp-Zellen wurde die Ypq3LL>AA-Variante eindeutig in das vakuoläre Lumen fehlverteilt, aber in einer pep12Δ-Mutante wurde sie in kleine zytosolische punktförmige Strukturen umgeleitet (Abb. 5B).

Abbildung 5

Ypq3 wird über den ALP-Weg an die Vakuolenmembran geliefert und in das Vakuolenlumen umgeleitet, wenn die Sortierung über den ALP-Weg defekt ist.

(A) Stämme 23344c (ura3), EN046 (pep12∆ ura3), LL057 (apm3∆ ura3), LL061 (apl5∆ ura3), LL088 (apm3∆ pep12∆ ura3) und LL041 (apl5∆ pep12∆ ura3), die mit dem Plasmid pLL106 (GAL1-YPQ3-GFP URA3) transformiert wurden, wurden auf einem Raffinose-Ammonium-Medium kultiviert, wobei Galaktose (3 %) für 3 Stunden zugegeben und Glukose (3 %) für 2 Stunden zugeführt wurde. Die Zellen durften FM4-64 15 Minuten lang internalisieren, um die Vakuole vor der Bildgebung zu markieren. (B) Stamm 23344c (ura3), der mit den Plasmiden pLL106 (GAL1-YPQ3-GFP URA3) und pLL168 (GAL1-YPQ3LL>AA-GFP URA3) transformiert wurde, und Stamm EN046 (pep12∆ ura3), der mit dem Plasmid pLL168 (GAL1p-YPQ3LL>AA-GFP URA3) transformiert wurde, wurden wie in (A) gezüchtet und analysiert. Maßstabsbalken: 5 μm. Eine Quantifizierung der Sublokalisierungsmuster von Ypq3-GFP ist in der ergänzenden Abbildung S4 online zu finden.

Wir dachten, dass das unterschiedliche Verhalten von Ypq3 im Vergleich zu Ypq1 und Ypq2 in AP-3-defizienten Stämmen auf die Tatsache zurückzuführen sein könnte, dass Ypq3-GFP in Zellen synthetisiert wurde, die in Gegenwart von Galaktose wuchsen, oder weil die Transkription des YPQ3-GFP-Gens durch den starken GAL-Promotor induziert wurde. Dies scheint jedoch unwahrscheinlich, da die Ypq1-GFP- und Ypq2-GFP-Proteine, die in Wildtyp- und Mutantenstämmen mit demselben GAL-Promotor transient induziert wurden, in den Zellen genauso lokalisiert waren wie bei der Expression durch ihre eigenen Genpromotoren (siehe ergänzende Abb. S5 online). Obwohl das Fluoreszenzsignal kaum nachweisbar war, konnten wir nachweisen, dass Ypq3-GFP, das mit dem Promotor des natürlichen YPQ3-Gens exprimiert wurde, die Membranen der Vakuolen im Wildtyp-Stamm markierte, nicht aber in der apl5Δ-Mutante, ein Phänotyp, der sich deutlich von dem unterscheidet, der mit Ypq1-GFP und Ypq2-GFP erhalten wurde. In dieser Mutante war Ypq3-GFP in punktförmigen Strukturen vorhanden, die wahrscheinlich dem Golgi entsprechen, und seine Fehlsortierung in das Vakuolarlumen war nicht deutlich sichtbar, wahrscheinlich weil die Fluoreszenz zu schwach war (siehe ergänzende Abb. S6 online).

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Ypq2- und Ypq3-Proteine, wie oben für Ypq1 gezeigt, hauptsächlich den ALP-Weg nutzen, um die Vakuolenmembran zu erreichen, und zu Endosomen umgeleitet werden, wenn dieser Weg defekt ist. Während jedoch Ypq1 und Ypq2, die durch Endosomen wandern, die Vakuolenmembran effizient erreichen, wird Ypq3 eher in den MVB-Weg sortiert, was zu seiner Ausrichtung auf das Vakuolenlumen führt.

Das in Hefe produzierte PQLC2 nutzt den ALP-Weg und sein Dileucin-Motiv, um die Vakuolenmembran zu erreichen

In einer früheren Studie wurde festgestellt, dass PQLC2 der Ratte in HeLa-Zellen in Lysosomen lokalisiert ist, aber seine PQLC2LL>AA-Mutante, bei der das C-terminale Dileucin durch ein Dialanin ersetzt ist, zeigte eine diffusere Verteilung in der Zelle und wurde teilweise zur Plasmamembran fehlsortiert6. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass das in Hefe produzierte PQLC2 an der Vakuolenmembran lokalisiert ist, wo es funktionell ist, da es den Wachstumsphänotyp einer ypq2Δ-Mutante ergänzt6. Die Ergebnisse in Abb. 6A zeigen, dass PQLC2 in einer pep12Δ-Mutante ordnungsgemäß in der Hefevakuole lokalisiert war, in apm3Δ- und apl5Δ-Mutanten jedoch in das Vakuolarlumen abwich. Diese Ausrichtung auf das vakuoläre Lumen war in apm3Δ pep12Δ- und apl5Δ pep12Δ-Doppelmutanten beeinträchtigt, wo PQLC2 diffus im Zytosol verteilt war (für eine Quantifizierung der Sublokalisierungsmuster siehe ergänzende Abb. S7 online). Wir exprimierten auch die PQLC2LL>AA-Mutante in Wildtyp- und Mutanten-Hefestämmen. In der Wildtyp-Hefe wurde PQLC2LL>AA im Vakuolarlumen lokalisiert, während es in der pep12Δ-Mutante im gesamten Zytosol verteilt war (Abb. 6B). Die Sortierung von Ladungen in den multivesikulären Körperpfad ist typischerweise in einer vps27Δ-Mutante beeinträchtigt, der eine Schlüsselkomponente des ESCRT-0-Komplexes fehlt18. In der vps27Δ-Mutante war PQLC2LL>AA in einem großen perivakuolären Kompartiment gestapelt: dem Klasse-E-Kompartiment, das typischerweise in dieser Mutantenkategorie beobachtet wird (Abb. 6B). Diese Ergebnisse zeigen, dass sich das in Hefe produzierte PQLC2 wie das endogene Ypq3 verhält: Es wird über den ALP-Weg in die Vakuole sortiert, und zwar in einer Weise, die von der korrekten Erkennung seines Dileucin-Motivs durch den AP-3-Adaptor-Komplex abhängt. Wenn diese Erkennung beeinträchtigt ist, weil das Dileucin-Motiv mutiert ist oder eine Komponente des AP-3-Komplexes fehlt, wird PQLC2 zu Endosomen umgeleitet, wo es effizient in den MVB-Weg sortiert wird und schließlich das Vakuolenlumen erreicht.

Abbildung 6

PQLC2, das in Hefe exprimiert wird, wird über den ALP-Weg zur Vakuolenmembran sortiert.

(A) Stämme 23344c (ura3), EN046 (pep12∆ ura3), LL057 (apm3∆ ura3), LL061 (apl5∆ ura3), LL088 (apm3∆ pep12∆ ura3) und LL041 (apl5∆ pep12∆ ura3), die mit dem Plasmid pCJ502 (GAL1-rPQLC2-GFP URA3) transformiert wurden, wurden wie in Abb. 5 vor der Bildgebung behandelt. (B) Die Stämme 23344c (ura3), JA770 (vps27∆ ura3) und EN046 (pep12∆ ura3), die mit dem Plasmid pBOA006 (GAL1-rPQLC2LL>AA-GFP URA3) transformiert wurden, wurden gezüchtet und vor der Bildgebung wie in Abb. 5 behandelt. Maßstabsbalken: 5 μm. Eine Quantifizierung der Sublokalisationsmuster von PQLC2-GFP findet sich in der ergänzenden Abbildung S7 online.

Depletion einer AP-3 Untereinheit beeinträchtigt den Transport von PQLC2 zu Lysosomen

PQLC2-GFP, das in HeLa-Zellen produziert wird, kolokalisiert weitgehend mit dem lysosomalen Marker LAMP1. Die Lokalisierung von PQLC2 an der lysosomalen Membran wurde durch eine semiquantitative massenspektrometrische Analyse von Proteinen in Präparaten, die stark mit lysosomalen Membranen aus Rattenleberzellen angereichert waren, weiter unterstützt6. Um festzustellen, ob der AP-3-Adaptor zur Sortierung von PQLC2 zu den Lysosomen beiträgt, verwendeten wir small interfering RNA (siRNA), um die Synthese der μ3A-Untereinheit von AP-3 in HeLa-Zellen zu hemmen. Die Immunoblot-Analyse bestätigte, dass die beiden typischen Banden, die den μ3A-Untereinheiten19 entsprechen, in μ3A-siRNA-behandelten Zellen im Gegensatz zu Kontrollzellen kaum nachweisbar waren (Abb. 7A). Diese Abreicherung von μ3A führte zu einer starken Störung der Lokalisierung von PQLC2-GFP (Abb. 7B): Das Protein lokalisierte sich größtenteils in zahlreichen intrazellulären punktförmigen Strukturen, die nicht durch den in Lysosomen akkumulierenden Lyso-Tracker-Farbstoff markiert waren, und wurde auch an der Zelloberfläche, einschließlich der Mikrovilli, gefunden, was darauf hindeutet, dass ein Teil des Proteins auch zur Plasmamembran umgeleitet wurde. Dies steht im Gegensatz zur Lokalisierung von PQLC2 in mock-behandelten Zellen, wo das Protein wie erwartet in punktförmigen Strukturen vorhanden war, die ebenfalls stark durch den Lyso-Tracker-Farbstoff markiert waren. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der AP-3 Komplex zur richtigen Lokalisierung von PQLC2 in Lysosomen beiträgt. Wir untersuchten auch die Lokalisierung der PQLC2LL>AA-Mutante (Abb. 7C). In HeLa-Kontrollzellen war PQLC2LL>AA in intrazellulären punktförmigen Strukturen verteilt, die nicht oder nur sehr schwach durch den Lyso-Tracker-Farbstoff markiert waren, und es war auch deutlich an der Zelloberfläche vorhanden, was mit früheren Beobachtungen übereinstimmt6. Diese Lokalisierung war in μ3A-siRNA-behandelten Zellen nicht signifikant gestört, was die Ansicht unterstützt, dass die Rolle des Dileucinmotivs von PQLC2 darin besteht, den intrazellulären Verkehr über den AP-3-Komplex zu vermitteln. Als nächstes untersuchten wir, ob PQLC2LL>AA in das Lumen von endosomalen/lysosomalen Kompartimenten umgeleitet wird, wie wenn es in Hefe produziert wird. HeLa-Zellen, die PQLC2-GFP exprimieren, wurden zwei Stunden lang mit Vacuolin-1 behandelt, einer Verbindung, die eine homotypische Fusion von Kompartimenten des endosomalen/lysosomalen Systems induziert, was zur Bildung großer, geschwollener Strukturen führt (Abb. 8). Es wurde festgestellt, dass PQLC2-EGFP wie erwartet an der Grenzmembran dieser vergrößerten endosomalen/lysosomalen Kompartimente lokalisiert ist. Dasselbe gilt für Zellen, die PQLC2LL>AA produzieren, was darauf hindeutet, dass das mutierte Protein nicht effizient in den MVB-Weg sortiert wird. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der AP-3-Adaptorkomplex eine wichtige Rolle bei der Ausrichtung von PQLC2 auf das Lysosom zu spielen scheint, höchstwahrscheinlich über die Erkennung seines C-terminalen Dileucins. Wenn diese Erkennung beeinträchtigt ist, wird das Protein zur Zelloberfläche und zur Grenzmembran der internen Kompartimente abgelenkt.

Abbildung 7

Der AP-3-Adapterkomplex ist für die Lokalisierung von PQLC2 im Lysosom in HeLa-Zellen erforderlich.

(A) HeLa-Zellen wurden dreimal mit siRNAs transfiziert, die gegen die μ3A-Untereinheit des AP3-Komplexes gerichtet waren. 48 Stunden nach der dritten Transfektionsrunde wurden äquivalente Mengen an Homogenaten von mock- und siRNA-behandelten Zellen einer SDS-PAGE und einem Immunoblotting mit einem Antikörper gegen die μ3A-Untereinheit des AP3-Komplexes unterzogen. Die Zahlen entsprechen den relativen Mengen der μ3A-Untereinheit, die anhand von Actin als Referenz geschätzt wurden (B) Bei der dritten Transfektionsrunde mit siRNAs wurden die Zellen mit den Plasmiden rPQLC2-EGFP oder rPQLC2LL>AA-EGFP kotransfiziert. Nach 48 Stunden wurden die Zellen für 2 Stunden mit dem Lysotracker-Red DND-99 inkubiert und vor der Bildgebung fixiert. Skalenbalken: 10 μm.

Abbildung 8

PQLC2 wird nicht in das Lumen der Lysosomen transportiert, wenn die Sortierung über den AP-3-Komplex gestört ist.

HeLa-Zellen, die mit den Plasmiden PQLC2-EGFP oder PQLC2LL>AA-EGFP transfiziert wurden, wurden 2 Stunden lang mit Vacuolin-1 behandelt. Die Zellen wurden fixiert und mittels Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Scale bar: 10 μm.