Der Aryl-Kohlenwasserstoff-Rezeptor-Kerntranslokator (ARNT/HIF-1β) wird von Hypoxie und Hypoxie-Mimetika beeinflusst

Abstract

Hintergrund: Der Aryl Hydrocarbon Receptor Nuclear Translocator (ARNT, HIF-1β) ist ein Mitglied der basic-Helix-Loop-Helix PER/ARNT/SIM (bHLH/PAS) Proteinfamilie und ein wichtiger Transkriptionsregulator in Bezug auf Entwicklung und physiologische Anpassungsprozesse. Es wird diskutiert, dass ARNT mit Krebs und anderen Krankheiten in Verbindung gebracht wird. Es ist bekannt, dass ARNT in den Zellkern verlagert wird, wo eine Akkumulation des Proteins stattfindet. ARNT ist ein Heterodimerisierungspartner des durch einen xenobiotischen Liganden aktivierten Aryl-Kohlenwasserstoff-Rezeptors (AhR), der Single Minded Proteine (SIM), des kardiovaskulären Helix-Loop-Helix-Faktors 1 und der Hypoxia Inducible Factor Proteine (HIF-α). ARNT ist obligatorisch für die Bindung von HIF-1, HIF-2 und HIF-3 an die DNA. Während der Abbau der HIF-α-Untereinheiten durch Hypoxie unterdrückt wird, wird ARNT im Allgemeinen als konstitutiv und im Überschuss in der Zelle exprimiert angesehen, und es wird allgemein angenommen, dass die Stabilisierung sauerstoffunabhängig ist. Wir haben jedoch nachgewiesen, dass die Regulierung von ARNT weitaus komplexer ist. Das Ziel unserer Studie war es, die Regulierung der ARNT-Expression neu zu bewerten. Methoden: Wir untersuchten Zelllinien unterschiedlicher Herkunft wie MCF-7 und T47D (menschlicher Brustkrebs), HeLa (menschliches Zervixkarzinom), Hep3B und HepG2 (menschliches Hepatom), Kelly (menschliches Neuroblastom), REPC (menschliche Niere) und Cos7 (primäre Primaten-Niere). Wir verwendeten Immunoblot-Analyse, Densitometrie, RT-PCR und transiente Transfektion. Ergebnisse und Schlussfolgerungen: Unsere Ergebnisse zeigen, dass der ARNT-Proteinspiegel durch Hypoxie und Hypoxie-Mimetika wie Kobalt(II)-chlorid (CoCl2) und Dimethyloxalylglycin (DMOG) zelllinienspezifisch beeinflusst wird. Wir zeigen, dass dieser Effekt durch HIF-1α ausgelöst werden könnte, das eine wichtige Rolle im Prozess der Stabilisierung von ARNT in Hypoxie spielt.

© 2013 S. Karger AG, Basel

Einführung

Der Aryl Hydrocarbon Receptor Nuclear Translocator (ARNT) ist ein Mitglied der basic-Helix-Loop-Helix PER/ARNT/SIM (bHLH/PAS) Proteinfamilie und ein entscheidender Transkriptionsregulator in Bezug auf die Organogenese und neurale Entwicklung sowie physiologische Anpassungsprozesse an Hypoxie und Schadstoffe. Neben ARNT (HIF-1β) existieren zwei weitere Isoformen ARNT2 und ARNT3 (BMAL1, MOP3, JAP3, ARNTL1) in verschiedenen Arten. ARNT und ARNT2 haben eine >90%ige Aminosäureidentität. ARNT hat ein ubiquitäreres Expressionsmuster als ARNT2 in adultem Gewebe. Jüngste Studien berichten über einen Zusammenhang zwischen ARNT und verschiedenen Zellfehlfunktionen und Krankheiten wie Krebs und Diabetes.

Wie alle bHLH-Moleküle muss ARNT dimerisieren, um aktive DNA-Bindungskomplexe zu bilden. Es ist bekannt, dass ARNT Heterodimere mit dem durch einen xenobiotischen Liganden aktivierten Aryl-Kohlenwasserstoff-Rezeptor (AhR), mit dem metabolisierende Enzyme induziert werden, mit HIF-α-Untereinheiten (Hypoxia Inducible Factors) bei niedrigem Sauerstoffgehalt, mit SIM-Proteinen (Single Minded) für die neuronale Entwicklung und mit CHF1 (Cardiovascular Helix-Loop-Helix Factor 1) bildet. Wir haben zuvor gezeigt, dass ARNT höchstwahrscheinlich durch klassischen nukleären Import, der durch Importine α/β vermittelt wird, in den Zellkern verlagert wird. Trotz eines gleichzeitigen nukleären Exports akkumuliert ARNT hauptsächlich im Zellkern.

In Hypoxie werden die α-Untereinheiten der Hypoxia Inducible Factors (HIF-α) stabilisiert und bilden Heterodimere mit ARNT (HIF-1β), die die zelluläre Reaktion auf niedrige Sauerstoffwerte regulieren. Derzeit sind drei verschiedene Isoformen der sauerstoffabhängigen HIF-α-Untereinheiten bekannt: HIF-1α, HIF-2α (EPAS1) und HIF-3α . Unter normoxischen Bedingungen werden HIF-α-Proteine durch Prolyl-Hydroxylase-Domain-Enzyme 1-3 (PHD1-3) hydroxyliert. Prolyl-hydroxyliertes HIF-α dient als Erkennungsmotiv für die Polyubiquitinierung durch Von-Hippel-Lindau-Protein (pVHL) und den anschließenden proteasomalen Abbau. ARNT fehlt jedoch die sauerstoffabhängige Degradationsdomäne (ODDD), und es wird davon ausgegangen, dass es unter normoxischen Bedingungen ständig exprimiert wird. Derzeit wird davon ausgegangen, dass Hypoxie keine Auswirkungen auf den ARNT-Spiegel hat. Es gibt jedoch vereinzelte Studien, die einen teilweise begleitenden Anstieg der ARNT-Proteinspiegel bei Hypoxie beobachten. Hier liefern wir den Beweis, dass die ARNT-Expression in der Tat beeinflusst und moduliert wird, je nach dem untersuchten Zelltyp. Dies deutet darauf hin, dass Tumorzellen während der Tumorentstehung die Fähigkeit verlieren könnten, ARNT zu regulieren. Unsere Daten zeigen, dass die Regulierung der ARNT-Expression weitaus komplexer ist als allgemein angenommen.

In unserer Studie haben wir die Expression von ARNT unter verschiedenen Arten von Hypoxie, Hypoxie-Mimetika und Hypoxia Inducible Factors untersucht und dabei zelllinienspezifische und kofaktorabhängige Expressionsmuster festgestellt.

Materialien und Methoden

Zellkultur, Hypoxie-Induktion und Hypoxie-Mimetika

Die Zelllinien MCF-7 (menschliches duktales Mammakarzinom), T47D (menschliches duktales Mammakarzinom), Hep3B (menschliches hepatozelluläres Karzinom), HeLa (menschliches Adenokarzinom des Gebärmutterhalses), HepG2 (menschliches hepatozelluläres Karzinom) und Cos-7 (Primatenfibroblasten-ähnliche Nierenzellen) wurden in DMEM-Nährmedium (Gibco) inkubiert. Die Zelllinien REPC (primäre menschliche Niere) und Kelly (menschliches Neuroblastom) wurden in RPMI-1640-Medium (Gibco) kultiviert. Das Kulturmedium wurde mit 10 % fetalem Kälberserum (FCS, Gibco) und 100 IE/ml Penicillin bzw. 100 µg/ml Streptomycin ergänzt. Die Zellen wurden in einer befeuchteten Atmosphäre bei 37°C, 5% CO2 und 20,9% O2 (Normoxie) gezüchtet. Für hypoxische Studien wurden die Zellen in einer befeuchteten Atmosphäre bei 37°C, 5% CO2, ausgewogenem N2 und entweder 1% oder 3% O2 gehalten. Cobalt(II)-chlorid (CoCl2) wurde in einer 50 µM-Verdünnung und Dimethyloxalylglycin (DMOG) in einer 1 mM-Verdünnung als Hypoxie-Mimetikum verwendet.

Transiente Transfektion

Die Zelllinien MCF-7, T47D und Hep3B wurden mit siRNA unter Verwendung von Lipofectamine™ RNAiMAX-Transfektionsreagenz (Invitrogen) transfiziert. Die Zellen wurden in 6-Well-Kulturplatten auf 50 % Konfluenz gezüchtet, bevor die Transfektion nach dem Protokoll des Herstellers durchgeführt wurde. Vor der Anwendung von Hypoxie wurde das Kulturmedium gewechselt, und die Zellen wurden weitere 6 Stunden unter normoxischen Bedingungen inkubiert.

Immunoblot-Analyse und Densitometrie

Für das Western Blotting wurden die Zellen nach der Behandlung entnommen, mit eiskaltem PBS gewaschen, mit Harnstoff-Lysepuffer extrahiert und mit dem Ultraschall zu Ganzzell-Lysaten verarbeitet. Die Proteinkonzentrationen wurden mit dem Bio-Rad DC Protein Assay nach dem Protokoll des Herstellers bestimmt. Die Proteinextrakte wurden mittels SDS-PAGE elektrophoretisiert und durch halbtrockenes Elektroblotting auf Nitrocellulosemembranen übertragen. Die Membranen wurden mit 5% fettfreier Milch in PBS blockiert. Primäre Antikörper (HIF-1α: BD transduction, 1:1000; ARNT: Novus 1:1000) wurden über Nacht inkubiert, gefolgt von der Zugabe HRP-korrespondierender sekundärer Antikörper (DAKO 1:5000) für 2 Stunden. Als Nachweisreagenz wurde ECL (GE Healthcare) verwendet. Die Proteinmenge wurde mit dem Aida Image Analyser v.4.27 (Raytest) gemäß den Protokollen verglichen. Der Hintergrund jedes Western Blots wurde von der individuellen Messfläche abgezogen. Die entsprechende Lamin A/C-Beladung wurde als 100% angesehen und der proportionale Wert berechnet.

RNA-Isolierung und RT-PCR

Um die spezifischen quantitativen mRNA-Spiegel zu messen, wurde die Gesamt-RNA aus den Zellen mit der ABI Prism 6100 Nucleic Acid PrepStation (Applied Biosystems) gemäß den Anweisungen des Herstellers isoliert. Anschließend wurden 0,2 µg RNA mit Superscript III (Invitrogen) revers transkribiert. Die erzeugte cDNA wurde als Vorlage für die quantitative Echtzeit-PCR-Analyse (RT-PCR) verwendet. Die RT-PCR wurde mit ABI 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems), TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) und KAPA SYBR FAST Universal (Peqlab) durchgeführt. Die Amplifikation wurde mit TaqMan Gene Expression Assays (Hs01100353_m1, Applied Biosystems) gemäß den Herstellerprotokollen durchgeführt. Für die Normalisierung wurden Primer verwendet, die spezifisch für das Haushaltergen L28 sind (sense: 5`-ATGGTCGTGCGGAACTGCT-3` und reverse: 3`-TTGTAGCGGAAGGAATTGCG-5`). Die Zyklusbedingungen waren ein anfänglicher Polymerase-Aktivierungsschritt bei 95 °C für 10 min, gefolgt von 45 Zyklen bei 95 °C für 15 s, 55 °C für 30 s und bei 72 °C für 20 s. Die Proben wurden in vierfacher Ausführung analysiert und die relativen Mengen an mRNA wurden mit der ∆∆CT-Methode berechnet.

Statistik

Die statistische Analyse wurde mit der GraphPad InStat Software durchgeführt. Es wurde ein ungepaarter t-Test durchgeführt. Die Diagramme sind als Mittelwerte ± Standardabweichung (SD) dargestellt. MTT-Überlebenstests wurden durchgeführt (Daten nicht gezeigt), um sicherzustellen, dass sich das Zellüberleben zwischen den Proben nicht unterscheidet.

Ergebnisse

ARNT-Expression wird bei Hypoxie in MCF-7, HeLa, Hep3B- und REPC-Zellen

Wir untersuchten die ARNT-Proteinmenge, indem wir MCF-7-Zellen 24 Stunden lang unter normoxischen Bedingungen (21% O2) wachsen ließen, gefolgt von entweder 48 Stunden Normoxie (Nox) oder 24 Stunden Normoxie und 24 Stunden Hypoxie 1% (Hox 1% 24h, 1% O2) oder nur 48 Stunden Hypoxie 1% (Hox 1% 48h, 1% O2). Ganze Zellextrakte wurden durch Immunoblotting mit einem monoklonalen Maus-Anti-ARNT-Antikörper analysiert. Das HIF-1α-Protein wurde beobachtet, um die Induktion von hypoxischen Zellen zu bestätigen. Wie in Abb. 1 gezeigt, waren die ARNT-Proteinspiegel als Reaktion auf Hypoxie in MCF-7-Zellen erhöht. Eine 24-stündige Inkubation mit 1%iger Hypoxie führte zu einem signifikanten Anstieg von ARNT im Vergleich zu einer 48-stündigen Inkubation mit 1%iger Hypoxie.

MCF-7-Zellen wurden bis zu 96 Stunden in 1 %iger Hypoxie inkubiert, um die Langzeiteffekte der Hypoxie aufzuzeigen. MCF-7-Zellen zeigten nach 12 Stunden einen Anstieg der ARNT-Konzentration. Bei weiterer Exposition gegenüber Hypoxie begannen die ARNT-Konzentrationen auf einen Grundwert zu sinken (Abb. 2).

Die ARNT-Induktion aufgrund unterschiedlicher Intensitäten von Hypoxie wurde gemessen, indem MCF-7-Zellen 12 Stunden und 24 Stunden lang in 3%iger Hypoxie (3% O2) und 1%iger Hypoxie (1% O2) kultiviert wurden (Abb. 3a). 3a).

Um die Unterschiede zwischen den verschiedenen Zelllinien herauszufinden, kultivierten wir HeLa-, Hep3B- und REPC-Zellen ähnlich wie MCF-7-Zellen (Abb. 3b-d). In allen mit Hypoxie behandelten Zelltypen waren die ARNT-Proteinspiegel erhöht. 1 %ige Hypoxie führte zu einem schnelleren Anstieg der ARNT-Proteinspiegel, aber auch zu einer früheren Normalisierung als 3 %ige Hypoxie. 3%ige Hypoxie zeigt eine maximale Induktion von ARNT nach 24 Stunden.

Unterschiedliche Zelllinien zeigen unterschiedliche Reaktionen auf Hypoxie und Hypoxie-Mimetika hinsichtlich der ARNT-Proteinspiegel

Um einen Zusammenhang zwischen ARNT-Spiegeln und HIF-α zu untersuchen, wurden MCF-7-, HeLa-, Cos7-, REPC-, HepG2-, Hep3B- und Kelly-Zellen mit den Hypoxie-Mimetika Kobalt(II)-chlorid (CoCl2) und Dimethyloxalylglycin (DMOG) behandelt (Abb. 4a-g).

HepG2- und Kelly-Zellen reagierten auf 24 Stunden Hypoxie nicht mit einem Anstieg der ARNT-Proteinspiegel. HeLa-Zellen zeigten eine leichte ARNT-Induktion bei Hypoxie und unter Behandlung mit Hypoxie-Mimetika, aber dieser Effekt war statistisch nicht signifikant. MCF-7-Zellen zeigten einen deutlichen Anstieg der ARNT-Proteinkonzentration unter 24 Stunden 3%iger Hypoxie und einen Anstieg der ARNT-Proteinkonzentration durch CoCl2-Behandlung. Andererseits hatte die Behandlung mit DMOG keinen Einfluss auf die ARNT-Spiegel in MCF-7-Zellen, obwohl DMOG ein sehr starker HIF-Stabilisator ist. Cos7-Zellen zeigten eine starke Wirkung der ARNT-Induktion auf Hypoxie sowie auf die Hypoxie-Mimetika CoCl2 und DMOG. REPC-Zellen zeigten eine starke Reaktion auf Hypoxie, die CoCl2-Induktion von ARNT war jedoch relativ gering. DMOG reduzierte die ARNT-Proteinspiegel in REPC-Zellen. HepG2-Zellen reagierten weder auf Hypoxie noch auf DMOG mit einer Induktion des ARNT-Proteinspiegels. HepG2-Zellen zeigten jedoch eine sehr starke ARNT-Induktion durch CoCl2. Hep3B-Zellen reagierten mit einem Anstieg des ARNT-Proteinspiegels auf alle Behandlungen. Kelly-Zellen zeigten keine Reaktion auf den ARNT-Proteinspiegel, weder auf Hypoxie noch auf Hypoxie-Mimetika.

Veränderungen des ARNT-mRNA-Spiegels korrelieren nicht mit dem ARNT-Proteinspiegel unter dem Einfluss von Hypoxie und Hypoxie-Mimetika

Wir untersuchten mit der quantitativen RT-PCR-Methode den mRNA-Spiegel im Zusammenhang mit den beobachteten Veränderungen des ARNT-Proteinspiegels. MCF-7-, HeLa-, REPC- und Hep3B-Zellen wurden unter normoxischen Bedingungen gezüchtet, bevor sie 24 Stunden lang mit 3% Hypoxie, 1% Hypoxie, CoCl2 und DMOG behandelt wurden (Abb. 5). MCF-7-Zellen zeigten einen unbedeutenden Rückgang der ARNT-mRNA-Spiegel als Reaktion auf Hypoxie. Es wurde jedoch eine signifikante Verringerung der ARNT-mRNA-Spiegel durch die Behandlung mit CoCl2 und DMOG beobachtet. Während HeLa- und REPC-Zellen nach Behandlungen keine Auswirkungen auf die ARNT-mRNA-Spiegel zeigten, reagierten Hep3B-Zellen auf Hypoxie mit einer starken Verringerung der ARNT-mRNA. Bei diesen Zellen wurde eine etwas geringere Reaktion auf CoCl2 beobachtet.

ARNT-Protein wird in Gegenwart von HIF-1α stabilisiert

MCF-7-, T47D- und Hep3B-Zellen wurden transient mit HIF-1α siRNA transfiziert, um die Wirkung von Hif-1α auf die ARNT-Proteinspiegel zu klären (Abb. 6). Die Zellen wurden 48 Stunden lang unter Normoxie mit dem Transfektionsreagenz RNAiMAX und siRNA inkubiert, gefolgt von einer 6-stündigen Erholungsphase. Anschließend wurden die Zellen für 24 Stunden in 1%iger Hypoxie gehalten. Wir beobachteten, dass die ARNT-Proteinspiegel unter Hypoxie abnahmen, wenn HIF-1α blockiert wurde. Die unspezifische siRNA-Transfektion hatte jedoch keinen Einfluss auf den beobachteten Anstieg der ARNT-Proteinkonzentration unter Hypoxie.

Diskussion

Der Aryl-Kohlenwasserstoff-Rezeptor-Nukleartranslokator (ARNT/HIF-1β) spielt eine Rolle als zentraler Transkriptionsregulator in der zellulären Homöostase. Er fungiert als Heterodimerisierungspartner verschiedener wichtiger Regulatorproteine, wie HIF-α, SIM-Proteine, AhR und CHF1. Daher ist es an einer Vielzahl verschiedener zellulärer Regulationswege beteiligt. Da man davon ausgeht, dass ARNT konstitutiv exprimiert wird und durch physiologische oder pharmakologische Veränderungen, z. B. Hypoxie, nicht beeinflusst wird, wurde ARNT in früheren Berichten nicht als limitierender Faktor und mögliches therapeutisches Ziel angesehen. Neuere Studien berichten jedoch über einen Zusammenhang zwischen ARNT und verschiedenen Krankheiten, wie z. B. Krebs. Es ist bekannt, dass HIF-1α und HIF-2α entscheidende Funktionen bei der Krebsentwicklung und/oder -therapie haben. Da ARNT ein obligatorischer Kofaktor ist, würde ein Mangel an ARNT zu einer Inaktivität oder einem Rückgang der HIF-α-Komplexe führen. Um die Bedeutung von ARNT weiter zu unterstreichen, zeigen wir zum ersten Mal, dass Hypoxie, Hypoxie-Mimetika und HIF-1α je nach Zelltyp eine wichtige Rolle bei den Regulationsmechanismen der ARNT-Expression spielen.

Wir untersuchten acht verschiedene Zelllinien von zwei verschiedenen Wirtsarten, um den Einfluss von Hypoxie und Hypoxie-Mimetika auf die ARNT-Proteinexpression nachzuweisen. MCF-7-Brustkrebszellen reagieren auf Hypoxie mit einem Anstieg der ARNT-Proteinkonzentration, während die ARNT-mRNA-Konzentration zu sinken oder unverändert zu bleiben scheint. Dies deutet darauf hin, dass eine wechselseitige Rückkopplung zwischen Proteinstabilisierung und De-novo-Synthese besteht. Ähnliche Down- und Up-Regulationen der Gentranskription bei Hypoxie sind für mehrere Enzyme und Moleküle bekannt. Unsere Ergebnisse sind nicht notwendigerweise das Ergebnis einer allgemeinen Verringerung der mRNA-Synthese in der Zelle als Antwort auf den Zellstress, da die Transkription des ESR2-Gens bei Hypoxie und HIF-1α-Knockdown induziert wird (unveröffentlichte Daten).

Die Exposition gegenüber Hypoxie über einen längeren Zeitraum als 48 Stunden führt zu einer Rückkehr zu den basalen ARNT-Proteinspiegeln, die auch bei Normoxie zu beobachten sind. Ein ähnlicher Peak der Expression ist für das HIF-1α-Protein nach 4 bis 12 Stunden unter hypoxischer Behandlung bekannt. Eine weitere hypoxische Inkubation führt zu einem Rückgang der HIF-1α-Konzentrationen, bis ein Steady-State erreicht ist. Diese Tatsache könnte auf eine stabilisierende Wirkung der HIF-1α-Überexpression auf ARNT hinweisen. Die Bildung von HIF-1α/ARNT-Komplexen im Zellkern könnte den Abbau von ARNT durch Proteasomen verhindern, was im Einklang mit Choi et al. und Mandl et al. steht. Um unsere Ergebnisse zu untersuchen, haben wir HIF-1α in MCF-7-Zellen vorübergehend ausgeschaltet und eine Verringerung der ARNT-Proteinspiegel um bis zu 90 % bei Hypoxie im Vergleich zu Normoxie beobachtet. Dieser Effekt konnte auch in T47D- und Hep3B-Zellen beobachtet werden. Eine Kreuzreaktion von HIF-1α siRNA, die ARNT ausschaltet, konnte aufgrund der starken Sequenzhomologie zwischen ARNT und HIF-α durch eine In-silico-Analyse der siRNA- und Gensequenzen ausgeschlossen werden. Diese Ergebnisse deuten auf eine starke Korrelation zwischen ARNT und der HIF-1α-Proteinexpression hin. Eine Erklärung könnte eine stabilisierende Wirkung der O2 unabhängigen ARNT-Bindungspartner, wie AhR, SIM und CHF1, auf ARNT in Normoxie sein. In Hypoxie könnten die reduzierten Werte von AhR, SIM und CHF1 durch eine Überexpression von HIF-α hinsichtlich der ARNT-Stabilisierung kompensiert werden. Das Ausschalten von HIF-1α könnte daher zu stark verringerten ARNT-Spiegeln führen, da die De-novo-Synthese reduziert wird und die Stabilität gegenüber Ubiquitinierung und proteasomalem Abbau abnimmt, da die Dimerisierungspartner fehlen. Diese Hypothese würde eine stark von Bindungspartnern abhängige Regulation von ARNT unterstreichen, was im Einklang mit Choi et al. und Mandl et al. stehen würde. Um zu untersuchen, ob die HIF-α-Induktion zu einem gleichzeitigen Anstieg der ARNT-Expression führt, behandelten wir die Zellen mit CoCl2 und DMOG. Obwohl die HIF-α-stabilisierende Wirkung von CoCl2 und DMOG analog ist, reagieren MCF-7-Zellen nach DMOG weniger stark mit einem Anstieg des ARNT-Proteins als nach CoCl2-Behandlung. Diese Beobachtungen stehen im Einklang mit einer HIF-α-stabilisierenden Wirkung auf ARNT. Ein entgegengesetztes Verhalten zwischen CoCl2, das ARNT induziert, und DMOG konnte in HepG2-Zellen beobachtet werden. Interessanterweise reagieren REPC-Zellen mit einer Abnahme der ARNT-Spiegel unter DMOG-Behandlung. Obwohl die HIF-α-stabilisierende Wirkung von DMOG ähnlich ist wie die von CoCl2, ist eine andere zelluläre Reaktion durch DMOG aufgrund einer anderen Wirkungsweise nicht ungewöhnlich. Andererseits reagieren Cos7- und Hep3B-Zellen auf Hypoxie und beide Hypoxie-Mimetika mit einem starken Anstieg der ARNT-Proteinspiegel, was mit der von Mandl et al. postulierten HIF-α-stabilisierenden Wirkung übereinstimmt. Die Tatsache, dass im Gegensatz zu verschiedenen Tumorzelllinien die ARNT-Spiegel in der primären Zelllinie Cos7 durch Hypoxie und Hypoxie-Mimetika gut beeinflusst werden, könnte auf einen Funktionsverlust während der Tumorigenese in bestimmten Tumoren hindeuten. Daten über ARNT in der zellulären Krebsentwicklung sind spärlich und daher sind weitere Untersuchungen erforderlich.

Die Hep3B-Zelllinie zeigt einen signifikanten Anstieg der ARNT-Proteinspiegel durch alle drei hypoxischen Behandlungen, während Hypoxie und CoCl2 die ARNT-mRNA signifikant reduzieren. Diese Ergebnisse unterstützen die Hypothese eines wechselseitigen Rückkopplungsmechanismus, der auch bei MCF-7-Zellen vermutet werden kann. Die REPC-Nierenzelllinie zeigt ein abweichendes Verhalten. Diese Zellen reagieren mit einem starken Anstieg des ARNT-Proteins aufgrund von Hypoxie, aber mit einer weniger starken Induktion aufgrund von CoCl2 und im Gegensatz dazu mit sinkenden ARNT-Proteinspiegeln unter DMOG-Behandlung, wie oben beschrieben. Aber auch REPC-Zellen zeigen keine Unterschiede in den ARNT-mRNA-Spiegeln unter den verschiedenen Behandlungen, was auf eine Regulierung auf Proteinbasis hindeutet.

Kelly-Zellen zeigen stabile ARNT-Proteinspiegel. Weder Hypoxie noch Hypoxie-Mimetika sind in der Lage, ARNT zu beeinflussen. Solche stabilen ARNT-Spiegel sind auch in HepG2-Zellen bei Hypoxie und DMOG-Behandlung zu beobachten, aber diese Zelllinie reagiert mit einem starken Anstieg des ARNT-Proteins bei CoCl2-Behandlung. HeLa-Zellen zeigen keine signifikante Veränderung des ARNT-Spiegels, weder hinsichtlich des Proteins noch der mRNA. Diese Ergebnisse stützen die derzeitige Meinung, dass ARNT konstant exprimiert wird und nicht durch Hypoxie beeinflusst wird, wie von Semenza beschrieben. Wir und andere haben gezeigt, dass diese Ansicht nicht verallgemeinert werden kann. Wir liefern hiermit Daten, die der Hypothese eines konstant exprimierten und unregulierten ARNT-Heterodimerisierungspartners widersprechen, aber mit Chilov et al. in Einklang stehen. In Übereinstimmung mit Choi et al. und Mandl et al. zeigen wir, dass die Heterodimerisierung mit HIF-α ein wichtiger Mechanismus zur Stabilisierung des ARNT-Proteins unter Hypoxie ist.

Zusammenfassend deuten unsere Daten auf eine generelle stabilisierende Regulation von ARNT-Bindungspartnern wie HIF-α, AhR, SIM und CHF1 hinsichtlich der ARNT-Expression hin. Darüber hinaus können wir zeigen, dass jede Zelllinie/jeder Zelltyp hinsichtlich der Induktion der ARNT-Proteinsynthese unterschiedlich auf Hypoxie und Hypoxie-Mimetika reagiert. Daher ist eine universalisierte zellübergreifende Vorhersage der ARNT-Proteinexpression nicht zulässig. Diese Befunde zeigen, dass die ARNT-Regulation weiter erforscht werden sollte, insbesondere im Hinblick auf die Tumorentstehung, denn die ARNT-Regulation ist weitaus komplexer als heute angenommen.

Danksagungen

Wir danken T. Svensson, B. Rudzewski und A.-K. Hellberg für die hervorragende technische Unterstützung. Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt haben.

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