Die fünf wichtigsten Methoden für die primäre Antikörpermarkierung

Bei allen Anwendungen, die Antikörper für den Signalnachweis verwenden (z. B. Western Blotting, ELISA, Immunhistochemie oder FACS), gibt es zwei Ansätze für die Antikörpermarkierung: die direkte und die indirekte Markierung. Beim Standard-Westernblotting wird die indirekte Markierung verwendet, da ein primärer Antikörper zum Nachweis des Zielantigens verwendet wird, gefolgt von einem sekundären Antikörper, an den ein Nachweismolekül angehängt wird.

In manchen Situationen kann es besser sein, den sekundären Antikörper und alle damit verbundenen Schritte zu überspringen und den primären Antikörper direkt zu markieren. Zu den Fällen, die nach einer direkten Markierung des primären Antikörpers schreien, gehören:

• Es besteht eine unspezifische Bindung des sekundären Antikörpers
• Sie verwenden nichtStandardorganismus-Primärantikörper – in diesem Fall kann es schwierig sein, gute Sekundärantikörper zu finden
• Beim Multiplexing mit Antikörpern, die von derselben Spezies stammen
• Wenn Sie die Versuchszeit verkürzen müssen, indem Sie die Inkubation von Sekundärantikörpern und die damit verbundenen Waschschritte eliminieren

Antikörper-Parameter

Sie können den von Ihnen gewählten Antikörper nicht nur mit Fluoreszenzfarbstoffen, sondern auch mit fluoreszierenden Proteinen, Enzymen und farbigen Partikeln markieren. Alle diese werden in der Regel über eine endständige Lysin-Gruppe gebunden, so dass Sie bei allen Schritten aminhaltige Puffer (z. B. Tris) und Moleküle vermeiden müssen. Andernfalls werden Sie Ihre Puffermoleküle meist markieren! Sie sollten auch das übliche Pufferkonservierungsmittel Natriumazid vermeiden, da es die Markierungsreaktion stört.

Der Antikörper für die Markierung sollte eine Konzentration von mindestens 0,5 mg/ml aufweisen und >90% rein sein. Je weniger störende Proteine und aminogruppenhaltige Moleküle Sie in Ihrem Antikörperpräparat haben, desto effizienter wird die Markierungsreaktion sein. Aber selbst wenn Ihr Antikörper in Glycin und BSA schwimmt, können Sie störende Substanzen immer durch Dialyse entfernen. Sie können auch die Reinheit Ihres Antikörpers verbessern, indem Sie ihn durch eine A-Protein-Säule leiten, oder Sie können sogar Ihre eigene Affinitätsreinigungssäule mit einem geeigneten Antigen herstellen.

Hauptmethoden zur Markierung von Antikörpern im Haus

NHS (Succinimidyl)-Ester-Methode

Diese Methode ist nützlich für die Konjugation von Antikörpern mit weithin verfügbaren Fluoreszenzfarbstoffen wie Rhodaminderivaten. Sie wird in der Regel in einem Phosphatpuffer durchgeführt und anschließend auf der Säule vom unmarkierten Farbstoff getrennt. Der größte Nachteil ist, dass die Ester instabil sind, da sie feuchtigkeitsempfindlich sind. Der markierte Antikörper sollte sofort nach Beendigung der Reaktion verwendet werden.

Isothiocyanat-Methode

Mit dieser Methode können Sie Fluoresceinisothiocyanat (FITC) herstellen, das bei der Herstellung von fluoreszierenden Proteinen und Antikörpern sehr beliebt ist. Wenn Sie schon einmal mit Fluoreszenzmikroskopie gearbeitet haben, kennen Sie sich mit FITC aus. Isothiocyanat-Analoga verschiedener Standardfarbstoffe sind ebenfalls erhältlich.

Isothiocyanat ist stabiler als NHS, aber es ist schwieriger herzustellen, und Ihre Markierungsreaktion wird mit dieser Methode wahrscheinlich weniger effizient sein. Wie bei NHS sollte der überschüssige Farbstoff nach der Reaktion durch Chromatographie entfernt werden.

Carbodiimid-Methode

Carbodiimid-Verbindungen wandeln Carboxylgruppen auf Proteinen in reaktive Zwischenprodukte um, die mit Lysinen reagieren können. Die hohe Reaktivität von Carbodiimiden bedeutet, dass sie zur Markierung von Antikörpern mit relativ inerten Materialien wie Magnet- oder Goldpartikeln verwendet werden können. Das am häufigsten verwendete Carbodiimid ist EDC. Manchmal wird der Reaktion NHS zugesetzt, um die Bildung relativ stabiler Zwischenprodukte zu fördern.

Die Methode ist einfach, aber ähnlich wie NHS ist EDS hygroskopisch, so dass Sie Ihren Antikörper sofort nach der Markierung verwenden müssen.

Zwei-Tag-Methode

Hier markieren Sie Ihren Antikörper mit einem anderen Protein, das als Katalysator dient, zum Beispiel HRP oder alkalische Phosphatase. Da die beiden Moleküle zahlreiche Aminogruppen enthalten, würde eine direkte Vernetzung (wie bei der NHS-Methode) zu Polymeren desselben Moleküls führen. Daher führen Sie die Vernetzung in zwei separaten Schritten durch. Sie vernetzen den Antikörper mit Molekül X und den Katalysator mit Molekül Y. Sie müssen X und Y sorgfältig auswählen, da sie miteinander interagieren sollten, um das Konjugat zu bilden. Man könnte zum Beispiel Maleinimid als X und ein Thiol als Y wählen.

Das resultierende Konjugat ist zwar stabiler als das, was man mit der NHS-Methode erhält, aber diese Methode erfordert dreimal so viel Arbeit: separate Markierungs- und Reinigungsschritte für den Antikörper, den Katalysator und die Konjugationsreaktion. Die gute Nachricht ist, dass Sie vormarkierte Katalysatormoleküle kaufen und dann Ihren Antikörper entsprechend markieren können.

Periodat-Methode

Diese Methode ist nützlich für die Herstellung spezifischer HRP-Antikörper-Konjugate. Periodat aktiviert HRP durch die Bildung von Aldehydmolekülen, die mit Lysinresten interagieren. Das HRP selbst hat nur wenige Lysinreste, so dass die Polymerisation des Enzyms kein großes Problem darstellt. Die Bindungen zwischen HRP und dem Antikörper sind reversibel, es sei denn, sie werden durch die Zugabe von Natriumcyanhydrid stabilisiert.

Das war meine Übersicht über die besten hausgemachten Methoden zur Antikörper-Markierung. Es gibt eine Menge kommerzieller Kits auf dem Markt, die auf ähnlichen chemischen Grundlagen beruhen und Ihnen das Leben sehr viel leichter machen können. Wenn Ihr Labor das Geld dafür hat.

Haben Sie eine andere Methode zur Antikörper-Markierung, die Sie uns mitteilen möchten? Schreiben Sie uns in den Kommentarbereich.

Literatur:

Meyer JP, Adumeau P, Lewis JS, Zeglis BM. Click Chemistry and Radiochemistry: The First 10 Years. Bioconjug Chem. (2016) 27(12):2791-2807. doi: 10.1021/acs.bioconjchem.6b00561. Epub 2016 Nov 22.