Ein Lateral-Flow-Streifen auf der Basis von Gold-Nanopartikeln zum Nachweis von 6-Monoacetylmorphin in Mundflüssigkeit

Einführung

Der Missbrauch von Opioiden hat in den letzten Jahren dramatisch zugenommen und ist eine wichtige Ursache für Morbidität und Mortalität. Laut dem vom Büro der Vereinten Nationen für Drogen- und Verbrechensbekämpfung veröffentlichten Weltdrogenbericht 2017 ist der Konsum von Opiaten und verschreibungspflichtigen Opioiden zwar nicht so weit verbreitet wie der von Cannabis, aber Opioide sind nach wie vor wichtige Drogen mit potenziellen Schäden und gesundheitlichen Folgen . Daher ist der einfache und schnelle Nachweis von Opioiden dringend erforderlich.

Der illegale Heroinmissbrauch ist eine der häufigsten Formen der Opioidabhängigkeit. Heroin (Diacetylmorphin, Diamorphin oder Diagesil®) ist ein halbsynthetisches Morphin-Derivat und ein starkes Opioid-Analgetikum. Der Metabolismus von Heroin ist in Abbildung 1 dargestellt. Heroin wird rasch zu 6-Monoacetylmorphin (6-MAM) und schließlich zu Morphin hydrolysiert. Da Heroin nach der Verabreichung schnell hydrolysiert, werden seine Metaboliten in der Regel zum Nachweis des Konsums verwendet. Darüber hinaus ist 6-MAM der einzige spezifische Indikator für aktuellen Heroinmissbrauch im Vergleich zu Morphin und hat daher großes Interesse in der Forschung geweckt.

Es wurden verschiedene Methoden zum Nachweis von 6-MAM beschrieben, die sich in die folgenden Kategorien einteilen lassen: (1) chromatographische Analyse einschließlich Gaschromatographie und Hochleistungsflüssigkeitschromatographie; (2) spektroskopische Analyse wie Ramen-Spektroskopie, Infrarot-Spektroskopie, Chemilumineszenz usw.; (3) Kapillarelektrophorese; und (4) Immunoassay-Methoden (Antigen-Antikörper). Die komplexen Instrumentierungstechniken stellen eine enorme Belastung für das grundlegende Drogenscreening dar, da hochentwickelte Geräte und professionelles Bedienpersonal benötigt werden. Das Labor ist manchmal geschlossen oder weit entfernt. Nicht einmal Polizeistationen können diese komplexe und teure Ausrüstung unterbringen. Ein Polizeibeamter muss jedoch sofort beurteilen, ob ein verdächtiges Material Heroin enthält oder nicht, und er muss schnell reagieren. Daher ist die Entwicklung spezifischer, zuverlässiger und einfacher Methoden zum Nachweis illegaler Drogen in biologischen Proben dringend erforderlich.

Unter den Methoden für den Schnellnachweis haben sich kolloidale Goldnanopartikel (AuNP) auf der Grundlage von Lateral Flow Strips (LFS) aufgrund der größen- und abstandsabhängigen optischen Eigenschaften von AuNP für ein schnelles Screening weithin durchgesetzt, wobei der erste Bericht von Mirkin und Mitarbeitern stammt. Das Prinzip der halbquantitativen Lateral-Flow-Tests besteht darin, dass die rote Farbe der AuNPs innerhalb weniger Minuten mit bloßem Auge an der Antigen-Antikörper-Kombination erkannt werden kann. Es gibt verschiedene kommerzielle Testkits für den Nachweis von Heroinmissbrauch, unter anderem von den Unternehmen NovaBios und Wondfo. Die meisten Heroin-Screening-Kits messen jedoch nur Morphin, nicht aber 6-MAM, da es schwierig ist, zwischen 6-MAM und Morphin zu unterscheiden. Morphin könnte aus anderen Drogen verstoffwechselt werden oder verschrieben worden sein. 6-MAM lässt sich eindeutig auf Heroin zurückführen.

Die Proben umfassen Blut, Plasma, Urin, Haare, orale Flüssigkeiten sowie Atem, Schweiß, Muttermilch, Zähne usw. . Die am häufigsten verwendeten Proben für Tests auf illegales Heroin sind Blut, Urin und orale Flüssigkeiten. Von diesen Proben ist der Bluttest der genaueste und zuverlässigste, aber auch der invasivste. Urintests sind am bequemsten und werden häufig für das Screening auf Drogenmissbrauch verwendet. Orale Flüssigkeiten werden zunehmend für Point-of-Care-Tests verwendet – sie sind in der Öffentlichkeit leicht zu sammeln. Orale Flüssigkeiten sind jedoch sehr zähflüssig und weisen geringe Konzentrationen des Ziels auf; daher werden die meisten Tests mit Urin auf 6-MAM durchgeführt. Die Entwicklung aller Tests für orale Flüssigkeiten steht vor demselben Problem der Probenentnahme und der Verbesserung der Empfindlichkeit. Eine frühere Studie hat gezeigt, dass 6-MAM häufig in Mundflüssigkeit nachgewiesen wird. Der Standard für den Nachweis von 6-MAM in der Mundflüssigkeit liegt bei 4 ng ml-1 . Hier haben wir einen Lateral-Flow-Test für Heroin in Mundflüssigkeitsproben entwickelt.

Wir untersuchten AuNPs als Antikörper-Marker in einem Lateral-Flow-Assay für den schnellen und empfindlichen Nachweis von 6-MAM über ein kolorimetrisches Signal. Zunächst synthetisierten wir das 6-MAM und konjugierten es dann an Rinderserumalbumin (BSA), um es auf eine T-Linie aufzutragen. Um die Schwierigkeiten im Umgang mit Mundflüssigkeitsproben zu überwinden, wurden die Arten von Nitrocellulose (NC)-Membranen, die Lösungsformel des Probenkissens und das Schwammadsorptionskissen ausgewählt, um die besten Bedingungen für Mundflüssigkeits-LFSs zu finden. Schließlich wurde der 6-MAM-LFS validiert und zeigte eine hervorragende Sensitivität und Spezifität.

Experimentell

2.1. Materialien

Die Antikörper gegen 6-MAM wurden von Bioventure (Shanghai) bereitgestellt. BSA und Polyvinylpyrrolidon (PVP) wurden von Sigma (Barcelona, Spanien) bezogen. Triton X-100, Tetronic 1307 (S9), Ohodasurf On-870 (S17) und STANDAPOL ES-1 (S7) wurden von BASF (Deutschland) bezogen. Destilliertes Wasser (Widerstand 18,2 MΩ cm-1) wurde mit einem RephiLe PURIST UV Ultrapure Water System (China) hergestellt. Das Reel-Dispersionssystem stammt von Doyesgo (China). Das Massenspektrometer Vion IMS Q-Tof stammte von Waters (USA). Alle Standardmaterialien wie 6-MAM und Morphin wurden von den National Institutes for Food and Drug Control (China) bezogen. Das Mikroskop war von Motic AE2000 (Xiamen, China). Alle anderen hier nicht aufgeführten chemischen und immunologischen Reagenzien waren handelsübliche Produkte von analytischer/reagenzieller Qualität.

2.2. Die Bestandteile des Lateral Flow Strips

Die LFS bestehen aus einer Kunststoffunterlage, einem Schwammadsorptionsstreifen (Schwammpad), einem Probenpad, einem konjugierten Pad, NC-Membranen und einem absorbierenden Pad. Der Schwamm-Adsorptionsstreifen ist speziell für die Entnahme von Mundflüssigkeit konzipiert und transportiert die Mundflüssigkeit schnell in das Probenkissen. Das Probenpad enthält ein Puffersystem und einige Tenside. Die Antikörper-AuNP-Konjugate wurden auf das Konjugat-Pad gesprüht, um mit der Probe zu reagieren und vom Pad freigesetzt zu werden und in die NC-Membran zu gelangen, die auf der T-Linie mit 6-MAM-BSA und auf der C-Linie mit Ziegen-Antikörper gegen Kaninchen beschichtet ist. Das absorbierende Pad ist ein Filterpapier, das sich am Ende des Streifens befindet; es hält den Kapillarfluss aufrecht. Der LFS muss nur in den Mund genommen oder in einen Becher für orale Flüssigkeitsproben eingeführt werden. Eine schematische Darstellung des LFS ist in Abbildung 2 zu sehen. Eine schematische Darstellung des LFS für den 6-MAM-Nachweis ist in Abbildung 3 zu sehen.

2.3. Synthese des Konjugats aus 6-Monoacetylmorphin und Rinderserumalbumin

Das 6-MAM wurde wie in früheren Forschungsarbeiten beschrieben hergestellt. Kurz gesagt, wurde Morphin zunächst durch alkalische Hydrolyse von Heroin hergestellt. Anschließend wurde eine N-Hydroxysuccinimid (NHS)-Estergruppe an das 6-MAM-Molekül angefügt, um es mit den Trägerproteinen zu konjugieren (Abbildung 4). Das aktivierte 6-MAM wurde mit einem Waters® Vion IMS Q-Tof Massenspektrometer bestimmt. Anschließend wurde die Synthese wie beschrieben (Abbildung 5) mit einigen Änderungen durchgeführt. Zunächst ließ man 80 mg BSA in 6 ml 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH = 7,5) auf 0°C abkühlen. Dann wurden 20 mg aktiviertes 6-MAM in 1 ml wasserfreiem Dimethylformamid (DMF) tropfenweise bei 0°C zugegeben. Die Mischung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und über Nacht gerührt. Das resultierende 6-MAM-BSA-Konjugat wurde gegen 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH = 7,5) mit sechs Pufferwechseln (jeweils mindestens 6 h bei 4°C) dialysiert.

2.4. Herstellung von Goldnanopartikeln-Antikörper-Konjugaten

Die 20 nm großen AuNPs wurden durch eine Citratreduktionsmethode hergestellt. Dazu wurden 2 ml einer 1%igen HAuCl4-Lösung unter kräftigem Rühren in 100 ml kochendes Wasser gegeben und anschließend sofort 2 ml einer 1%igen Natriumcitratlösung hinzugefügt. Wenn sich die Lösung rot färbte, wurde sie für weitere 15 Minuten gekocht. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und für die weitere Verwendung bei 4°C gelagert.

Nachdem der pH-Wert der AuNPs-Lösung mit 0,1 M K2CO3 auf 9,0 eingestellt wurde, wurden 30 µg 6-MAM-Antikörper in 10 ml AuNPs-Lösung gegeben und 30 Minuten lang inkubiert. Anschließend wurden 20 µl 100,0 g l-1 BSA für 15 min zugegeben, um die reaktiven Stellen zu blockieren. Die Lösung wurde 15 Minuten lang bei 3740 g zentrifugiert, und der Überstand wurde weitere 30 Minuten lang bei 12 100 g erneut zentrifugiert. Alle Goldpräzipitate wurden gemischt und gemessen, um das Absorptionsmaximum mittels UV-Spektroskopie zu bestimmen. Anschließend wurde es bei 4°C zur weiteren Verwendung gelagert.

Die gleiche Methode wurde zur Konjugation von AuNPs mit Kaninchen-IgG-Antikörpern verwendet. Bei der Herstellung des Konjugatpads wurden die Antikörperkonjugate mit Puffer (0,05 M Tris-HCl mit 10,0 g l-1 BSA, 0,4 % Triton X-100, 5 % Trehalose, 10 % Saccharose, pH 8,2) bis zur Absorption fünf verdünnt. Schließlich wurden 500 µl der gemischten AuNP-Antikörper-Konjugate auf eine 20 mm2 große Glasfaser gesprüht und dann über Nacht bei 37°C getrocknet.

2.5. Vorbereitung der beschichteten Nitrocellulosemembran

Zur Herstellung des Lateral-Flow-Teststreifens wurden 6-MAM-BSA-Antigene (0,6 mg ml-1) auf die NC-Membranen als Testlinien (T-Linie) aufgetragen. Die Kontrolllinien (C-Linie) wurden mit polyklonalen Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörpern (0,15 mg ml-1) beschichtet. Die beschichteten NC-Membranen wurden über Nacht bei 37°C getrocknet. Es wurden neun kommerzielle NC-Membranen von vier Unternehmen bewertet: Millipore (HF90, HF135 und HF180), GE-Whatman (FF120HP und AE100), Sartorius (CN95 und CN150) und Pall (Vivid90 und Vivid170).

2.6. Sensitivität und Spezifität

Der Streifen ist ein kompetitiver Assay, und beide Positionen hatten 6-MAM-Streifen. Wenn die Probe 6-MAM enthält, bindet sie sich an den Nanogold-markierten Antikörper auf dem konjugierten Pad. Überschüssige Antikörper wandern aufgrund der Kapillarwirkung weiter entlang der chromatographischen Richtung und binden dann an das 6-MAM-Antigen auf der T-Linie. Die Signalintensität der T-Linie steht in direktem Zusammenhang mit der 6-MAM-Konzentration in der Probe. Eine dunklere Farbe zeigt eine niedrigere 6-MAM-Konzentration an.

Negative Mundflüssigkeit wurde von sechs Personen entnommen und mit 6-MAM (400, 100, 40, 10, 4, 1, 0,4, 0,1 ng ml-1) aufgestockt, um sie empfindlich nachzuweisen. Zehn häufig missbrauchte Drogen wurden verwendet, um die Spezifität der LFS zu überprüfen. Diese Drogen waren Morphin (MOP, 100 µg ml-1), Codein (COD, 100 µg ml-1), Tetrahydrocannabinol (THC, 10 µg ml-1), Methylendioxymethamphetamin (MDMA, 100 µg ml-1), Ketamin (KET, 100 µg ml-1), Methylamphetamin (MET, 100 µg ml-1), Kokain (COC, 100 µg ml-1), Methadon (MTD, 100 µg ml-1), Ephedrin (EPH, 100 µg ml-1) und Pseudoephedrin (PEPH, 100 µg ml-1).

Ergebnisse und Diskussion

3.1. Synthese des 6-Monoacetylmorphin-Rinderserumalbumin-Konjugats

NC-Membranen werden in der Regel zunächst mit einem Trägerprotein beschichtet, bevor der Antikörper konjugiert wird. Um die strukturelle Spezifität zu erhalten, werden Linker verwendet. Hier wurde zunächst eine NHS-Estergruppe an das 6-MAM-Molekül als Linker für das Trägerprotein angefügt. Dies wurde mit einem Waters® Vion IMS Q-Tof Massenspektrometer validiert. In den Chromatogrammen der Ultra-Performance Liquid Chromatography (UPLC) von aktiviertem 6-MAM fanden wir bei 8,8 Minuten einen breiten Peak mit einer m/z von 706,27645 (Abbildung 6) gegenüber einer vorhergesagten m/z von 706,2758. Dies zeigt, dass der Linker erfolgreich an das 6-MAM gebunden wurde. Die Bedeutung einer präzisen Synthese liegt auf der Hand, da nur so die Struktur korrekt bestimmt wird, was zu einer Kopplung mit 6-MAM-Antikörpern führen könnte.

Wir haben keine Gradientendimethylsulfoxid-Dialyse verwendet, da das Produkt löslich ist und das vorherige Konjugationsprotokoll zu komplex ist. BSA hatte aufgrund der verschiedenen Analoga mehrere Peaks im UPLC-Chromatogramm (Daten nicht gezeigt). Dies führte zu einer Reihe von Konjugationsverhältnissen. Daher gab es im UPLC-Chromatogramm verschiedene Peaks, die den unterschiedlichen Konjugationsverhältnissen entsprachen. Die Konjugationsergebnisse konnten über die Antigen-Antikörper-Paarung besser bestätigt werden als über das Konjugationsverhältnis.

3.2. Auswahl von Nitrocellulosemembran-Typen

NC-Membranen binden Proteine elektrostatisch über Wechselwirkungen des starken Dipols des Nitratesters mit dem starken Dipol der Peptidbindungen des Proteins. Die Eigenschaften wie Kapillarflussrate, Signalintensität und Hintergrund wurden bewertet, da sie die endgültige Leistung des LFS beeinflussen können. Darüber hinaus wird der Durchflussrate mehr Aufmerksamkeit geschenkt, da sie die Proteinadsorptionskapazität und sogar die Empfindlichkeit beeinflussen kann. Die Durchflussrate einer Membran hängt von den Aggregateigenschaften der porösen Strukturen wie Porengröße, Porengrößenverteilung und Porosität ab. Eine größere Porengröße führt zu einer schwächeren Proteinadsorption.

Wir verglichen neun NC-Membranen (Tabelle 1). Jeder Test wurde dreimal wiederholt, und das durchschnittliche Ergebnis wurde aufgezeichnet. Die LFS-Ergebnisse wurden in 3 min gemessen, und die beste Probenflussrate lag unter 20 s cm-1. Die Signalintensität an der T-Linie musste ebenfalls im normalen Bereich liegen. Eine tiefere Hintergrundfarbe beeinträchtigte die Genauigkeit. Die Millipore-Membran HF135 war nach umfassender Betrachtung der Probenflussrate, der Signalintensität an der T-Linie und der Hintergrundfarbe die beste Wahl für 6-MAM.

3.3. Das Probenkissen

Die Lösung zur Behandlung des Probenkissens ist für den Test sehr wichtig, da sie als Reaktionspuffersystem dient, wenn die Proben der Mundflüssigkeit das Kissen rehydrieren. Die Lösung enthält in der Regel ein Puffersystem mit der richtigen Ionenstärke und dem richtigen pH-Wert; einige blockierende Materialien und Tenside können die Fließgeschwindigkeit der Mundflüssigkeit auf der Membran beschleunigen. Das Probenpad bewältigt die komplexen Matrixeffekte der Mundflüssigkeit und macht sie mit der NC-Membran kompatibel. Darüber hinaus gewährleistet das Puffersystem die Freisetzung von Analyten und stabilisiert die Flussrate, da die Mundflüssigkeit zu viskos ist.

Vier verschiedene Formeln wurden in Betracht gezogen. Die Lösungsformeln sind in Tabelle 2 aufgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass das Puffersystem 4 mit dem Tensid STANDAPOL ES-1 (S7) bei einer Probenflussrate von 17 s cm-1 die beste Leistung erbrachte, mit einer normalen Signalintensität und einem weißen Hintergrund. Das Tensid S7 ist ein starkes anionisches Tensid, das eine stärkere Waschfähigkeit als S17 und S9 bietet.

3.4. Entnahme von Mundflüssigkeit

Orale Flüssigkeiten sind aufgrund ihrer hohen Viskosität schwieriger zu sammeln als Urin. Es gibt viele Arten von Hilfsmitteln zur Entnahme von Mundflüssigkeit: Wattestäbchen, Schwämme, Plastikröhrchen und Becher. Einige Methoden stimulieren die Mundflüssigkeit durch Essig, Mundspülungen, Lutschtabletten usw. Eine solche Stimulierung kann jedoch die Konzentration der Analyten in der Mundflüssigkeit verändern und ist komplizierter und zeitaufwändiger. Schließlich sammelten wir die Mundflüssigkeit direkt aus dem Mund mit einem Schwamm-Adsorptionsmittel (ESSENTRA, UK), das eine Mischung aus Polymerfasern mit einer geeigneten Porengröße ist.

Zwei Arten von Schwamm-Adsorptionsmitteln (K1 und K2) wurden kundenspezifisch entwickelt, und die Strukturen der beiden Schwammkissen sind in Abbildung 7 dargestellt. K2 war im Vergleich zu K1 viel lockerer und regelmäßiger. Beide Schwämme wurden auf ihre Flüssigkeitsaufnahmefähigkeit geprüft, indem Wasser auf den Schwamm getropft, der fertige LFS in den negativen Kaliumphosphatpuffer (pH = 7,0) gegeben und der fertige LFS in den Mund genommen wurde. Der K2-Schwamm hatte eine doppelt so schnelle Probenflussrate (durchschnittlich 20 s cm-1) als der K1-Schwamm für Wasser, PBS-Puffer oder echte orale Flüssigkeiten. Dies ist ein sehr wichtiger Aspekt bei der Untersuchung von Mundflüssigkeiten. Daher wurde K2 wegen seiner hervorragenden Leistung bei der Untersuchung von Mundflüssigkeitsproben ausgewählt.

3.5. Sensitivität und Spezifität

Kleine Moleküle werden in der Regel über einen kompetitiven Assay in LFSs nachgewiesen. Hier gibt es in der T-Linie kein Signal (rote Linie). Dies bedeutet, dass die Konzentration von 6-MAM in der Probe über dem Cut-off-Wert liegt. Aufgrund der geringen Konzentration von Drogenmetaboliten in der Mundflüssigkeit sollte die Empfindlichkeit von Tests auf orale Flüssigkeiten viel höher sein als die von Urintests. Hier haben wir erfolgreich einen qualitativen LFS für 6-MAM mit einer Empfindlichkeit von 4 ng ml-1 durchgeführt, was den Anforderungen an allgemeine Nachweisgrenzen für orale Flüssigkeiten entspricht. Die Ergebnisse sind in Abbildung 8 dargestellt. Abbildung 9 zeigt darüber hinaus die Spezifität im Vergleich zu den am häufigsten missbrauchten Drogen. Der 6-MAM-LFS war spezifisch für 6-MAM ohne Kreuzreaktion insbesondere mit Morphin oder Codein.

Schlussfolgerung

Das 6-MAM ist der spezifische Metabolit von Heroin. Wir berichten hier über einen LFA für 6-MAM mittels eines speziellen Konjugats, das mit einem spezifischen Antikörper gepaart ist. Wir haben ein Konjugat hergestellt, das 6-MAM über eine NHS-Estergruppe an der C3-Position mit dem Trägerprotein verbindet (Abbildung 10). In diesem Fall identifizierte der Antikörper die Acetylgruppe von 6-MAM. Dies ist eine Voraussetzung für die Spezifität für 6-MAM. Schließlich haben wir einen sehr empfindlichen LFS-Test durchgeführt, der keine Kreuzreaktion mit 10 häufig missbrauchten Drogen, darunter Morphin und Codein, zeigt. Wir haben die geeigneten NC-Membranen, Probenkissen, Porengröße und Schwammadsorptionsmittel identifiziert, um einen Test herzustellen, der orale Flüssigkeiten am Ort der Versorgung verwendet.

Aufgrund der oben genannten Vorteile könnte der 6-MAM-LFS für orale Flüssigkeitsproben sowohl in der Forschung als auch in der Industrie eingesetzt werden. Es könnte der Polizei helfen, Arbeitskräfte und Zeit/Kosten bei der Voruntersuchung zu sparen. Orale Flüssigkeiten sind bequem und weniger invasiv und eignen sich für Verkehrskontrollen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass ein oraler Flüssigkeits-LFS für Heroinmissbrauch, der auf 6-MAM abzielt, ein vielversprechendes Produkt zur Bekämpfung von Drogen am Steuer darstellt.

Ethik

Die Verwendung der Heroinproben für die Forschung wurde vom Dritten Forschungsinstitut des chinesischen Ministeriums für öffentliche Sicherheit überwacht. Alle Autoren erklären, dass sie die ethischen Standards einhalten.

Zugänglichkeit der Daten

Die Daten sind im Dryad Digital Repository hinterlegt: https://doi.org/10.5061/dryad.8r36rp3.

Beiträge der Autoren

L.Z. konzipierte diese Studie, und X.H und J.Z. halfen bei der Durchführung der Experimente in den Abbildungen 4 und 5. F.C. und Y.Z. führten die Untersuchungen in Abbildung 6 durch. J.L. analysierte die Daten und schrieb den Artikel. Alle Autoren gaben ihre endgültige Zustimmung zur Veröffentlichung.

Konkurrierende Interessen

Wir erklären, dass wir keine konkurrierenden Interessen haben.

Finanzierung

Für diesen Artikel haben wir keine Finanzierung erhalten.

Haftungsausschluss

Meinungen, Erkenntnisse und Schlussfolgerungen oder Empfehlungen, die hier zum Ausdruck gebracht werden, sind die der Autoren.

Fußnoten

Dieser Artikel wurde von der Royal Society of Chemistry herausgegeben, einschließlich der Auftragsvergabe, des Peer-Review-Verfahrens und der redaktionellen Aspekte bis zur Annahme.