EMBL – European Molecular Biology Laboratory

Informationen über die Form und die Konformation eines Proteins sowie über die Wechselwirkung zwischen Makromolekülen können aus den Sedimentations- und Diffusionskoeffizienten gewonnen werden, die aus einem Experiment zur Sedimentationsgeschwindigkeit stammen. Die Sedimentationskoeffizienten sind besonders nützlich für die Überwachung von Änderungen der Konformation eines Proteins. Das sich daraus ergebende Modell für die Gesamtform des Proteins oder Proteinkomplexes kann mit elektronenmikroskopischen Bildern verglichen werden, um zu beurteilen, inwieweit diese Bilder auf das Verhalten dieser Teilchen in Lösung zutreffen.

Assoziation

Im Gegensatz zu anderen Methoden zur Untersuchung von Bindungsprozessen ist die Sedimentationsgleichgewichtsmethode besonders empfindlich für die Untersuchung relativ schwacher Assoziationen mit Assoziationskonstanten (Ka) in der Größenordnung von 10-100 M-1. Es können aber auch Bindungsprozesse mit Ka-Werten deutlich über 107 M-1 untersucht werden.

Das Gerät

Die analytische Ultrazentrifuge, die wir am EMBL haben, ist eine Beckman Optima XL-A. Das Gerät schleudert die Proteinprobe unter Vakuum mit einer kontrollierten Geschwindigkeit und Temperatur und zeichnet zu bestimmten Zeiten die Konzentrationsverteilung auf. Je nach Rotor kann die Geschwindigkeit bis zu 60.000 Umdrehungen pro Minute betragen (das entspricht 250.000 x g). Für die Messungen werden spezielle Küvetten verwendet, die dem hohen Gravitationsfeld standhalten und den Durchgang von Licht durch die Probe ermöglichen. Die eigentliche Probe befindet sich in einem sektorförmigen Hohlraum, der zwischen zwei Quarzfenstern liegt (siehe Abb. 1). Dieser Hohlraum befindet sich in einem Mittelstück aus einer Aluminiumlegierung oder verstärktem Epoxid. Doppelsektorküvetten werden auch verwendet, um die Absorption des Lösungsmittels der Probe zu korrigieren. Diese Zellen ermöglichen auch die Messung von Unterschieden im Sedimentationskoeffizienten und von Diffusionskoeffizienten. Die Mittelstücke haben eine Schichtdicke von 3 bis 12 mm, was in Verbindung mit wählbaren Wellenlängen die Untersuchung eines breiten Spektrums von Probenkonzentrationen ermöglicht. Wie Sie eine Zelle zusammenbauen, erfahren Sie im Montageprotokoll.