Frontiers in Bioengineeringand Biotechnology

Einführung

Serumalbumine sind Proteine, die häufig in der Bio-Diagnostik und als Modell in der Bio-Grenzflächenforschung verwendet werden (Rosi und Mirkin, 2005; Singh et al, 2005; Arcot et al., 2015). Unter diesen ist Rinderserumalbumin (BSA) das billigste und ein Protein, das häufig als Blockierungsmittel in ELISA-Tests verwendet wird (Maingonnat et al., 1999). In der Papierdiagnostik erhöht BSA (Huang et al., 2018) selektiv die Hydrophobie des Papiers, um die Bioflüssigkeiten und den Elutionsfluss zu verbessern, indem es die Flüssigkeitsaufnahme verringert. BSA schützt und verlängert die Lebensdauer funktioneller Biomoleküle, die auf Papier getrocknet werden. Die Funktionalität und Langlebigkeit von Immunglobin G und Immunglobin M, die auf mit BSA behandelten Oberflächen getrocknet werden, kann sich um eine Größenordnung erhöhen (van Remoortere et al., 2001). BSA verhindert auch die unspezifische Adsorption von Analyseproteinen für die quantitative Analyse.

In mehreren Artikeln wurde ausführlich über das Phänomen der Sorption von BSA-Molekülen an verschiedenen Grenzflächen wie Gold (Dennison et al., 2017), Glimmer (Fitzpatrick et al., 1992), Silizium (Jachimska et al., 2016; Givens et al., 2017) und Cellulose (Mohan et al., 2014; Lombardo et al., 2017) berichtet. Die Konformation des adsorbierten BSA-Moleküls und die Topologie der gebildeten Schicht werden stark von pH-Wert, Ionenstärke und Temperatur beeinflusst. BSA-Moleküle behalten ihre native Struktur zwischen pH 4,0 und 8,0 bei. Unterhalb von pH 4,0 und oberhalb von 8,0 ändern BSA-Moleküle ihre Faltkonformation, die sich von ihrer nativen Struktur unterscheidet (Su et al., 1998a; Barbosa et al., 2010; Phan et al., 2015). Der isoelektrische Punkt von BSA liegt bei pH 4,5. Bei diesem pH-Wert wird die Netto-Oberflächenladung Null und die BSA-Moleküle aggregieren. Mit steigendem pH-Wert erhöht sich die BSA-Ladung, und die vorherrschende elektrostatische Abstoßung stabilisiert die BSA-Moleküle und verhindert die Aggregation (Li et al., 2008).

Obwohl BSA zu den am besten untersuchten Proteinen gehört, bleiben zahlreiche Fragen zu den Auswirkungen von pH-Wert und Ionenstärke auf die BSA-Konformation bei der Adsorption offen. In diesem Zusammenhang ist das Konzept der Oberflächenbedeckung, das ausschließlich durch den Oberflächenanteil oder die Gewichtsdichte definiert ist, nicht eindeutig. Es besteht die Notwendigkeit, die Variablen, die die BSA-Fest-Flüssig-Grenzfläche definieren, besser zu verstehen, um robuste Bio-Diagnosegeräte zu entwickeln.

Rinderserumalbuminmoleküle adsorbieren an einer Grenzfläche und bilden eine Schicht mit einer Dicke im Nanometerbereich. Einige Charakterisierungsmethoden wie Reflektivität (Su et al., 1998b, 2016; Raghuwanshi et al., 2017a, b), Ellipsometer, Rasterkraftmikroskop (AFM), Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) und Quarzkristallmikrowaage mit Dissipation (QCM-D) können die Dicke der adsorbierten Proteinschicht im erforderlichen Nanometerbereich messen. Insbesondere kann QCM-D den Sorptionsprozess von Biomolekülen kinetisch überwachen, indem die adsorbierte Proteinmasse an einer Grenzfläche in Nanogramm gemessen wird (Kristensen et al., 2013; Luan et al., 2017). QCM-D ermöglicht die Kontrolle von Temperatur, Ionenstärke und pH-Umgebung. Der Dissipationsmodus von QCM offenbart die Steifigkeit der adsorbierten Proteinschichten.

In dieser Studie wird ein reversibles pH-abhängiges Verhalten von BSA-Molekülen beschrieben, die an der Gold-Salz-Grenzfläche adsorbiert sind. Die adsorbierte BSA-Schicht verhält sich wie ein pH-empfindlicher Schwamm, in dem die Wassermoleküle je nach dem umgebenden pH-Wert zwischen 4 und 8 adsorbiert und desorbiert werden. In dieser Arbeit wird das Phänomen der Wassersorption in der schwammartigen BSA-Schicht überwacht und quantifiziert und die beteiligten Mechanismen bei verschiedenen pH-Werten und Ionenstärken aufgeklärt. Unser Ziel ist es, die BSA-Bedeckung an der Fest-Flüssig-Grenzfläche in Bezug auf die Anzahl der Moleküle und das Gewicht/die Dicke der Schicht zu beschreiben. Damit soll das Konzept der Oberflächenbedeckung von Biomolekülen geklärt und das dynamische Verhalten adsorbierter BSA-Moleküle im Zusammenhang mit der Biodiagnostik untersucht werden.

Materialien und Experimente

Materialien

Rinderserumalbumin als gefriergetrocknetes Pulver (97%) und Natriumchlorid (NaCl)-Salz (99,5%) wurden von Sigma Aldrich (Castle Hill, NSW, Australien) bezogen. Salzsäure (HCl) und Natriumhydroxid (NaOH) wurden von Merck Ltd. gekauft. Alle Chemikalien sind von analytischer Qualität und wurden ohne jegliche Reinigung verwendet.

QCM-D Messungen

Quarzkristall-Mikrowaage mit Dissipationsmessungen wurden mit einem E4-QCM-D Instrument von Biolin Scientific Ltd. durchgeführt. Goldbeschichtete Quarzkristallsensoren wurden nach einer 15-minütigen Reinigung in einer H2O2:NH3:H2O (1:5:5)-Lösung und einer anschließenden 10-minütigen UV-Ozon-Reinigung verwendet.

Die Goldsensoren wurden in Flüssigzellenmodule eingesetzt. 1 mg/ml BSA wurde in der Kochsalzlösung (0,9 % NaCl) gelöst und der pH-Wert der Lösung wurde auf 7,0 und 4,5 eingestellt. Getrennt davon wurde der pH-Wert der Salzlösung auf 7,0 und 4,5 eingestellt. Die vorbereiteten Lösungen wurden mit einer Peristaltikpumpe durch die Flüssigkeitszellenmodule geleitet. Die Änderungen der Resonanzfrequenz (F) und der Dissipation (D) des Quarzsensors in Bezug auf die Grundfrequenz von 5 MHz und sechs verschiedene ungerade Obertöne (1, 3, 5, 7, 9 und 13) wurden gleichzeitig überwacht.

Zunächst wurde eine Kochsalzlösung in die Flüssigkeitszelle gepumpt und zur Erzeugung einer stabilen Basislinie ins Gleichgewicht gebracht. Danach wurde BSA in Kochsalzlösung durch die Zelle geleitet, so dass die BSA-Moleküle an der Goldoberfläche adsorbieren konnten. Anschließend wurde Kochsalzlösung gepumpt, um alle nicht gebundenen BSA-Moleküle zu entfernen. Die Spülzyklen der Kochsalzlösungen mit verschiedenen pH-Werten und Wasser wurden wie folgt durchgeführt:

Die erhaltenen Variationen der Resonanzfrequenz ΔF und der Dissipation ΔD wurden mit dem Sauerbrey-Modell unter Verwendung der Software Dfind angepasst.

DLS-Messungen

Die dynamische Lichtstreuung (DLS) der in der Kochsalzlösung dispergierten BSA bei verschiedenen pH-Werten (4,5 und 7,0) wurde mit einem DLS-Partikelgrößenanalysator (Brookhaven Nanobrook Omni) gemessen. Als Quelle wurde ein temperaturgesteuerter roter Halbleiterlaser mit 40 mW (640 nm) verwendet. Die Messungen wurden dreimal durchgeführt und gemittelt. Alle Messungen wurden bei Raumtemperatur (22°C) durchgeführt.

Kontaktwinkelmessungen

Kontaktwinkel auf Gold und BSA, das bei verschiedenen pH-Werten auf einer Goldoberfläche adsorbiert wurde, wurden mit einem OCA 35 der DataPhysics Instruments GmbH, Deutschland, gemessen. Die Messungen wurden direkt auf der Sensoroberfläche durchgeführt, die nach der Messung aus dem QCM-Setup genommen wurde. Alle Messungen wurden bei Raumtemperatur (22°C) durchgeführt. Es wurden mindestens fünf Kontaktwinkelmessungen auf der Sensoroberfläche durchgeführt und gemittelt.

Atomkraftmikroskop (AFM)

Atomkraftmikroskopische Messungen wurden im Tapping-Modus mit einem JPK Nanowizard III AFM durchgeführt. Die für die Bildgebung ausgewählten Cantilever (AC160TS-R3) hatten eine Nennfrequenz von 300 kHz und eine Federkonstante von 26 N/m. Die Bildgebung wurde an der blanken Goldoberfläche und an der adsorbierten BSA-Schicht bei pH 4,5 an der Goldoberfläche durchgeführt. Die Bilder wurden direkt auf der Sensoroberfläche aufgenommen, die nach der Messung aus dem QCM-Setup genommen wurde. Alle Messungen wurden bei Raumtemperatur (22°C) durchgeführt.

Ergebnisse

Ein reversibles, auf den pH-Wert reagierendes Wasser-Sorptionsphänomen von BSA-Molekülen, die an der Fest-Flüssig-Grenzfläche adsorbiert sind, wurde mittels QCM-D mit Spülzyklen von Kochsalzlösung bei pH 7,0 und 4,5 untersucht. Gold wurde als feste Grenzfläche ausgewählt, da seine Hydrophobie die BSA-Adsorption leitet (Lori und Hanawa, 2004; Phan et al., 2015; Ozboyaci et al., 2016). Die bei unterschiedlichen pH-Werten adsorbierten BSA-Schichten werden abwechselnd mit Kochsalzlösungen bei pH 4,5 und 7,0 gespült. Zusätzlich wurde eine Spülung mit reinem Milli-Q-Wasser durchgeführt, um die Auswirkungen der Ionenstärke auf die adsorbierte BSA-Schicht zu bewerten.

Abbildung 1 (oben) zeigt die Änderung der Frequenz (F5 und F7) für die BSA-Moleküle, die bei einem pH-Wert von 7,0 aus der BSA/Salzlösung adsorbiert wurden, gefolgt von einer Spülung mit der ursprünglichen Salzlösung (pH 7). Der nächste Spülzyklus wurde mit der Kochsalzlösung bei pH 4,5 durchgeführt. Es folgten abwechselnde Zyklen mit Kochsalzlösungen bei pH 4,5 und 7.

In Abbildung 1 wurde nach einer anfänglichen stabilen Grundlinie ein plötzlicher Rückgang von F beobachtet, was auf die Adsorption von BSA-Molekülen an der Gold-Flüssigkeits-Grenzfläche hinweist. Der F-Wert sank bis auf ΔF = -35,5 und stabilisierte sich dann. Nach dem Spülen mit Kochsalzlösung (pH 7) stieg der F-Wert von ΔF = -35,5 auf ΔF = -34,0, was auf die Entfernung der nicht adsorbierten BSA-Moleküle von der Oberfläche hinweist. Nach dem Spülen mit Kochsalzlösung (pH 4,5) stieg der F-Wert weiter auf ΔF = -30,0 an, was auf einen zusätzlichen Massenabbau von der Sensoroberfläche hinweist. Überraschenderweise sank F bei späteren Spülzyklen mit Kochsalzlösung (pH 7,0) auf ΔF = -34,0, was eine Zunahme der Masse an der Sensoroberfläche aufgrund der Absorption von Wassermolekülen in der BSA-Schicht bedeutet. Nachfolgende Spülzyklen mit Kochsalzlösung folgen der gleichen zyklischen Massenänderung an der Goldoberfläche.

Im zweiten Experiment wurden ähnlich wie im ersten Experiment BSA-Moleküle bei einem pH-Wert von 4,5 adsorbiert und anschließend mit Kochsalzlösung bei verschiedenen pH-Werten gespült (Abbildung 1: unten). Die adsorbierten BSA-Moleküle entsprechen der Abnahme von F auf ΔF = -38,5. Durch Spülen mit Kochsalzlösung (pH 4,5) wird die nicht adsorbierte BSA entfernt (ΔF = -38,0).

Nach dem Spülen mit Kochsalzlösung (pH 7,0) nimmt die Masse der Schicht an der Goldoberfläche weiter zu, was dem Rückgang von F auf ΔF = -43 entspricht. Die Zunahme der Masse ist auf die Absorption von Wassermolekülen in der BSA-Schicht zurückzuführen. Später werden durch Spülen mit Kochsalzlösung (pH 4,5) Wassermoleküle desorbiert und der F-Wert sinkt wieder auf ΔF = -37. Bei jedem Spülzyklus wird die gleiche Menge an Wassermolekülen adsorbiert und desorbiert.

Im gleichen Experiment wurde die Wirkung der Ionenstärke auf die adsorbierte BSA-Schicht untersucht, indem die Schicht mit reinem Wasser gespült wurde. Abbildung 1 zeigt die BSA-Adsorption bei pH 7,0 und 4,5, gefolgt von Spülzyklen mit Kochsalzlösung bei verschiedenen pH-Werten und mit reinem Milli-Q-Wasser.

In beiden Fällen erhöht das Spülen mit Wasser den Wert von ΔF = -29,2 (BSA adsorbiert bei pH 4,5) und -26,5 (BSA adsorbiert bei pH 7,0). Dies zeigt, dass das Spülen mit Wasser die Masse weiter verringert, was einer weiteren Desorption von Wassermolekülen von der Grenzfläche entspricht. Bei jedem Spülzyklus bleibt das gleiche Verhalten bei der Massenänderung erhalten, was auf die Wassersorption in der BSA-Schicht zurückzuführen ist.

Interessanterweise zeigen in allen Experimenten abwechselnde Spülzyklen mit Kochsalzlösung bei pH 4,5 und 7,0 die reversible Sorption von Wassermolekülen innerhalb der adsorbierten BSA-Schicht. Beim Spülen der BSA-Schicht mit Kochsalzlösung bei pH 7,0 werden Wassermoleküle innerhalb der BSA-Schichtstruktur adsorbiert, wodurch sich die Masse der Fest-Flüssig-Grenzfläche erhöht. Im Gegensatz dazu werden beim Spülen der BSA-Schicht mit Kochsalzlösung bei einem pH-Wert von 4,5 Wassermoleküle aus der BSA-Schicht desorbiert, wodurch sich die Masse der Grenzfläche verringert. Die gemessene vollständig reversible Wassersorption deutet darauf hin, dass die BSA-Moleküle während des Spülens nicht desorbiert werden und ihre Oberflächenbedeckung identisch bleibt; nur die Anzahl der Wassermoleküle in der Zwischenphase variiert.

Das Phänomen der Wassersorption beim Spülen mit Kochsalzlösung (bei unterschiedlichem pH-Wert) tritt nur aufgrund der adsorbierten BSA-Schicht auf und wird durch ein separates Kochsalzlösungsexperiment mit dem nackten Goldsensor bestätigt (ergänzendes Material S1). Die Kochsalzlösung (mit einem pH-Wert von 4,5) sorgt für eine stabile Grundlinie auf der Frequenz des nackten Goldsensors. Danach wurde die Goldoberfläche mit einem alternativen Kochsalzlösungs-Spülzyklus mit pH 7,0 und 4,5 gespült (Ergänzungsmaterial S1). Die Ergebnisse zeigen deutlich, dass die alternative Kochsalzspülung bei unterschiedlichen pH-Werten keinen Einfluss auf die Goldsensor-Frequenz hat. Daher zeigt nur die adsorbierte BSA-Schicht auf Gold die Änderung der Frequenz bei Kochsalzspülzyklen bei verschiedenen pH-Werten.

Die adsorbierte Masse, die Oberflächenbedeckung und die Dicke der adsorbierten BSA-Schicht werden durch Anpassung des Sauerbrey-Modells an die QCM-Daten extrahiert. Das Modell wird zur Anpassung einer starren Schicht verwendet, bei der der Dissipationswert kleiner als 2 ist, wie in allen unseren Experimenten beobachtet (ergänzendes Material S2). Die Sauerbrey-Gleichung ist gegeben durch Δm=-CΔfn, wobei C = 17,7 ng/Hz.cm2 für den goldbeschichteten 5-MHz-Quarzkristall konstant ist, n der Oberton, Δm die adsorbierte Masse und Δf die Frequenzänderung ist.

Die BSA-Moleküle wurden bis zu einer Massenbedeckung von 6,3 mg/m2 (Dicke 5,6 nm) bei pH 7,0 adsorbiert (Abbildung 2A). Das Spülen der zuvor adsorbierten BSA-Schicht mit Kochsalzlösung (pH 4,5) verringerte die Massenbedeckung auf 5,6 mg/m2 und ihre Dicke auf 4,9 nm (Tabelle 1), was auf die Freisetzung von Wassermolekülen aus der adsorbierten BSA-Schichtstruktur zurückzuführen ist. Bei weiterer Spülung mit Kochsalzlösung (bei pH 7,0) werden erneut Wassermoleküle in gleicher Menge adsorbiert. Die Massenänderungsdifferenz beträgt Δm = 0,7 mg/m2.

Ähnlich wie in Abbildung 2B erhöht das Spülen der voradsorbierten BSA-Schicht bei pH 4,5 mit Kochsalzlösung (bei pH 7,0) die adsorbierte Masse von 6,4 mg/m2 auf 7,4 mg/m2 und die Dicke von 6,2 auf 6,9 nm; dies ist auf die Absorption von Wassermolekülen in der BSA-Schicht zurückzuführen. Der Spülzyklus der Kochsalzlösung bei verschiedenen pH-Werten hielt die Massenänderungsdifferenz von Δm = 1,0 mg/m2 aufrecht, was 1,4-mal höher ist als die Massenänderung bei pH 7,0 (0,7 mg/m2).

Die durchschnittliche Anzahl der in der BSA-Schicht adsorbierten/desorbierten Wassermoleküle während des Kochsalzlösungs-Spülzyklus wird aus der Differenz der adsorbierten Masse bei verschiedenen pH-Werten berechnet (Ergänzungsmaterial S3). Die bei pH 4,5 adsorbierte BSA-Schicht adsorbiert/desorbiert während der Spülzyklen 3,3 × 1019 Wassermoleküle, was 570 Wassermolekülen/BSA-Molekülen entspricht (Tabelle 1). Die bei pH 7,0 adsorbierte BSA-Schicht hingegen adsorbiert/desorbiert 2,3 × 1019 Wassermoleküle bzw. 450 Wassermoleküle/BSA-Molekül während des reversiblen Kochsalzspülzyklus.

Dynamische Lichtstreuungsmessungen (DLS) verdeutlichen den aggregierten und nicht-aggregierten Zustand von BSA in Kochsalzlösung bei pH 4,5 und pH 7,0 (Abbildung 3). Bei pH 4,5 zeigt die DLS, dass die BSA-Moleküle aggregieren und mehrere Größenverteilungen aufweisen: 5 nm, 10 nm, 20 nm und 50 nm. Bei pH 7,0 hingegen aggregieren die BSA-Moleküle aufgrund elektrostatischer Abstoßung nicht und weisen eine Größenverteilung von 5 und 10 nm auf. Die Größe der hydratisierten BSA von 5 und 10 nm ist vergleichbar mit der Größe und Form einzelner BSA-Moleküle (14 nm × 4 nm × 4 nm) (Anderegg et al., 1955; Wright und Thompson, 1975).

Atomkraftmikroskopische Bilder bestätigen die Adsorption von BSA-Molekülen an der Goldoberfläche (Abbildung 4). Diese Bilder zeigen Unterschiede in der Oberflächenmorphologie von blankem Gold (Abbildungen 4a,b) und der an der Goldgrenzfläche adsorbierten BSA bei pH 4,5 (Abbildungen 4c,d). Beim Vergleich der vergrößerten Bilder des nackten Goldes (Abbildung 4b) und der von BSA absorbierten Oberfläche (Abbildung 4d) werden die Unterschiede zwischen den Oberflächen deutlich. Obwohl beide Oberflächen Partikel enthalten, ist die Definition und damit das abgebildete Material unterschiedlich. Die Partikel der blanken Goldoberfläche sind deutlicher definiert (z. B. schärfere Grenzen zwischen den Formen), was im Vergleich zur BSA-beschichteten Oberfläche auf ein härteres Material hinweist. Das mit BSA beschichtete Gold weist zusätzliche Aggregate von BSA-Molekülen auf. Das vergrößerte AFM-Bild von BSA-beschichtetem Gold (Abbildung 4d) zeigt, dass die seitliche Abmessung der aggregierten BSA-Moleküle zwischen 30 und 100 nm variiert und die Höhe im Bereich von 5-15 nm liegt.

Der Kontaktwinkel, der von Wassertropfen auf zwei Oberflächen gebildet wird: Gold und auf Gold adsorbiertes BSA, wurde gemessen, um die Benetzbarkeit zu klären (Abbildung 5). Der Goldsensor ist hydrophil mit einem Kontaktwinkel von 66°. Die BSA-Schicht, die bei einem pH-Wert von 4,5 adsorbiert wird, wird jedoch hydrophiler, da der Wasserkontaktwinkel auf 60° abnimmt, der für die BSA-Schicht, die bei einem pH-Wert von 7,0 adsorbiert wird, weiter auf 55° abnimmt. Eine ähnliche Beobachtung wurde für BSA-Schichten berichtet, die auf einer Siliziumoberfläche adsorbiert wurden, als der Wasserkontaktwinkel von 57° (bei pH 4,5) auf 54° (bei pH 7,0) abnahm (Jachimska et al., 2016). Die Veränderung des Kontaktwinkels und der Schichtdicke für BSA, das bei unterschiedlichen pH-Werten adsorbiert wurde, weisen auf strukturelle und topografische Unterschiede während des Adsorptionsprozesses an der Goldoberfläche hin.

Diskussion

Der isoelektrische Punkt von BSA liegt zwischen pH 4,5 und 4,8; es ist der pH-Wert, bei dem die Nettoladung des Moleküls Null wird. In der Nähe des isoelektrischen Punktes haben die BSA-Moleküle eine geringere elektrostatische Abstoßung zwischen den Molekülen. Die hohe Ionenstärke der Kochsalzlösung (0,15 M) spielt ebenfalls eine Rolle bei der Abschirmung von Ladungen und der Verhinderung elektrostatischer Wechselwirkungen. Daher aggregieren die BSA-Moleküle in der BSA/Salzlösung-Suspension. DLS-Messungen (Abbildung 3A) bestätigen das Vorhandensein von BSA-Aggregaten mit einer Größe von bis zu 60 nm in der BSA/Salzlösung-Suspension bei einem pH-Wert von 4,5.

Während der BSA-Adsorption (bei einem pH-Wert von 4,5) an der Goldoberfläche wird keine elektrostatische Anziehung von BSA zur Goldoberfläche erwartet. Eine schwache positive Ladung des globulären BSA-Proteins kann jedoch eine ausreichende Drift für die Adsorption an einer Grenzfläche bewirken (Su et al., 1998a; Jachimska et al., 2016). In mehreren Artikeln wurde zuvor berichtet, dass die Adsorption von BSA und ähnlichen Proteinen in der Nähe des isoelektrischen Punkts durch hydrophobe Wechselwirkungen angetrieben wird, die die elektrostatischen Wechselwirkungen überwiegen (Uyen et al., 1990; Tilton et al., 1991; Figueira und Jones, 2008; Norde, 2008; Jeyachandran et al., 2009; Rabe et al., 2011; Huang et al., 2017; Xu et al., 2018; Attwood et al., 2019). Die Kontaktwinkelmessungen (Abbildung 5) zeigen, dass die nackte Goldoberfläche weniger hydrophob ist und Albumin über hydrophobe Wechselwirkungen mit Gold bindet (Norde und Giacomelli, 2000; Figueira und Jones, 2008). Da die Abstoßung zwischen den BSA-Molekülen abgeschirmt wird, adsorbieren die hydratisierten BSA-Moleküle in großen Mengen (6,4 mg/m2) als Aggregate und mit mehreren Kontaktpunkten an der Goldoberfläche (Abbildung 6A). Die AFM-Aufnahmen (Abbildungen 4c und d) bestätigen die Adsorption und Aggregation von BSA-Molekülen an der Goldoberfläche. Die AFM-Bilder zeigen, dass die laterale Abmessung der Aggregate zwischen 30 und 100 nm liegt, wobei die Höhe zwischen 5 und 15 nm verteilt ist. Dies bestätigt, dass die BSA-Moleküle in einer Kombination aus stehenden und flachen Konformationen adsorbiert werden.

Bei pH 7,0 sind die BSA-Moleküle negativ geladen. Dadurch entsteht eine elektrostatische Abstoßung zwischen den BSA-Molekülen, die die BSA-Agglomeration in der Lösung behindert. DLS-Messungen zeigen die Verteilung von nicht agglomerierten BSA-Molekülen der Größe 5 und 10 nm (Abbildung 3B). Diese Größen sind vergleichbar mit den Abmessungen einzelner BSA-Moleküle (14 nm × 4 nm × 4 nm) (Anderegg et al., 1955; Wright und Thompson, 1975). Bei der Adsorption von BSA an Gold bildet sich durch eine Kombination aus elektrostatischer Abstoßung und hydrophoben Wechselwirkungen eine BSA-Schicht an der Grenzfläche. Die starke laterale Abstoßung zwischen den adsorbierten BSA-Molekülen verringert die BSA-Adsorptionskapazität (5,6 mg/m2) an der Grenzfläche. Daher adsorbieren die BSA-Moleküle als einzelne Moleküle (nicht als Aggregate) und bilden eine Monoschicht an der Goldgrenzfläche (Abbildung 6A).

In den QCM-D-Experimenten (Abbildung 1) werden vorhydrierte BSA-Moleküle an der Grenzfläche adsorbiert. Beim Spülen mit alternativer Kochsalzlösung bei verschiedenen pH-Werten adsorbiert/desorbiert die BSA-Schicht weitere Wassermoleküle. Die bei pH 4,5 adsorbierte BSA nimmt mehr Wassermoleküle auf und gibt sie ab (1,0 mg/m2) als die bei pH 7,0 adsorbierten BSA-Moleküle (0,7 mg/m2). Der Grund dafür ist, dass die Menge an BSA, die bei pH 4,5 adsorbiert wird (6,4 mg/m2), größer ist als die bei pH 7,0 (5,6 mg/m2).

Die berechnete Trockenmasse (nicht hydratisiert) der BSA-Moleküle, die für eine vollständige Oberflächenbedeckung des Goldsensors adsorbiert werden, beträgt etwa 2 mg/m2 (Ergänzungsmaterial S3). Die berechnete Trockenmasse ist vergleichbar mit den Angaben in der Literatur (Jachimska et al., 2016). Wenn ein trockenes BSA-Molekül hydratisiert wird, binden sich seine hydrophilen Gruppen schnell mit Wasser. Die Bindung ist auf die dipolare Struktur des Wassers zurückzuführen, das mit den polaren Gruppen in BSA interagiert. In hydratisiertem BSA sind einige Wassermoleküle fest gebunden, während andere Wassermoleküle lose gebunden sind oder einfach zwischen der Schleifenstruktur von BSA eingeschlossen sind. Die Menge an Wasser, die die BSA-Schicht hydratisiert, erhöht den Anteil der adsorbierten Masse an der Grenzfläche. In der Kochsalzlösung führt der Spülzyklus bei unterschiedlichen pH-Werten zu einer Umverteilung der Ladungen auf der adsorbierten BSA-Schicht. Diese Ladungsumverteilung schafft einen Gradienten zwischen der adsorbierten BSA-Schicht und der Hauptlösung. Der Gradient wirkt als treibende Kraft, um lose gebundene Wassermoleküle aus der BSA-Schicht einzuschließen und freizusetzen.

Die Dicke der BSA-Schicht wird durch Anpassung des Sauerbrey-Modells an die QCM-D-Daten ermittelt (Abbildung 2). Die hydratisierte BSA-Schicht, die bei pH 4,5 adsorbiert und mit Kochsalzlösung (pH 7,0) gespült wurde, weist eine größere Dicke von 6,9 nm auf (Abbildung 6B). Die große Menge an adsorbierten BSA-Molekülen (6,4 mg/m2) schließt viele Wassermoleküle ein, wodurch die BSA-Schicht aufquillt. Wenn dieselbe Schicht mit Kochsalzlösung (pH 4,5) gespült wird, verringert sich die Schichtdicke auf 6,4 nm, was auf die Freisetzung von Wassermolekülen aus der Schicht zurückzuführen ist. Ein ähnliches Phänomen ist bei den BSA-Molekülen zu beobachten, die bei pH 7,0 adsorbiert werden. Die BSA-Schichtdicke ist jedoch dünner als bei der bei pH 4,5 adsorbierten BSA-Schicht (Abbildung 6B).

Darüber hinaus bleibt die adsorbierte BSA-Schicht bei beiden pH-Werten starr und während der Kochsalzspülzyklen irreversibel gebunden. Nur die Sorption von Wassermolekülen findet während der pH-Variation statt. Die Steifheit und Irreversibilität der adsorbierten BSA ist auf die große Größe und das hohe Molekulargewicht der BSA zurückzuführen. Das BSA-Molekül bildet eine Vielzahl von Kontaktpunkten an der Gold-Flüssigkeits-Grenzfläche durch elektrostatische und hydrophobe Wechselwirkungen, die eine Desorption der BSA-Moleküle von der Grenzfläche verhindern.

Die BSA-Schicht löst sich auch bei Änderungen der Ionenstärke der Lösung (Spülen mit entionisiertem Wasser) nicht von der Goldgrenzfläche ab. Durch das Spülen mit Wasser werden lediglich mehr Wassermoleküle aus der BSA-Schicht desorbiert und die Masse auf der Sensoroberfläche nimmt weiter ab (Abbildung 2). Wenn man die Ionenstärke der hydratisierten BSA mit reinem Wasser ändert, werden mehr Wassermoleküle aus der Schicht freigesetzt. Die BSA-Schicht schrumpft auf eine Dicke von 4,8 nm (bei Adsorption bei pH 4,5) und 4,3 nm (bei Adsorption bei pH 7,0), wie in Abbildung 6B dargestellt. Weitere Spülzyklen mit Kochsalzlösung führen zu demselben reversiblen Phänomen der Wassersorption.

Schlussfolgerung

Rinderserumalbumin in Kochsalzlösung (0,9% NaCl) wurde an der Gold-Flüssigkeits-Grenzfläche bei pH 7,0 und 4,5 adsorbiert. Der dynamische Prozess wurde mittels QCM-D gemessen und durch AFM, DLS und Kontaktwinkelmessungen bestätigt. Ein reversibles, schnelles und pH-abhängiges Wassersorptionsphänomen wird für die adsorbierte BSA-Schicht beobachtet, indem Spülzyklen mit Kochsalzlösung bei pH 4,5 und 7,0 durchgeführt werden. Die Wassermoleküle hydratisieren die BSA-Schicht bei pH 7,0 und dehydratisieren sie bei pH 4,5. Die bei pH 4,5 adsorbierte BSA-Schicht wird von 1,4-mal mehr Wassermolekülen hydratisiert als die bei pH 7,0 adsorbierte BSA-Schicht. Dieses Phänomen lässt sich durch die unterschiedlichen Konformationen der BSA-Moleküle erklären, die bei verschiedenen pH-Werten adsorbiert werden. In der Nähe des isoelektrischen Punktes bei pH 4,5 neutralisieren sich die BSA-Moleküle und adsorbieren als Aggregate in großen Mengen: 6,4 mg/m2. Bei einem pH-Wert von 7,0 laden sich die BSA-Moleküle auf (elektrostatische Abstoßung) und adsorbieren als eine Schicht einzelner Moleküle mit 5,6 mg/m2. Die Schicht aus aggregierten BSA-Molekülen (bei pH 4,5), die an der Goldoberfläche adsorbiert wird, schließt mehr Wassermoleküle ein (570 Wassermoleküle/BSA) als die Schicht aus einzelnen BSA-Molekülen (bei pH 7,0), die 450 Wassermoleküle/BSA zurückhalten. Eine Änderung der Ionenstärke durch Abspülen der BSA-Schicht mit reinem Wasser desorbiert nur mehr Wasser aus der adsorbierten Schichtstruktur. In allen Fällen ist die BSA-Schicht starr und irreversibel an der Goldoberfläche adsorbiert, und nur die Wassermoleküle werden während des Spülvorgangs adsorbiert/desorbiert. Das beobachtete Phänomen ist wichtig für das grundlegende Verständnis und die Entwicklung neuartiger Bio-Diagnosegeräte und robuster Sensoren.

Erklärung zur Datenverfügbarkeit

Die Rohdaten, die die Schlussfolgerungen dieses Artikels untermauern, werden von den Autoren jedem qualifizierten Forscher ohne unangemessene Einschränkung zur Verfügung gestellt.

Beiträge der Autoren

VR, CB und BY führten die Versuche durch. VR und GG führten die Datenanalyse durch und schrieben das Manuskript.

Finanzierung

Diese Arbeit wurde vom Australian Research Council (ARC), Australian Paper, Norske Skog, Orora und Visy durch den Industry Transformation Research Hub grant IH170100020 unterstützt.

Interessenkonflikt

Die Autoren erklären, dass die Forschung in Abwesenheit jeglicher kommerzieller oder finanzieller Beziehungen durchgeführt wurde, die als potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten.

Zusatzmaterial